技术领域
本发明涉及肺部疾病实验研究领域，特别是一种BeSO
背景技术
铍(Beryllium，Be)是一种灰白色碱土金属，具有较高的熔点及较强的导电性和导热性，其主要以铍金属、铍合金和铍氧化物这三种形式使用，广泛用于航空航天、信息技术、医疗行业和核工业。
铍早在1993年就被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物，暴露于铍化合物中可致急性铍病、铍致敏、慢性铍病、肺癌疾病。铍暴露(即暴露在含有铍化合物的环境中)会损伤全身多处脏器。而肺脏是铍损害的主要靶器官，铍对肺脏的损害可以引起呼吸系统炎症、肺组织肉芽肿及肺间质纤维化，造成肺组织的结构和功能损伤，形成“铍肺”。更加严重的问题是，在停止铍暴露多年后，铍仍会存在于个体的肺中，对肺脏形成持续的损害。
目前，铍化合物致肺损伤的毒理机制尚未完全阐明，针对“铍肺”的治疗也仅是对症及支持治疗为主。因此，深入了解铍化合物致肺损伤的毒理机制对于防治“铍肺”显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，而提供一种BeSO
本发明的技术方案是：BeSO
S01、获取大鼠肺组织：
a、选10只健康的雄性大鼠，随机分为5只一组的对照组和5只一组的染毒组，分别正常喂水喂食饲养6周，染毒组在第2周滴注0.25ml的BeSO
b、染毒组和对照组共10只大鼠均用乙醚麻醉，再用腹主动脉采血法收集血液，待大鼠死亡后，分别取肺脏以待后续使用；
S02、样品制备：
a、每个肺脏分别称取50mg，分别剪碎,放入不同的无菌研钵体中，在每个无菌研钵体中加入300ul 8M urea裂解液和3ul蛋白酶抑制剂；
b、将10个无菌研钵体中的肺组织分别置于研磨仪中研磨成肉糜，静置30min，使肺组织中的蛋白质充分发生裂解反应；
c、将10份样品分别收集到10个离心管中，分别进行离心处理，离心处理后，分别收集10个离心管中的上清液，上清液中含有肺组织中的蛋白质；
d、分别测定10份上清液中的蛋白质浓度，根据每份上清液的蛋白质浓度，在10份上清液中分别取含有150ug蛋白质的溶液量，转移到不同的超滤管的内管中；
S03、蛋白还原处理：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为10mM的DTT溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul，再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复b分步骤至少两次，使裂解液被DTT充分置换掉；
c、将10个超滤管静置于37℃的孵育箱中避光孵育1h，使超滤管内管中的蛋白质与DTT充分发生还原反应；
S04、蛋白烷基化处理：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为20mM的IAA溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复a步骤至少两次，使DTT被IAA充分置换掉；
c、将10个超滤管静置于37℃的孵育箱中避光静置1h，使超滤管内管中的蛋白质与IAA充分发生烷基化反应；
S05、蛋白酶解：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为100mM的TEAB溶液，将各超滤管中的溶液量补足至450ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复a步骤至少两次，使IAA被TEAB充分置换掉；
c、将10个超滤管内管中的溶液一一对应的转移至10个EP管中，分别添加胰蛋白酶至各EP管中，各EP管均于37℃的温度下进行酶解反应14-16h；
本步骤中，每100ug的蛋白质需要添加的胰蛋白酶量为1mg；
S06、对蛋白进行TMT标记：
使用TMT标签对酶解后的10个EP管内的溶液样品进行标记，每管样品使用一个标签，各EP管均置于37℃的孵育箱中进行标记反应1h，标记反应完成后，各EP管中分别加入8ul的5%质量浓度的羟胺溶液，静置15min，以终止标记反应；
S07、对样品进行LC-MS/MS检测：
a、将染毒组的5管样品混合为一管，命名为A管，将对照组的5管样品混合为一管，命名为B管，再分别对A管和B管内的溶液进行浓缩干燥，然后在A管和B管内分别加入200ul的0.1%FA溶解干燥浓缩后的样品，之后对A管和B管内的溶液分别进行分组分，各获得45管分馏样品，将所有的分馏样品浓缩蒸干以待后续试验使用；
b、将染毒组的45管浓缩蒸干样品分别命名为C
c、将对照组的45管浓缩蒸干样品分别命名为D
d、将染毒组和对照组共30管溶液于质谱仪进行上机检测，针对检测数据使用UniProt人数据库进行搜索，获得包含蛋白种类、丰度信息和相对分子量的原始数据；
S08、GO和KEGG富集分析：
a、按照P value＜0.05、|FC|>1.2的标准，通过Persue软件对原始数据进行筛选，找到差异表达蛋白；
