伪狂犬病毒FJ-2012株gE/gI基因缺失株灭活疫苗的制备及应用

摘要

本发明涉及一种伪狂犬病毒FJ‑2012株gE/I基因缺失株，所述基因缺失株命名为伪狂犬病病毒FJ‑2012ΔgE/gI株，保藏编号为CCTCC NO:V202025。本发明采用伪狂犬病毒新发变异FJ‑2012株的gE/gI基因缺失株作为疫苗种子毒，经扩大培养以甲醛灭活后与不同佐剂制成灭活疫苗免疫绵羊，免疫4周后经亲本强毒株FJ‑2012株攻击，灭活疫苗对免疫绵羊提供了完全的免疫保护作用，并且适合目前通用的gE ELISA鉴别诊断试剂盒进行鉴别诊断野毒感染或疫苗免疫。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株伪狂犬病毒FJ-2012株gE/gI基因缺失株灭活疫苗的制备及应用。

背景技术

伪狂犬病（Pseudorabies, PR），又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s Disease, AD），是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、水痘疱疹病毒属，能够感染猪、牛、羊、小鼠、家兔、猫、犬等多种动物，猪是PRV感染后可以存活的唯一物种，因此也是该病毒的贮存宿主。周圣文与洪尚文分别在上世纪五、六十年代报道在我国哺乳猪中发生猪伪狂犬病，但在20世纪90年代PR在我国第一次大规模爆发，表现为经典PR症状，母猪流产及仔猪神经症状；PR在我国第二次暴发于21世纪初，呈现大规模爆发，表现为“流产风暴”，但20世纪90年代以来，规模化猪场普遍使用Barthak-61疫苗株，得到很好控制；2011年10月以来，以高密度PRV免疫猪场野毒阳性率高并伴有成年种猪及育肥猪突然死亡，PR在我国呈现第三次爆发，并且席卷全国，快速的传播到中国其他省市，对中国养猪业造成了严重的影响，经我国多个研究团队的病原学研究证明为新发变异PRV导致。

gE是PRV重要的毒力基因之一，缺少gE的PRV只能局限性神经感染，对神经系统的侵入能力降低，并且gE是PRV在检测中首选的标志性基因，针对gE抗体的血清学检测方法已经非常成熟，是经典的区分野毒感染或疫苗免疫的血清学方法。部分欧美国家对该病投入巨大的人力、物力及财力，通过gE-ELISA鉴别诊断技术已经在家猪净化和消灭了该病。多年来，我国普遍采用gE缺失的弱毒活苗免疫接种、野毒监测和净化等技术，该病也得到有效控制，其发病和流行情况趋于稳定，但是从2011年10月开始，我国大部分地区先后在Bartha-K61免疫的规模化猪场再次出现伪狂犬病暴发和流行，在2011年以后分离的变异PRV对于85日龄的育肥猪也具有致死性，其主要特点为：(i) 免疫过Bartha-K61 疫苗的怀孕母猪发生高流产率；(ii) 生长猪出现中枢神经系统紊乱并且高死亡率；(iii) 血清高gE阳性率。2011年以后分离的所有新发变异超强PRV毒株，与欧洲和美洲毒株或2000年以前分离的中国传统株相比，在基因组序列上具有明显的变异。近年来从我国不同地区分离了大量的新发PRV毒株，包括HNX, ZJ01, HeN1, SMX, TJ, JS, HNB、HN1201、FJ-2012等，而现有疫苗对新发变异毒株不能提供很好的保护，亟需以新发变异的PRV超强毒株开发新的PR疫苗，以更好的控制和预防PR。

因此，开发可对新发变异PRV的感染具有安全、有效，且具备鉴别诊断的新疫苗是十分有必要的。本发明采用伪狂犬病毒新发变异FJ-2012株的gE/gI基因缺失株作为疫苗种子毒，经扩大培养以甲醛灭活后与不同佐剂制成灭活疫苗免疫绵羊，免疫4周后经亲本强毒株FJ-2012株攻击，灭活疫苗对免疫绵羊提供了完全的免疫保护作用，并且适合目前通用的gE ELISA鉴别诊断试剂盒进行鉴别诊断野毒感染或疫苗免疫，因此FJ-2012 gE/gI基因缺失株适合作为预防新发变异PRV超强毒株感染的灭活疫苗候选种毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一株伪狂犬病毒FJ-2012株gE/gI基因缺失株灭活疫苗的制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种伪狂犬病毒FJ-2012株gE/I基因缺失株，所述基因缺失株命名为伪狂犬病病毒FJ-2012ΔgE/gI株，已于2020年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202025，中国典型培养物保藏中心地址为中国武汉，武汉大学。

