一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法

摘要

本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种大肠癌标记物DCD的Q‑PCR检测方法。该方法包括样品的RNA提取、逆转录和Q‑PCR扩增。本发明将DCD作为大肠癌候选的诊断指标及治疗标靶，先提取细胞或组织的RNA，设置内参引物和DCD基因引物分别对RNA进行逆转录，得到两组不同的扩增产物，再分别进行Q‑PCR反应，分别得到两组扩增产物的熔解曲线和扩增曲线，从而计算出DCD基因的表达水平；然后将其与正常组织或细胞中DCD的mRNA浓度对比，若受试组织或细胞中的DCD的mRNA浓度高于正常的1倍以上，则可认为该受试组织或细胞是的大肠癌组织或大肠癌细胞，有助于大肠癌的早期诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法。

背景技术

DCD(Dermcidin)是2001年德国科学家Schittek等人从人体汗液中分离得到的一种天然活性肽，DCD最初被认为在汗腺中有着特异性表达，在汗腺中表达并分泌至汗液中，有一定的抗菌活性。后来的研究发现，DCD也在某些癌症中表达，包括黑色素瘤、皮肤肿瘤癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和肝细胞癌。DCD很可能是一个潜在的致癌因素，能作为治疗这些癌症的候选治疗标靶。

通过实验研究证实，DCD在肿瘤发病率位居全球第3位的大肠癌中存在高表达，能成为大肠癌的诊断指标及治疗标靶。然而DCD在大肠癌细胞中的检测方法则尚未系统的建立。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法，采用Q-PCR技术通过检测细胞中DCD的mRNA序列，来判断是否患有大肠癌。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品的RNA提取；

2)逆转录：将步骤1)提取的RNA配制第一链cDNA合成反应液，进行cDNA合成反应，得到cDNA；

3)Q-PCR扩增：以步骤2)中的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.1所示的上游引物和和SEQ ID No.2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到第一扩增产物；其中，第一扩增产物为对照组，即human-ACTB内参基因组；

以步骤2)中的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.3所示的上游引物和和SEQ ID No.4所示的下游引物，进行PCR扩增，得到第二扩增产物；其中，第二扩增产物为实验组，即DCD基因组；

SEQ ID NO.1：CATGTACGTTGCTATCCAGGC；

SEQ ID NO.2：CTCCTTAATGTCACGCACGAT；

SEQ ID NO.3：AGCCAAGGAAGCAGAGATCC；

SEQ ID NO.4：CTTCGACTGCATCTTTTCCTAGT；

4)分析：分别得出第一扩增产物的扩增曲线和熔解曲线以及第二扩增产物的扩增曲线和熔解曲线，计算出DCD基因的相对表达量，再与正常大肠细胞或组织中DCD基因的相对表达量对比，判断该样品是否为大肠癌组织或大肠癌细胞。

根据2-△△Ct公式计算基因扩增：2-△△Ct表示的是实验组DCD基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到DCD基因相对于内参基因的定量。ΔΔCt＝(CtDCD基因-Ct内参基因)实验组-(CtDCD基因-Ct内参基因)对照组，则实验组目标基因的表达水平为对照组的2-△△Ct倍。

计算出样品的DCD基因的相对表达量后，与正常大肠细胞或组织中DCD的mRND浓度进行对比，可得出该样品是否为肠癌细胞或组织，为临床提供新的诊断思路。

进一步，步骤1)中，所述样品为细胞样品和/或组织样品。

再进一步，所述样品为细胞样品，细胞样品可为未知状态的人结肠细胞或已知为癌细胞但未知其种类的人结肠癌细胞，细胞样品为正常人上皮细胞和/或人结肠癌细胞；所述人结肠癌细胞为SW620细胞、LoVo细胞、HT-29细胞、HCT-116细胞或SW480细胞中的一种或两种以上；

细胞样品的RNA提取方法为：细胞样品经过复苏培养后，加入1mLTRIzol RNA分离试剂，室温静置；再加入0.2mL氯仿，振荡后，进行离心；吸取上层水相，再加入0.5mL异丙醇，混匀后，静置，再进行离心，弃去上清液；继续加入1mL乙醇，摇晃后，进行离心，弃去上清液；最后进行干燥后，加入20μL水，得到细胞样品的RNA。

进一步，步骤1)中，所述样品为组织样品，组织样品为大肠癌组织和/或癌旁组织；组织样品的RNA提取方法为：剪取组织样品后，加入1mLTRIzol RNA分离试剂，室温静置；再加入0.2mL氯仿，振荡后，进行离心；吸取上层水相，再加入0.5mL异丙醇，混匀后，静置，再进行离心，弃去上清液；继续加入1mL乙醇，摇晃后，进行离心，弃去上清液；最后进行干燥后，加入20μL水，得到组织样品的RNA。

再进一步，步骤2)中，所述第一链cDNA合成反应液包括：1μg步骤1)所得的RNA、10μL 2×RT-PCR buffer、1μL Enzyme Mix、2μL反转录引物，补加RNase-free ddH