b、基于R语言“clusterProfiler”及“org.Hs.eg.db”两个软件包对差异表达蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析，通过GO富集分析获取差异表达蛋白的生物学功能、分布位置和分子功能，通过KEGG富集分析获取差异表达蛋白参与BeSO
c、基于KEGG富集分析的结果，从差异表达蛋白中筛选出与信号途径相关的差异表达蛋白，称为相关差异表达蛋白；再结合信号途径对应的通路图，从相关差异表达蛋白中筛选出参与了信号途径的蛋白；
S09、PPI网络图分析：
a、将相关差异表达蛋白输入String在线数据库进行检索，将检索结果保存为TSV格式文件；
b、通过Cytoscape软件对TSV格式文件进行可视化分析，绘制出由相关差异表达蛋白组成的PPI网络图；
c、结合PPI网络图，从参与了信号途径的蛋白中筛选出关键蛋白，所述关键蛋白同时与至少2种蛋白具有相关性。
本发明进一步的技术方案是：S01步骤中，BeSO
本发明再进一步的技术方案是：S01步骤中，大鼠的品种为SD大鼠。
本发明更进一步的技术方案是：S02步骤中，无菌研钵体静置于4℃的冰箱中。
本发明更进一步的技术方案是：S03步骤中，通过离心处理使小于3Kda的蛋白质进入超滤管外管中，大于3Kda的蛋白质被截留在超滤管内管中。
本发明更进一步的技术方案是：S03步骤中，超滤管静置于37℃的孵育箱中。
本发明更进一步的技术方案是：S05步骤中，每100ug的蛋白质需要添加的胰蛋白酶量为1mg。
本发明更进一步的技术方案是：S06步骤中，EP管静置于37℃的孵育箱中。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、利用TMT标记的定量蛋白质组学技术和生物信息学分析技术，一方面实现了快速且高通量的检测BeSO
2、TMT标记的定量蛋白质组学技术，具有灵敏度高、高通量、分离能力强、适应范围广的特点，可获得不同样品间相同肽段的定量信息，为进一步得到蛋白质的定量数据奠定了基础。
以下结合图和实施例对本发明作进一步描述。
附图说明
图1为S08步骤中的差异表达蛋白火山图；
图2为S08步骤中的差异表达蛋白聚类热图；
图3为S08步骤中的GO-Cellular Component分析图；
图4为S08步骤中的GO-Biological Process分析图；
图5为S08步骤中的GO-Molecular Function分析图；
图6为S08步骤中的KEGG富集分析图；
图7为S08步骤中的RNA转运信号通路图；
图8为S09步骤中的相关差异表达蛋白的PPI网络图。
具体实施方式
实施例1：
BeSO
S01、获取大鼠肺组织：
a、选10只健康的雄性大鼠，随机分为5只一组的对照组和5只一组的染毒组，分别正常喂水喂食饲养6周，染毒组在第2周滴注0.25ml的BeSO
b、染毒组和对照组共10只大鼠均用乙醚麻醉，再用腹主动脉采血法收集血液，待大鼠死亡后，分别取肺脏以待后续使用。
本步骤中，BeSO
本步骤中，大鼠的品种为SD大鼠。
S02、样品制备：
a、每个肺脏分别称取50mg，分别剪碎,放入不同的无菌研钵体中(无菌研钵体的数量共10个)，在每个无菌研钵体中加入300ul 8M urea裂解液和3ul蛋白酶抑制剂；
b、将10个无菌研钵体中的肺组织分别置于研磨仪中研磨成肉糜，再分别置于4℃的冰箱中静置30min，使肺组织中的蛋白质充分发生裂解反应；
c、将10份样品分别收集到10个离心管中，分别进行离心处理，离心处理后，分别收集10个离心管中的上清液，上清液中含有肺组织中的蛋白质；
d、分别测定10份上清液中的蛋白质浓度，根据每份上清液的蛋白质浓度，在10份上清液中分别取含有150ug蛋白质的溶液量，转移到不同的超滤管的内管中(超滤管的数量共10个)。
本步骤中，离心处理的温度为4℃，转速为12000rmp/min，时间为10min。
S03、蛋白还原处理：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为10mM的DTT溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul，再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复b分步骤至少两次，使裂解液被DTT充分置换掉；
c、将10个超滤管置于37℃的孵育箱中1h，使超滤管内管中的蛋白质与DTT充分发生还原反应。
本步骤中，通过离心处理使小于3Kda的蛋白质进入超滤管外管中，大于3Kda的蛋白质被截留在超滤管内管中。
本步骤中，离心处理的温度为4℃，转速为12000rmp/min，时间为15min。
S04、蛋白烷基化处理：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为20mM的IAA溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复a步骤至少两次，使DTT被IAA充分置换掉；
c、将10个超滤管静置于37℃的孵育箱中避光静置1h，使超滤管内管中的蛋白质与IAA充分发生烷基化反应。
本步骤中，离心处理的温度为4℃，转速为14000rmp/min，时间为15min。
