一种基于CAR技术的CART-20细胞扩增培养方法

摘要

本发明公开了一种基于CAR技术的CART‑20细胞扩增培养方法，包括采集外周血样本、分选T细胞、配置诱导培养基、扩增T细胞、制备CAR‑T细胞、制备CAR‑T20细胞。进行拼接的抗体所识别的肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原，避免所制备的CAR‑T细胞识别了患者正常组织低表达的自身抗原而引起相关毒性；CAR‑T细胞的第一信号由MHC抗原肽和TCR结合后提供；CAR‑T细胞的第二信号为抗原呈细胞提供的协同刺激信号，帮助T细胞与特异性抗原产生最佳反应。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞扩增培养方法，具体为一种基于CAR技术的CART-20细胞扩增培养方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

嵌合抗原受体技术是近20年来肿瘤免疫治疗领域兴起的一项新的生物技术。其基本原理是通过基因工程技术将识别某抗原分子的抗体可变区基因序列与淋巴细胞免疫受体的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接mRNA转导到淋巴细胞内，并表达融合蛋白于细胞表面，使淋巴细胞能通过非MHC限制性的方式识别特定抗原，增强其识别和杀伤肿瘤的能力。其突出特点是高度特异性、非组织相容性抗原（MHC）限制性及强烈而持久的杀瘤效应。近年来该技术不断发展，临床试验取得了令人瞩目的疗效。

嵌合性抗原受体主要由细胞膜外抗原结合区、细胞内信号转导区和跨膜区三部分构成。膜外结合区具有特异性识别并结合肿瘤细胞表面抗原的功能，其构成是将单克隆抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）用一可弯曲的多肽接头连接起来，构建成由单链可变区结构域（single chain variable fragment，scFv）组成的抗原结合区，其形式为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。细胞内信号转导区主要是T细胞受体的CD3ζ链，而跨膜区可来源于同一分子或为1型跨膜蛋白，如CD4、CD8或CD28等。通过CAR与靶细胞结合后，胞内信号转导区将信号传入T细胞，从而激活T细胞，分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、INF-γ、TNF-a等发挥杀伤作用。

在机体肿瘤免疫过程汇总对肿瘤起杀伤作用的主要是T细胞，但T细胞需要APC、细胞因子协助才能发挥作用，这种繁琐的机制势必造成抗肿瘤低效，为解决这一问题，CAR-T成为新的肿瘤治疗手段孕育而生，基于此，本申请提出一种基于CAR技术的CART-20细胞扩增培养方法。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决问题而提供一种基于CAR技术的CART-20细胞扩增培养方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种基于CAR技术的CART-20细胞扩增培养方法，包括以下步骤：

步骤一、采集外周血样本，筛选体检合格的供者，由医护人员在供者手肘部静脉血管上穿刺，通过管道把血引流到血细胞分离机中，通过离心的方法对造血干细胞进行富集，其余的血液成份回输供者体内，并将采集到的样本保存备用；

步骤二、分选T细胞，将上述采集的外周血进行离心分离，除去上清，下层液体中加入PBS缓冲液，混匀后缓慢加入淋巴分离液，采用含抗CD4和CD8抗体的磁珠进行分选，以获得T细胞；

步骤三、配置诱导培养基，在DEM/F12培养基添加酵母提取物和大豆水解物，配制无血清无蛋白培养基；

步骤四、扩增T细胞，将所获得的T细胞置于培养皿中，加入所配置的无血清无蛋白培养基进行激活培养，以得到初代扩增的T细胞，再将初代诱导扩增的T细胞分置于多个培养皿中，再次添加无血清无蛋白培养基进行培养，即可得到扩增培养的T细胞；

步骤五、制备CAR-T细胞，通过基因工程技术将识别肿瘤抗原分子的抗体可变区基因序列与淋巴细胞免疫受体的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接mRNA转导到淋巴细胞内，并表达融合蛋白于细胞表面，形成CAR-T细胞；

