伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株的构建及其灭活疫苗的免疫效力评价

摘要

伪狂犬病毒（ Pseudorabies Virus， PRV）是疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alpha-herpesviridae）的成员，可使猪、牛、羊等多种家畜及野生动物感染发病，其中猪感染后可引起新生仔猪的大量死亡、母猪繁殖障碍及育肥猪的呼吸系统疾病等，对猪群的危害巨大。我国从上世纪90年代开始陆续在规模化猪场广泛使用 PRV基因缺失疫苗，并取得了良好的防控效果。但从2011年末开始，在一些已免疫过伪狂犬病疫苗的猪场又陆续爆发了新疫情。对 PRV流行毒株的研究表明，现有 Bartha株疫苗已不能对猪群提供完全保护，因此，有必要研制针对 PRV流行毒株的基因缺失疫苗，以控制当前伪狂犬病的流行。本文以前期分离到的PRV流行毒株 AH株为亲本毒株和已构建好的转移载体，采用同源重组方法构建PRV AH gI-/gE-基因缺失突变株，并将其制备成灭活疫苗，检测其对小鼠的免疫保护效力。
　　本研究主要内容包括：⑴将已构建的转移载体pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，然后接种PRV AH株，使质粒与病毒基因组在细胞内发生同源重组，通过蚀斑纯化法进行筛选，获得缺失gI、gE基因，同时携带 EGFP荧光标记基因的重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+；为了去除重组病毒中的EGFP基因，将转移载体pMD-LA-RA与重组病毒 rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+按照上述方法，在 BHK-21细胞上进行同源重组，用优化改进后的蚀斑纯化方法进行筛选，最终获得 gI、gE基因缺失的突变株P RV AH gI-/gE-。通过对小鼠的致病性试验，测定了该基因缺失株的LD50为104.3TCID50。⑵将PRVAHgI-/gE-基因缺失株经β-丙内酯灭活后，与Monta nide Ge l按9:1比例混合制备成灭活疫苗，以105.0TCID50、106.0TCID50分别免疫小鼠2次，间隔4周，免疫后不同时间采血，检测血清中和抗体水平，二免后4周用100LD50 PRV AH株和经典毒株对免疫小鼠进行攻毒。结果表明，105.0TCID50、106.0TCID50 PRV AH gI-/gE-免疫组血清中和抗体水平最高可达8.96±4.35、19.13±13.08，其中106.0TCID50免疫组对 PRV AH株和经典毒株的攻毒保护率均为100%（8/8），能完全抵抗P RV AH株和经典毒株的攻击。⑶以PRVAH流行株为亲本株，采用同源重组技术成功获得了gI/gE基因缺失突变株PRV AH gI-/gE-，并将其制成灭活疫苗。动物实验结果表明， PRVAHgI-/gE-具有良好的免疫原性，且对PRV经典毒株和流行毒株均有良好的免疫保护效果，有望作为一种新的疫苗候选毒株用于PRV流行株的防控。

目录

声明

本论文常用英文缩写词

1 前言

1. 1 伪狂犬病概述

1. 2 伪狂犬病的发展历史

1. 3 伪狂犬病的临床症状

1. 4 伪狂犬病的流行现状

1. 5 病原学

1. 6 伪狂犬病毒的培养特性

1. 7 伪狂犬病毒gE、gI基因的研究

1. 8伪狂犬病的诊断方法

1. 9 伪狂犬病的防控

1. 10伪狂犬病免疫失败的原因

1. 11伪狂犬病毒基因缺失疫苗

1. 12研究目的和意义

2材料与方法

2. 1材料

2. 2 方法

3 结果与分析

3.1转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的双酶切鉴定

3. 2 转移质粒p MD-LA-R A的双酶切鉴定

3.3 重组病毒rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+的纯化与鉴定

3. 4 重组病毒PR V AH gI-/gE-的纯化与鉴定

3. 5 病毒一步生长曲线的绘制

3.6 病毒LD50的测定

3.7 重组病毒PRV AH gI-/gE-灭活疫苗的制备

3. 8 灭活疫苗的免疫效果评价

4. 1 讨论

4. 2 结论

致谢

参考文献

附录：重组病毒PRV AH gI-/gE-与PRV ZJ01株基因序列比对结果