S05、蛋白酶解：
a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为100mM的TEAB溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；
b、重复a步骤至少两次，使IAA被TEAB充分置换掉；
c、将10个超滤管内管中的溶液一一对应的转移至10个EP管中，分别添加胰蛋白酶至各EP管中，各EP管均于37℃的温度下进行酶解反应14-16h。
本步骤中，每100ug的蛋白质需要添加的胰蛋白酶量为1mg。
本步骤中，离心处理的温度为4℃，转速为14000rmp/min，时间为15min。
S06、对蛋白进行TMT标记：
a、使用TMT标签(标签产品型号为Thermo Scientific™ TMT™ )对酶解后的10个EP管内的溶液样品进行标记，每管样品使用一个标签，各EP管均置于37℃的孵育箱中进行标记反应1h，标记反应完成后，各EP管中分别加入8ul的5%质量浓度的羟胺溶液，静置15min，以终止标记反应。
本步骤中，EP管静置于37℃的孵育箱中。
S07、对样品进行LC-MS/MS检测：
a、将染毒组的5管样品混合为一管，命名为A管，将对照组的5管样品混合为一管，命名为B管，再分别对A管和B管内的溶液进行浓缩干燥，然后在A管和B管内分别加入200ul的0.1%FA溶解干燥浓缩后的样品，之后对A管和B管内的溶液分别进行分组分，各获得45管分馏样品，将所有的分馏样品浓缩蒸干以待后续试验使用；
b、将染毒组的45管浓缩蒸干样品分别命名为C
c、将对照组的45管浓缩蒸干样品分别命名为D
d、将染毒组和对照组共30管溶液于质谱仪进行上机检测，针对检测数据使用UniProt人数据库进行搜索，提取染毒组被染毒的蛋白质和对照组未被染毒的蛋白质的量化数据到excel表格中，该excel中的数据即为原始数据，原始数据中包含蛋白种类、丰度信息和相对分子量信息。
本步骤中，b、c分步骤不分先后次序。
S08、GO和KEGG富集分析：
a、按照P value＜0.05、|FC|>1.2的标准，通过Persue软件对原始数据进行筛选，找到422种差异表达蛋白，其中，显著上调差异蛋白有197种，显著下调差异蛋白有225种；
b、基于R语言“clusterProfiler”及“org.Hs.eg.db”两个软件包对上述的422种差异表达蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析，通过GO富集分析获取差异表达蛋白的生物学功能、分布位置和分子功能，通过KEGG富集分析获取差异表达蛋白参与BeSO
c、基于KEGG富集分析的结果，从422种差异表达蛋白中筛选出与信号途径(调控RNA转运)相关的差异表达蛋白(共有8种，分别为UBE21、NUP85、NUP88、RNPS1、NUP155、EIF2B4、EIF2B3)，称为相关差异表达蛋白；再结合信号途径对应的通路图(RNA转运信号通路图)，从相关差异表达蛋白中筛选出5种参与了信号途径(调控RNA转运)的蛋白。
本步骤中，参看图1-2，通过火山图(通过graphpad prism 7软件制作)和聚类热图(通过omicshare云平台制作)更加直观的展示了染毒组和对照组间的差异表达蛋白的分布状况。
本步骤中，参看图3-5，GO富集分析结果显示，差异表达蛋白集中在导介核糖体、线粒体、高尔基体这些细胞成分中，差异表达蛋白参与了RNA运转、RNA运输、RNA定位这些生物过程，差异表达蛋白涉及了核糖核苷结合和核孔结构成分这两种分子功能。
本步骤中，参加图6，KEGG富集分析结果显示，BeSO
本步骤中，参看图7，RNA转运信号通路图显示，在8种相关差异表达蛋白中，NUP85和NUP88的作用途径是核孔复合体(Nuclear Pore Complex, NPC)的过程；EIF2B4和EIF2B3的作用途径是翻译起始因子(Translation Initiation Factors, EIFs)的过程；RNPS1的作用途径是外显子连接复合体 (Exon-Junction Complex, EJC)的过程。
S09、PPI网络图分析：
a、将8种相关差异表达蛋白输入String在线数据库进行检索，将检索结果保存为TSV格式文件；
b、通过Cytoscape软件对TSV格式文件进行可视化分析，绘制出由8种相关差异表达蛋白组成的PPI网络图；
c、结合PPI网络图，从参与了RNA转运信号途径的5种蛋白中筛选出3种关键蛋白(NUP85、NUP88、RNPS1)，所述关键蛋白同时与至少2种蛋白具有相关性。
本步骤中，参看图8，在8种相关差异表达蛋白中，NUP85、NUP88、RNPS1这3种蛋白参与了RNA转运信号途径，同时与至少2种蛋白具有相关性，故被确定为关键蛋白。
本发明提供的方法结合了蛋白质组学技术和生物信息学分析技术，从分子领域探索了BeSO
机译： 亲和力检测与分析芯片，制造相同方法的方法以及使用亲和力检测与分析芯片的检测方法和系统
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机译： 一种鉴定2-DE凝胶图像中差异表达蛋白质的方法