进一步，步骤2)中，所述cDNA合成反应的反应条件为：先25℃加热10min，再42℃加热40min，最后再85℃加热5min。

再进一步，步骤3)中，所述Q-PCR扩增体系包括：2μg步骤2)所得的cDNA和10μLQ-PCR Green Master Mix、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.4μL50×ROX Reference DyeII，补加灭菌双蒸水至20μL。

进一步，步骤3)中，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；扩增反应：94℃10s，60℃34s，共40个循环，得到扩增曲线；熔解反应：95℃15s，60℃60s，95℃15s，得到熔解曲线。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)过往的技术检测的肿瘤标志物往往是已经生成的蛋白和激素，而本发明则是从细胞或组织中检测出DCD的mRNA序列，有助于大肠癌的早期诊断。本发明将DCD作为大肠癌候选的诊断指标及治疗标靶，先提取细胞或组织的RNA，设置内参引物和DCD基因引物分别对RNA进行逆转录，得到两组不同的扩增产物，再分别进行Q-PCR反应，分别得到两组扩增产物的熔解曲线和扩增曲线，从而计算出DCD基因的表达水平；然后将其与正常组织或细胞中DCD的mRNA浓度对比，若受试组织或细胞中的DCD的mRNA浓度高于正常的1倍以上，则可认为该受试组织或细胞是的大肠癌组织或大肠癌细胞，有助于大肠癌的早期诊断。

(2)本发明采用的Q-PCR技术，实现全封闭PCR过程，无需经过普通PCR后续的凝胶电泳成像，简化程序，防止二次污染。

(3)本发明采用的Q-PCR技术具有灵敏度高和特异性强的优点，能及时反馈扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量；而且定量范围宽，可达到10个数量级，无需稀释样品，由仪器自动分析，更快获得结果。

附图说明

图1为实施例1的各组细胞内参Beta-actin基因的扩增曲线；

图2为实施例1的各组细胞中DCD基因的扩增曲线；

图3为实施例1的DCD在各组大肠癌细胞和正常大肠细胞中mRNA的表达对比图；

图4为实施例2的各组组织内参Beta-actin基因的扩增曲线；

图5为实施例2的各组组织中DCD基因的扩增曲线；

图6为实施例2的DCD在大肠癌组织及癌旁组织中mRNA的表达对比图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1～2所用试剂

实施例1～2所用试剂

实施例1

一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选取一株正常人上皮细胞(HIEC)和五株人结肠癌细胞作为细胞样品；该五株人结肠癌细胞分别为SW620细胞、LoVo细胞、HT-29细胞、HCT-116细胞和SW480细胞；

细胞样品的RNA提取方法为：细胞样品经过复苏培养后，加入1mLTRIzol RNA分离试剂，室温静置；再加入0.2mL氯仿，振荡后，在4℃、12000g转速下离心15min；吸取上层水相，移至另一离心管中，再加入0.5mL异丙醇，混匀后，在37℃静置10min，再在4℃、12000g转速下离心10min，弃去上清液；继续加入1mL75％乙醇，摇晃后，在4℃、7500g转速下离心5min，弃去上清液；最后在37℃自然干燥后，加入20μLDEPC水，得到细胞样品的RNA。

2)逆转录：将步骤1)提取的RNA再配制20μL第一链cDNA合成反应液，用移液器轻轻吹打混匀，在First Strand cDNA Synthesis Kit(逆转录试剂盒)进行cDNA合成反应，得到cDNA；

所述第一链cDNA合成反应液包括以下原料：

所述cDNA合成反应的反应条件为：先25℃加热10min，再42℃加热40min，最后再85℃加热5min。

3)Q-PCR扩增：以步骤2)中的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.1所示的上游引物和和SEQ ID No.2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到第一扩增产物；其中，第一扩增产物为对照组，即human-ACTB内参基因组；

以步骤2)中的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.3所示的上游引物和和SEQ ID No.4所示的下游引物，进行PCR扩增，得到第二扩增产物；其中，第二扩增产物为实验组，即DCD基因组；

SEQ ID NO.1(human-ACTB-F)：CATGTACGTTGCTATCCAGGC；

SEQ ID NO.2(human-ACTB-R)：CTCCTTAATGTCACGCACGAT；

SEQ ID NO.3(DCD-F1)：AGCCAAGGAAGCAGAGATCC；

SEQ ID NO.4(DCD-R1)：CTTCGACTGCATCTTTTCCTAGT；

其中，Q-PCR反应体系配制：20μL

实时荧光定量PCR仪中进行的Q-PCR反应程序设置

4)分析：分别得出如图1所示的各组细胞的第一扩增产物(对照组：内参Beta-actin基因)的扩增曲线以及得出如图2所示的各组细胞的第二扩增产物(实验组：DCD基因)的扩增曲线，根据2-△△Ct公式计算基因扩增：2-△△Ct表示的是实验组DCD基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到DCD基因相对于内参基因的定量。ΔΔCt＝(CtDCD基因-Ct内参基因)实验组-(CtDCD基因-Ct内参基因)对照组，则实验组目标基因的表达水平为对照组的2-△△Ct倍。计算出DCD基因的相对表达量，计算三次，取平均值，如表1和图3所示。