步骤六、制备CAR-T20细胞，在CAR-T细胞培养体系中加上刺激分子CD20，分别激活CAR-T细胞的第一信号和第二信号，诱导 T 细胞活化，形成CAR-T20细胞。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，对外周血进行离心分离时，离心操作为1500rpm离心五分钟。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，T细胞扩增时添加有GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-6、INF-α、IFN和TGF-β等生长因子。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，进行拼接的抗体所识别的肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，CAR-T细胞的第一信号由MHC抗原肽和TCR结合后提供；CAR-T细胞的第二信号为抗原呈细胞提供的协同刺激信号。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，CAR-T细胞的共刺激信号域协同共刺激信号分子CD20与CD3ζ链的细胞内区顺式组成胞内信号转导区。

本发明的有益效果是：该基于CAR技术的CART-20细胞扩增培养方法设计合理，进行拼接的抗体所识别的肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原，这种抗原具有在肿瘤细胞表面过表达或高表达，而在正常组织不表达或低表达，避免所制备的CAR-T细胞识别了患者正常组织低表达的自身抗原而引起相关毒性；CAR-T细胞的第一信号由MHC抗原肽和TCR结合后提供；CAR-T细胞的第二信号为抗原呈细胞提供的协同刺激信号，帮助T细胞与特异性抗原产生最佳反应；CAR-T细胞的共刺激信号域协同共刺激信号分子CD20与CD3ζ链的细胞内区顺式组成胞内信号转导区，使表达嵌合性抗原受体的T细胞与肿瘤表面抗原结合时更充分激活及免疫应答而杀伤肿瘤细胞T细胞。

附图说明

图1为本发明流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种基于CAR技术的CART-20细胞扩增培养方法，包括以下步骤：

步骤一、采集外周血样本，筛选体检合格的供者，由医护人员在供者手肘部静脉血管上穿刺，通过管道把血引流到血细胞分离机中，通过离心的方法对造血干细胞进行富集，其余的血液成份回输供者体内，并将采集到的样本保存备用；

步骤二、分选T细胞，将上述采集的外周血进行离心分离，除去上清，下层液体中加入PBS缓冲液，混匀后缓慢加入淋巴分离液，采用含抗CD4和CD8抗体的磁珠进行分选，以获得T细胞；

步骤三、配置诱导培养基，在DEM/F12培养基添加酵母提取物和大豆水解物，配制无血清无蛋白培养基；

步骤四、扩增T细胞，将所获得的T细胞置于培养皿中，加入所配置的无血清无蛋白培养基进行激活培养，以得到初代扩增的T细胞，再将初代诱导扩增的T细胞分置于多个培养皿中，再次添加无血清无蛋白培养基进行培养，即可得到扩增培养的T细胞；

步骤五、制备CAR-T细胞，通过基因工程技术将识别肿瘤抗原分子的抗体可变区基因序列与淋巴细胞免疫受体的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接mRNA转导到淋巴细胞内，并表达融合蛋白于细胞表面，形成CAR-T细胞；

步骤六、制备CAR-T20细胞，在CAR-T细胞培养体系中加上刺激分子CD20，分别激活CAR-T细胞的第一信号和第二信号，诱导 T 细胞活化，形成CAR-T20细胞。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，对外周血进行离心分离时，离心操作为1500rpm离心五分钟。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，T细胞扩增时添加有GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-6、INF-α、IFN和TGF-β等生长因子。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，进行拼接的抗体所识别的肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原，这种抗原具有在肿瘤细胞表面过表达或高表达，而在正常组织不表达或低表达，避免所制备的CAR-T细胞识别了患者正常组织低表达的自身抗原而引起相关毒性。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六中，CAR-T细胞的第一信号由MHC抗原肽和TCR结合后提供；CAR-T细胞的第二信号为抗原呈细胞提供的协同刺激信号，帮助T细胞与特异性抗原产生最佳反应。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六中，CAR-T细胞的共刺激信号域协同共刺激信号分子CD20与CD3ζ链的细胞内区顺式组成胞内信号转导区，使表达嵌合性抗原受体的T细胞与肿瘤表面抗原结合时更充分激活及免疫应答而杀伤肿瘤细胞T细胞。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。