AP-2alpha抗体及其在制备宫颈癌药物中的用途

摘要

本发明公开了一种AP‑2alpha单克隆抗体以及使用该单克隆抗体和博来霉素联合用药用于制备治疗宫颈癌的药物中的用途。本发明通过制备真核表达系统制备AP‑2alpha全蛋白，在此蛋白的基础上，通过杂交瘤细胞获得了特异性针对AP‑2alpha蛋白的高亲和力的单克隆抗体，该单克隆抗体具有较好的抑制宫颈癌细胞增殖的效果。并且，本发明通过将单克隆抗体与博来霉素偶联，相比于单独使用单克隆抗体或博来霉素或不偶联联合使用单克隆抗体、博来霉素，具有具有更好的抑制癌细胞增殖的效果，且比索拉非尼的效果更好。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种AP-2alpha单克隆抗体及其联合用药在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为 45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。近几十年宫颈细胞学筛查的普遍应用，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和死亡率已有明显下降。

宫颈癌是一个受多基因网络调控的疾病。AP-2作为一个重要的转录因子家族，研究表明AP-2在宫颈癌中起着重要的调控作用。其中AP-2alpha在细胞生长和肿瘤发生中起着重要作用AP-2alpha的功能一部分是通过与AP-2alpha下游基因启动子区域结合，促进其表达来实现。癌基因ErbB2在宫颈癌中广泛过表达，一直以来是研究治疗的靶点。ErbB2在肿瘤细胞中功能丢失将导致细胞生长抑制，并引起凋亡。最新研究报道ErbB2基因的表达下调促进了宫颈癌细胞的凋亡，从而达到治疗宫颈癌的目的。有研究表明AP-2alpha与癌基因ErbB2基因启动子结合，促进ErbB2基因的转录和蛋白表达，从而显示了AP-2alpha在宫颈癌发生发展中的调控作用。

CN 111647067 A公开了一种AP-2alpha的单克隆抗体与索拉非尼联合用药治疗宫颈癌的用途。但该发明中仅仅是单克隆抗体与索拉非尼简单的混合即用于治疗，但是，本领域的技术人员知道，索拉非尼是化学药物，靶向性较差，且临床上主要用于不能手术的晚期肝癌患者治疗，因此不管是单独使用还是简单的与单克隆抗体混合使用，都会对其它的器官或组织产生伤害或耐药性，且对宫颈癌的治疗效果有限。另外，该发明中用于筛选单克隆抗体的抗原仅仅是AP-2alpha 的一部分，其空间结构与靶蛋白可能存在一定的区别，因此，其筛选的单克隆抗体可能在特异性和敏感性方面存在一定的缺陷。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提出了一种AP-2alpha单克隆抗体及其联合用药用于制备治疗宫颈癌的药物中的用途。

因此，本发明一方面提供了一种AP-2alpha单克隆抗体，所述的单克隆抗体结合的抗原表位位于AP-2alpha蛋白的aa55-aa68；所述的aa55-aa68的氨基酸序列为LSHTPNADFQPPYF。

优选地，本发明所述的单克隆抗体为IgG1亚型。

优选地，本发明所述的单克隆抗体制备用抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO2 所示。

优选地，本发明所述的编码单克隆抗体制备用抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物由权利要求 1所述的AP-2alpha单克隆抗体和博来霉素组成。

优选地，本发明所述的药物组合物中AP-2alpha单克隆抗体和博来霉素通过 SPDP偶联在一起。

优选地，本发明所述的药物组合物中AP-2alpha单克隆抗体与博来霉素的摩尔比为1:3～6。

优选地，本发明所述的药物组合物的用量为5mg/kg。优选地，本发明所述的。

本发明通过制备真核表达系统制备AP-2alpha全蛋白，在此蛋白的基础上，通过杂交瘤细胞获得了特异性针对AP-2alpha蛋白的高亲和力的单克隆抗体，该单克隆抗体具有较好的抑制宫颈癌细胞增殖的效果。并且，本发明通过将单克隆抗体与博来霉素偶联，相比于单独使用单克隆抗体或博来霉素或不偶联联合使用单克隆抗体、博来霉素，具有具有更好的抑制癌细胞增殖的效果，且比索拉非尼的效果更好。