上述伪狂犬病毒FJ-2012株gE/I基因缺失株的制备方法包括以下步骤：

（1）将FJ-2012株的gE/I缺失位置的上下游同源片段依次插入到质粒pUC19构建pUC19:H1:H2，再插入EGFP表达盒，构建同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:H2，再将BAC序列引入到pUC19:H1:EGFP:H2，形成可构建PRV人工染色体的同源重组转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2；

（2）提取FJ-2012株的感染性基因组DNA，与转移质粒pUC19:H1:EGFP:BAC:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选含有荧光标记的gE/I基因缺失的重组病毒rPRV FJ-2012-ΔgE/gI:EGFP

（3）提取上述重组病毒的感染性基因组，与转移质粒pUC19:H1:H2共转染细胞，通过噬斑纯化技术筛选到gE/I基因缺失、不含有EGFP和BAC序列的无痕重组病毒rPRV FJ-2012-ΔgE/gI，见图2。

所述上下游同源片段H1和H2的序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述EGFP表达盒序列如SEQ ID NO.3所示，所述BAC序列如SEQ ID NO.4所示。

所述PRV gE/gI基因缺失及缺失毒株鉴定引物序列及其酶切位点如表1所示，所述EGFP表达盒扩增及其EGFP和BAC鉴定引物序列及其酶切位点如表2所示。

表1. PRV gE/gI基因缺失及缺失毒株鉴定引物序列及其酶切位点

表2. EGFP表达盒扩增及其EGFP和BAC鉴定引物序列及其酶切位点

一种利用上述基因缺失株制备伪狂犬病毒FJ-2012株gE/gI基因缺失株灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

（1）病毒增殖；（2）抗原灭活；（3）制备灭活疫苗。

所述灭活疫苗包括水相佐剂疫苗、油佐剂疫苗。

进一步，利用上述方法制备获得伪狂犬病毒FJ-2012株gE/gI基因缺失株灭活疫苗。

本发明的优点在于：

本发明采用伪狂犬病毒新发变异FJ-2012株的gE/gI基因缺失株作为疫苗种子毒，经扩大培养以甲醛灭活后与不同佐剂制成灭活疫苗免疫绵羊，免疫4周后经亲本强毒株FJ-2012株攻击，灭活疫苗对免疫绵羊提供了完全的免疫保护作用，并且适合目前通用的gEELISA鉴别诊断试剂盒进行鉴别诊断野毒感染或疫苗免疫。

附图说明

图1. pUC19:H1:EGFP:BAC:H2与PRV FJ-2012毒株感染性DNA共转染BHK-21细胞后形成的带有EGFP序列的rPRV:EGFP

图2. pUC19:H1:H2与rFJ-2012-ΔgE/gI:EGFP:BAC毒株的感染性DNA共转染BHK-21细胞后形成的删除EGFP:BAC序列的rPRV FJ-2012-ΔgE/gI重组病毒，左图为明场下的病毒细胞病变，右图为在荧光场下的重组病毒（显示无荧光）。

具体实施方式

实施例1 伪狂犬病毒FJ-2012株gE/I基因缺失株灭活疫苗的制备

1.1 病毒增殖与灭活

病毒增殖：采用静置培养的方式，对伪狂犬病毒FJ-2012株gE/I基因缺失株（命名为伪狂犬病病毒FJ-2012ΔgE/gI株，已于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202025），在方瓶中采用BHK-21细胞进行病毒大量增殖，增殖后冻融3次，15000rpm 4℃下高速离心30min除去细胞碎片，收集上清作为灭活前抗原备用，并10倍系列稀释后在BHK-21细胞测定TCID

抗原灭活：在上述备用抗原病毒液中缓慢加入适量10%的甲醛，使甲醛终浓度为0.1%，摇匀后全部转移到一个新的无菌三角瓶中，在37℃条件下灭活36h，灭活过程中不断振荡200rpm，使灭活完全。灭活结束后，取灭活后病毒液5ml，分别接种5瓶长满单层的BHK-21细胞（25cm

1.2 灭活疫苗的制备

将检测灭活完全的病毒液，使用赛彼科公司生产的水相佐剂GEL02，以及自制的白油佐剂按照使用方法进行疫苗配制，配制完成后，分装，对分装的疫苗外观和质量进行检测，均符合要求，在实验室基本完成了疫苗的生产工艺大体流程和实验室产品的试制工作，拟开展灭活疫苗的有效性和安全性研究。

