一种杜仲叶及其提取物HPLC特征图谱建立方法

摘要

本发明公开了一种杜仲叶及其提取物HPLC特征图谱建立方法及其指纹图谱，该方法包括：步骤1供试品溶液的制备；步骤2对照品溶液的制备；步骤3色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，进行梯度洗脱；检测波长206nm；柱温：10‑30℃；流速：1.0ml.min‑1；进样量：10μl；步骤4测定，得到紫灯片的指纹图谱。本发明还对该指纹图谱的建立方法进行了方法学验证。本发明测定的杜仲叶及其提取物特征图谱，精密度高，稳定性好，重复性好，能够有效地控制杜仲叶及其提取物的质量，确保杜仲叶、提取物及其相关产品质量的均一稳定、安全有效。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材及其提取物质量控制方法，具体涉及一种用高效液相色谱法对杜仲叶及其提取物特征图谱的建立方法，以及由此方法得到的杜仲叶及其提取物特征图谱。

背景技术

杜仲叶为杜仲科植物杜仲的干燥叶，为《中国药典》标准收载。主要活性成分包括黄酮类、环烯醚萜类、苯丙素类、木脂素类、多糖类，杜仲叶微辛、温，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、降血压的功效，主治肝肾不足，腰膝酸软，筋骨痿弱等症。杜仲叶中含有丰富的营养物质，包括VB1、VE、β-胡萝卜素，17种游离氨基酸，锗、硒等15种微量元素。杜仲叶中的粗蛋白质含量高于玉米、谷、高粱和薯类，与大麦、小麦等相当。杜仲叶中含有质量分数为1.59％的亚油酸和45.85％的亚麻酸这两种人体必需的脂肪酸。杜仲叶现在已被广泛应用于医药、功能饮料、保健食品、功能饲料等领域中，并且取得了良好的效果。

中药特征图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标识其中各种组分群特征的共有峰的图谱，是一种新的中药质量控制模式。中药特征图谱可全面反映中药所含有内在化学成分的种类，进而反映中药的质量，尤其是在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药特征图谱的方式，将有效地表征中药质量。中药特征图谱在中药材及其提取物和制剂的整体质量控制方面的优势已获得业界人士的广泛认可，国际上也多采用特征图谱对植物药及其产品进行质量控制。

建立杜仲叶及其提取物的特征图谱，对于杜仲叶药材的产品开发、质量控制，以及用药安全将具有重要意义。

目前，以特征图谱控制杜仲叶及其提取物的质量，尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种杜仲叶及其提取物HPLC特征图谱的建立方法。其步骤是将杜仲叶及其提取物制备成供试品溶液，经高效液相色谱法对杜仲叶及其提取物进行分析检测，获得杜仲叶及其提取物HPLC特征图谱，从而为杜仲叶及其提取物的内在质量评价提供有力支撑依据。

本发明提供了一种杜仲叶HPLC特征图谱的建立方法，包括以下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：精密称取样品粉末0.1-0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入20-100％甲醇25-100ml，称重，超声处理0.2-1小时，取出，放冷，再称定重量，用20-100％甲醇补足减失的重量，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液；

步骤2、对照品溶液的制备：取绿原酸对照品5-15mg，分别置50ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照品溶液；

步骤3、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，进行梯度洗脱；检测波长206nm；柱温：10-30℃；流速：1.0ml.min

前述方法的梯度洗脱程序的体积比浓度为：

洗脱时间 流动相A的比例 流动相B的比例

0～28min 5→12 95→88

28～50min 12→20 88→80

50～51min 20→50 80→50

51～57min 50 50

57～57.01min 50→55 0→95

57.01～63min 5 95

步骤4、测定：精密吸取供试品溶液10～20μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到杜仲叶及其提取物的特征图谱。

本发明步骤1中供试品溶液的制备：精密称取样品粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称重，超声处理40分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

本发明步骤2中对照品溶液的制备：取绿原酸对照品，置50ml容量瓶中，加甲醇制成每1ml含有绿原酸50μg的溶液，即得对照品溶液；

本发明步骤3中色谱条件：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长：206nm；柱温：25℃；流速：1.0ml.min

本发明步骤4中测定：精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到杜仲叶及其提取物的特征图谱。

方法学验证

1、单标确证

分别精密称取芦丁对照品9.0mg，异槲皮苷对照品8.0mg，置10ml量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取上述对照品溶液1ml、1ml，分别精密称取桃叶珊瑚苷对照品2.656mg，京尼平苷酸10.0mg，绿原酸8.0mg，置同一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。另，分别称取桃叶珊瑚苷5.0mg、京尼平苷酸5.0mg、绿原酸5.0mg，分别配制成0.2mg/ml的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按本发明步骤3中色谱条件测定。