附图说明

图1 AP-2alpha蛋白的SDS-PAGE图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明所涉及的化学试剂均为国产试剂。

实施例1 AP-2alpha蛋白的制备

将密码子优化后的AP-2alpha蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.1 所示)克隆到真核表达载体(如)中，

以密码子优化的AP-2alpha蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，分别用EcoRI和XhoI双酶切位点进行连接以构建 pFuse-AP-2alpha-6His表达质粒。将鉴定为阳性的重组质粒送到华大生物公司进行序列测定，用软件对测定的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行分析比对，检查阅读框架的正确性。

将鉴定正确的pFuse-AP-2alpha-6His表达质粒瞬时转染293T细胞，72小时后收获细胞培养上清，用镍柱(GE医疗)亲和纯化分泌表达的AP-2alpha-6His蛋白； BCA试剂盒(碧云天)测定浓度，并用SDS-PAGE测定纯度。经测定，其表达产量能达到200mg/L，且SDS-PAGE纯度(如图1所示)＞95％。测定后的蛋白分装冻存于-80℃备用。其中，表达的AP-2alpha蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2抗AP-2alpha单克隆抗体的制备

用AP-2alpha蛋白，免疫8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫时，AP-2alpha 蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化，腹腔接种小鼠，50μg蛋白/只；7天后AP-2alpha 蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化，第二次腹腔接种途径免疫小鼠，50μg蛋白/ 只；7天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫AP-2alpha蛋白，50μg/只；免疫后的第 3天，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，HAT选择性培养基培；10 天后以AP-2alpha蛋白为包被抗原，间接ELISA检测细胞上清，筛选阳性杂交瘤细胞，从中筛选到4D7株细胞株。

取8～10周龄Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5mL，7～10日后每只小鼠注射杂交瘤细胞(4D7株)1×10

接下来，我们委托南京金斯瑞公司对来单克隆抗体进行分型检测和所识别的抗原表位进行检测，结果显示，本发明所述的抗AP-2alpha蛋白的单克隆抗体的 IgG1亚型，其结合的抗原表位位于AP-2alpha蛋白的aa55-aa68位(氨基酸序列具体为LSHTPNADFQPPYF)。

实施例3抗AP-2alpha单克隆抗体与博来霉素的偶联

用SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)为连接剂，抗 AP-2alpha单克隆抗体与SPDP的克分子比为1:12，博来霉素与SPDP的克分子比为1:1，将巯基化的抗体与巯基化的博来霉素混合后加入DTT(二硫苏糖醇)，通过SephadexG 25柱层析收集偶联物部分，用BCA方法检测蛋白含量，并保存于-80℃备用。利用紫外-可见分光光度法和质谱法检测偶联物，通过测定，偶联物中抗体与博来霉素的摩尔比为1:3～6。

实施例4抗AP-2alpha单克隆抗体与博来霉素联合用药在宫颈癌中的应用

具体方法参见CN 111647067 A专利，详述如下：

从液氮罐中取出人宫颈癌SiHa细胞，迅速经37℃水浴后加入RPMI-1640 培养液吹打混匀，1000r/min离心5min，弃上清液，加入适量含10％牛血清的 RPMI-1640培养液，吹打成细胞悬液，置于37℃、5％CO

BALB/c裸小鼠适应性生长1周后，取对数生长期的SiHa细胞，用胰酶消化后，用PBS分别配制成1×10

与空白对照组相比，

结果显示在药物腹腔注射开始至最后，小鼠体重开始缓慢持续增加,各组小鼠趋势基本一致。D组小鼠抑瘤率为93.63％，抑瘤率最高，且比不偶联(E组) 的效果要好。这说明本发明的单抗可以和化药博来霉素进行联合用药，具有较好的抑制效果，具有有效促进肿瘤细胞凋亡的效果，且偶联后使用效果更佳，为临床治疗提供了依据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 陈卫国