表1各组大肠癌细胞和正常大肠细胞的DCD基因2-△△Ct平均表达量

实施例2

一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选取五组大肠癌组织(T)和五组癌旁组织(N即正常组织)作为组织样品；

组织样品的RNA提取方法为：剪取0.1g组织样品，加入1mLTRIzol RNA分离试剂，室温静置；再加入0.2mL氯仿，振荡后，在4℃、12000g转速下离心15min；吸取上层水相，移至另一离心管中，再加入0.5mL异丙醇，混匀后，在37℃静置10min，再在4℃、12000g转速下离心10min，弃去上清液；继续加入1mL75％乙醇，摇晃后，在4℃、7500g转速下离心5min，弃去上清液；最后在37℃自然干燥后，加入20μLDEPC水，得到组织样品的RNA。

3)逆转录：将步骤1)提取的RNA再配制20μL第一链cDNA合成反应液，用移液器轻轻吹打混匀，在First Strand cDNA Synthesis Kit(逆转录试剂盒)进行cDNA合成反应，得到cDNA；

所述第一链cDNA合成反应液包括以下原料：

所述cDNA合成反应的反应条件为：先25℃加热10min，再42℃加热40min，最后再85℃加热5min。

3)Q-PCR扩增：以步骤2)中的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.1所示的上游引物和和SEQ ID No.2所示的下游引物，进行PCR扩增，得到第一扩增产物；其中，第一扩增产物为对照组，即human-ACTB内参基因组；

以步骤2)中的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.3所示的上游引物和和SEQ ID No.4所示的下游引物，进行PCR扩增，得到第二扩增产物；其中，第二扩增产物为实验组，即DCD基因组；

SEQ ID NO.1(human-ACTB-F)：CATGTACGTTGCTATCCAGGC；

SEQ ID NO.2(human-ACTB-R)：CTCCTTAATGTCACGCACGAT；

SEQ ID NO.3(DCD-F1)：AGCCAAGGAAGCAGAGATCC；

SEQ ID NO.4(DCD-R1)：CTTCGACTGCATCTTTTCCTAGT；

其中，Q-PCR反应体系配制：20μL

实时荧光定量PCR仪中进行的Q-PCR反应程序设置

4)分析：分别得出如图4所示的10组组织的第一扩增产物(对照组：内参Beta-actin基因)的扩增曲线以及得出如图5所示的10组组织的第二扩增产物(实验组：DCD基因)的扩增曲线，根据2-△△Ct公式计算基因扩增：2-△△Ct表示的是实验组DCD基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到DCD基因相对于内参基因的定量。ΔΔCt＝(CtDCD基因-Ct内参基因)实验组-(CtDCD基因-Ct内参基因)对照组，则实验组目标基因的表达水平为对照组的2-△△Ct倍。计算出DCD基因的相对表达量，计算三次，取平均值，如表2和图6所示。

表2各组大肠癌组织及癌旁组织的DCD基因2-△△Ct平均表达量

实验结果分析

根据图1显示，内参Beta-actin基因扩增情况整体良好，全部细胞样品质量符合实验要求。根据图2显示，DCD基因扩增情况整体良好，全部细胞样品质量符合实验要求。

图3中的“**”为：与HIEC组比较，P＜0.01。图3和表1结果表明：经检验各组间的mRNA比较，数据呈现正态分布(SW620:P＝0.783，LoVo：P＝0.721，HT-29：P＝0.604，HCT-116：P＝0.189，SW480：P＝0.554)，Levene检验方差齐性，P＝0.028<0.05，显示方差不齐，单因素方差分析，F＝1520.614，P＝0.000，采用Dunnett法进行两两比较：在基因水平上，DCD在大肠癌细胞SW620、LoVo、HT-29、HCT-116、SW480中的表达均高于正常肠细胞HIEC，差异均具有统计学意义(P＜0.01)，高侵袭性大肠癌LoVo细胞的表达最为明显。

根据图4显示，内参Beta-actin基因扩增情况整体良好，全部组织样品质量符合实验要求。根据图5显示，DCD基因扩增情况整体良好，全部组织样品质量符合实验要求。

图6中的“**”为：与N组比较，P＜0.01。图6和表2结果表明：大肠癌组织与癌旁组织比较，采独立样本t检验，t＝4.083，P＝0.000，DCD在5对大肠癌组织及癌旁组织中mRNA的表达，说明大肠癌组织中DCD的mRNA浓度高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.01)。

由此可见，本发明的检测方法适用于检测细胞或组织中DCD的mRNA浓度，根据mRNA浓度多少判断该细胞或组织是否为肠癌细胞或组织，能为临床提供新的诊断思路。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

<110> 广州医科大学附属中医医院

<120> 一种大肠癌标记物DCD的Q-PCR检测方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工合成

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CATGTACGTTGCTATCCAGGC 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

CTCCTTAATGTCACGCACGAT 21

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

AGCCAAGGAAGCAGAGATCC 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

CTTCGACTGCATCTTTTCCTAGT 23