根据结果，比较混合对照品与单独对照品色谱，可确定混合对照品色谱图中各色谱峰按照保留时间先后分别是：桃叶珊瑚苷(5.505min)、京尼平苷酸(9.67min)、绿原酸(21.743min)、芦丁(45.767min)、异槲皮苷(47.454min)。

特征图谱建立

分别精密吸取空白溶剂，混合对照品溶液及供试品溶液各10μL注入高效液相色谱仪,分别按步骤4色谱条件测定，并记录52min内的色谱图,即得。

共有峰的确定:测定了10个杜仲叶样品、10个杜仲叶提取物样品。在20份样品的图谱中,其相对保留时间及色谱峰较稳定的峰有7个,确定共有峰为1、2、S、3、4、5、6号峰。通过与对照品对照,指认了其中5个色谱峰。即1号峰为桃叶珊瑚苷；2号峰为京尼平苷酸；S峰为绿原酸；4号峰为芦丁；5号峰为异槲皮苷。特征图谱见附图1。

1、精密度试验

取同一份样品供试品溶液，连续进样6次，计算各色谱峰面积，以绿原酸峰(S峰)为参照峰计算各色谱峰的相对保留时间，结果见表1和表2。结果表明，连续六次进样，峰面积RSD在0.62-1.69％范围内，相对保留时间RSD在0.19-2.03％范围内，均符合规定，精密度良好。

表1精密度峰面积评价

表2精密度相对保留时间

2、重复性试验

平行制备6份样品供试品溶液进行测定，计算各色谱峰面积，以绿原酸峰(S峰)为参照峰计算各色谱峰的相对保留时间，结果见表3和表4。结果表明，平行制备6份样品供试品溶液进行测定，相对保留时间RSD在0.12–0.33％范围内，峰面积RSD在0.89-2.47％范围内，均符合规定，重复性良好。

表3重复性峰面积评价

表4重复性相对保留时间

3、溶液稳定性试验

取同一份样品供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、16、24小时后进行测定。计算各色谱峰面积，以绿原酸峰(S峰)为参照峰计算各色谱峰的相对保留时间，结果见表5和表6。结果表明，同一份样品供试品溶液在0、2、4、8、12、16、24小时后进行测定，相对保留时间RSD在0.14-1.94％范围内，峰面积RSD在0.45-2.15％范围内，均符合规定，稳定性良好。

表5溶液稳定性峰面积评价

表6溶液稳定性相对保留时间

不同色谱柱和仪器适用性考察

取混合对照品溶液，在不同色谱柱HypersilODS25μm4.6mm×250mm，Dimension5μm(18C2)250×4.6mm，AglientEclipiseXDB-C18(4.6×250mm，5μm)及不同型号仪器Waterse2695和Agilent1200中进样分析，以内参物绿原酸为对照，计算个指标成分的相对保留时间，结果见下表，各组分在不同色谱柱和仪器的相对保留时间RSD＜3％，表明实验方法的耐用性良好。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本方法建立的杜仲叶及其提取物特征图谱，能有效的表征产品质量，更有利于监控产品的质量。

本发明采用高效液相建立标准特征图谱，通过多指标成分控制药材质量，能更有效的保证药材质量的长期稳定性，进而保障疗效的安全性和有效性。

本发明具有快捷、稳定、精密度高、重现性强及适用范围广等优点，有利于全方位的控制杜仲叶及其提取物的质量稳定性。

附图说明

杜仲叶及其提取物特征图谱对照图谱见附图图1；

桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、芦丁、异槲皮苷混合对照品图谱见附图图2；

杜仲叶样品检测图谱见附图图3；

杜仲叶提取物样品检测图谱见附图图4；

具体实施方式

实施例1：杜仲叶及其提取物质量检测

仪器：Waterse2695高效液相色谱仪；检测器：Waters2998PDADetector

试药：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。绿原酸对照品(批号：110753-201716)，来源中国食品药品检定研究院。

供试品溶液制备：取杜仲叶和杜仲叶提取物粉碎，过四号筛，精密称取粉末约0.1g，定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1ml含有绿原酸50μg溶液，即得。

色谱条件：色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长：206nm；柱温：25℃；流速：1.0ml.min

梯度洗脱程序的体积比浓度为：

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

具体结果见下表。

10批杜仲叶相对保留时间检测结果：

10批杜仲叶提取物相对保留时间检测结果：