1.2.1 水相佐剂（GEL02）疫苗的制备

准备适量的佐剂GEL02（75ml）和灭活的水相抗原（425ml），将盛放水相抗原的烧杯置于搅拌器下，搅拌速度200rpm，向水相抗原中加入佐剂相，200rpm搅拌10min后，20℃静置过夜，QC检查，疫苗置于玻璃瓶中，分别储存在3个温度（4℃、20℃、37℃）下，进行稳定性观察。疫苗制备时需确保3个关键点，分别为低剪切、搅拌时间充分、确保乳液均匀。

1.2.2 油佐剂（白油）疫苗的制备

油相制备：添加60 mlSpan到600 ml白油中，在60℃条件下充分搅匀；0.2微米的PTFE滤膜过滤或115℃高压灭菌15min。

水相制备：将5 ml的Tween-80缓慢加入到160ml灭活后的病毒液中，搅拌，使Tween-80充分溶解并混匀。

乳化：含368ml的油相烧杯转移到乳化机下，调整乳化机转速11000 rpm，混合油相15 s，渐渐的将上述水相抗原加入到油相中，乳化机在＜25℃下，进行乳化。经检查制备好的乳化液外观为乳白色的乳剂，取一洁净吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散；取3-5ml乳化后样品在20℃下，1570g离心15min无明显分层。在37℃左右条件下放置21日不破乳。

实施例2 PRV FJ-2012ΔgE/gI株灭活疫苗的有效性试验

2.1 试验动物及分组和处理

15-20kg的湖羊20头，分4组，每组5头。使用GEL02佐剂和白油佐剂制备的PRV FJ-2012ΔgE/gI株灭活疫苗免疫绵羊，免疫方式为颈部皮下免疫疫苗5ml，免疫4周后用PRVFJ-2012强毒株攻毒，剂量为1ml/头，含病毒10

表1. 试验动物分组及处理

2.2结果

强毒FJ-2012株攻毒后第四天， G3组5只绵羊出现卧地划水样、撕咬后肢、口吐白沫、精神沉郁、喜卧，并有2只绵羊于当天死亡。G1、G2、G4组未出现明显临床症状。

攻毒后第五天，G3组3只绵羊均表现为四肢划水样、倒地不起、口吐白沫，3只绵羊均于当天死亡。G1、G3、G4组未出现明显临床症状。

攻毒后第六至十四天，G1、G3、G4组未出现明显临床症状。具体发病及死亡结果见表2。

表2.不同佐剂疫苗免疫对PRV FJ-2012强毒株攻毒的保护率

将免疫前和免疫4周后采集的免疫血清进行ELISA检测，免疫前G1、G2、G3、G4组gB及gE抗体均为阴性，显示无PRV感染。免疫4周后ELISA结果显示G1、G2组羊的gB抗体全部为阳性（表3），gE抗体全部为阴性（表3），表明以两种不同佐剂制备的FJ-2012ΔgE/gI株灭活疫苗的接种效果良好，能够适用于目前通用的商品化gE鉴别诊断ELISA试剂盒。

表3 PRV FJ-2012ΔgE/gI株不同佐剂灭活疫苗免疫绵羊28 d后ELISA测定血清gB和gE抗体结果

§PRV gE ELISA S/N＜0.60 = Positive; PRV gE ELISA S/N＞0.60 and≤0.70= Suspect; PRV gE ELISA S/N＞0.70 = Negative.

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 伪狂犬病毒FJ-2012株gE/gI基因缺失株灭活疫苗的制备及应用

<130> 15

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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cgagtacgcc gactgcgacc ccaggcagat ctttgggcgc tgccggcgcc gcaccacgcc 300

gatgtggtgg accccgtccg cggactacat gttccccacg gaggacgagc tggggctgct 360

catggtggcc ccggggcggt tcaacgaggg ccagtaccgg cgcctggtgt ccgtcgacgg 420

cgtgaacatc ctcaccgact tcatggtggc gctccccgag gggcaagagt gcccgttcgc 480

ccgcgtggac cagcaccgca cgtacaagtt cggcgcgtgc tggagcgacg acagcttcaa 540

gcggggcgtg gacgtgatgc gattcctgac gccgttctac cagcagcccc cgcaccggga 600

ggtggtgaac tactggtacc gcaagaacgg ccggacgctc ccgcgggcct acgccgccgc 660

cacgccgtac gccatcgacc ccgcgcggcc ctcggcgggc tcgccgaggc ccaggcccca 720

gccccggccc aggccccggc cgaagcccga gcccgccccg gcgacgcccg cgccccccgg 780

ccgcctgccc gagccggcga cgcgggacca cgccgccggg gggcgcccca cgccgcgacc 840

cccgaggccc gagacgccgc accgcccctt cgccccgccg gccgtcgtgc ccagcgggtg 900

gccgcagccc gcggagccgt tcccgccccg gaccaccgcc gcgccgggcg tctcgcgcca 960

ccgctcggtg atcgtcggca cgggcaccgc gatgggcgcg ctcctggtgg gcgtgtgcgt 1020

ctacatcttc ttccgcctga ggggggcgaa ggggtatcgc ctcctgggcg gtcccgcgga 1080

cgccgacgag ctaaaagcgc agcccggtcc gtagcctccg cagtaccggc gtcgatgatg 1140

a 1141

<210> 2

<211> 2264

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggacacgttc gacctgatgc cgcgcgtggt ctcggacatg ggcgactcgc gcgagaactt 60

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cgacgacgcg atctacgtgg acggcgtcac gacgccggcg ccgcccgcgc gcccgtggaa 540

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ctcgcggccg ttccgggtgc cgacgcgggc gcggacgcac atgctctctc cggtgtacac 720

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ggacacgttt gaccccagcg cccccgtccc gacgagcgtc tcgaacccgg ccgccgacgt 1140

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ctacagcgag agcgacaacg agacgcccag cgagttcctg cgccgcgtgg gacgccggca 1260

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cacccccgcg gctggacacg gagtggtcgt ccgtcctgaa cgggatccag tacctgaact 2040

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<210> 3

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<213> 人工序列

<400> 3

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gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

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cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 900

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ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg agtattctat agtgtcacct aaatagcttg 420

gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 480

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cttcccggta tcaacaggga caccaggatt tatttattct gcgaagtgat cttccgtcac 1620

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tgggacataa gtccatcagt tcaacggaag tctacacgaa ggtttttgcg ctggatgtgg 1920

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aattatcctg agaataaatg ccttggcctt tatatggaaa tgtggaactg agtggatatg 2040

ctgtttttgt ctgttaaaca gagaagctgg ctgttatcca ctgagaagcg aacgaaacag 2100

tcgggaaaat ctcccattat cgtagagatc cgcattatta atctcaggag cctgtgtagc 2160

gtttatagga agtagtgttc tgtcatgatg cctgcaagcg gtaacgaaaa cgatttgaat 2220

atgccttcag gaacaataga aatcttcgtg cggtgttacg ttgaagtgga gcggattatg 2280

tcagcaatgg acagaacaac ctaatgaaca cagaaccatg atgtggtctg tccttttaca 2340

gccagtagtg ctcgccgcag tcgagcgaca gggcgaagcc ctcgagtgag cgaggaagca 2400

ccagggaaca gcacttatat attctgctta cacacgatgc ctgaaaaaac ttcccttggg 2460

gttatccact tatccacggg gatattttta taattatttt ttttatagtt tttagatctt 2520

cttttttaga gcgccttgta ggcctttatc catgctggtt ctagagaagg tgttgtgaca 2580

aattgccctt tcagtgtgac aaatcaccct caaatgacag tcctgtctgt gacaaattgc 2640

ccttaaccct gtgacaaatt gccctcagaa gaagctgttt tttcacaaag ttatccctgc 2700

ttattgactc ttttttattt agtgtgacaa tctaaaaact tgtcacactt cacatggatc 2760

tgtcatggcg gaaacagcgg ttatcaatca caagaaacgt aaaaatagcc cgcgaatcgt 2820

ccagtcaaac gacctcactg aggcggcata tagtctctcc cgggatcaaa aacgtatgct 2880

gtatctgttc gttgaccaga tcagaaaatc tgatggcacc ctacaggaac atgacggtat 2940

ctgcgagatc catgttgcta aatatgctga aatattcgga ttgacctctg cggaagccag 3000

taaggatata cggcaggcat tgaagagttt cgcggggaag gaagtggttt tttatcgccc 3060

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attcgaggac gggttgagca acgtgttggt tatacaattg aacaaattaa tcatatgcgt 4380

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ttcgtcataa cttaatgttt ttatttaaaa taccctctga aaagaaagga aacgacaggt 7380

gctgaaagcg agctttttgg cctctgtcgt ttcctttctc tgtttttgtc cgtggaatga 7440

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