<120> AP-2alpha抗体及其在制备宫颈癌药物中的用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagatgt tgtggaaact gacagacaac ataaagtacg aggattgtga ggaccgacac 60

gatggcacca gtaatggcac tgcgcgcctg ccccagctgg ggacagtggg ccagagtccg 120

tacacaagcg ccccaccgct cagccatacc ccaaacgcag acttccaacc accctacttc 180

ccaccccctt atcagcctat ttacccccag agccaggatc cctacagtca cgtgaatgat 240

ccctactctc tgaacccact gcatgcccaa cctcaacccc agcacccagg gtggcctggc 300

cagcggcaga gccaggaatc aggactgctt catacccacc gagggttgcc ccatcaactg 360

tcaggccttg acccacgacg cgactacaga agacatgagg acctgctgca tggtccccac 420

gccctcagct ccggcctggg ggacctgtcc atccatagtt tgccgcacgc gattgaggaa 480

gttccccatg tcgaggatcc cggtatcaac attcctgacc agactgtgat aaagaaaggt 540

ccagtgtccc tcagtaagtc caattccaat gcggtttctg ccattccaat taataaggac 600

aacttgttcg ggggggtggt gaatccaaat gaggtctttt gttccgtgcc agggagactg 660

tcccttttgt cctcaaccag caaatacaag gtgaccgtgg ccgaagtgca gcggcggctc 720

tctccacccg aatgcttgaa cgcctcattg ctggggggag tcctgaggag ggccaagtcc 780

aaaaacgggg ggagaagcct gagggagaaa cttgacaaaa ttggtctgaa cctccccgct 840

ggacggagga aagcggctaa tgtgactctg ctgaccagcc tggtggaagg cgaagcggtg 900

cacctggcca gggattttgg ttacgtttgt gaaactgaat tccccgccaa ggccgtggcc 960

gagtttctga accgccagca ctctgatcca aatgagcaag tgactcgaaa aaacatgttg 1020

ttggccacca agcagatctg caaagaattt accgatctcc tggctcagga tcggtctccc 1080

ctgggcaatt caagaccaaa tccaatcctc gagcctggga tccagtcctg cctgacacac 1140

tttaatctga taagtcacgg ctttggctca cctgcagttt gcgctgccgt tacagctctg 1200

cagaattatt tgaccgaagc ccttaaagca atggataaga tgtacctgtc taataacccc 1260

aacagccata ctgacaataa cgccaagagc tcagacaagg aagaaaaaca cagaaaa 1317

<210> 2

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Met Leu Trp Lys Leu Thr Asp Asn Ile Lys Tyr Glu Asp Cys

1 5 10 15

Glu Asp Arg His Asp Gly Thr Ser Asn Gly Thr Ala Arg Leu Pro Gln

20 25 30

Leu Gly Thr Val Gly Gln Ser Pro Tyr Thr Ser Ala Pro Pro Leu Ser

35 40 45

His Thr Pro Asn Ala Asp Phe Gln Pro Pro Tyr Phe Pro Pro Pro Tyr

50 55 60

Gln Pro Ile Tyr Pro Gln Ser Gln Asp Pro Tyr Ser His Val Asn Asp

65 70 75 80

Pro Tyr Ser Leu Asn Pro Leu His Ala Gln Pro Gln Pro Gln His Pro

85 90 95

Gly Trp Pro Gly Gln Arg Gln Ser Gln Glu Ser Gly Leu Leu His Thr

100 105 110

His Arg Gly Leu Pro His Gln Leu Ser Gly Leu Asp Pro Arg Arg Asp

115 120 125

Tyr Arg Arg His Glu Asp Leu Leu His Gly Pro His Ala Leu Ser Ser

130 135 140

Gly Leu Gly Asp Leu Ser Ile His Ser Leu Pro His Ala Ile Glu Glu

145 150 155 160

Val Pro His Val Glu Asp Pro Gly Ile Asn Ile Pro Asp Gln Thr Val

165 170 175

Ile Lys Lys Gly Pro Val Ser Leu Ser Lys Ser Asn Ser Asn Ala Val

180 185 190

Ser Ala Ile Pro Ile Asn Lys Asp Asn Leu Phe Gly Gly Val Val Asn

195 200 205

Pro Asn Glu Val Phe Cys Ser Val Pro Gly Arg Leu Ser Leu Leu Ser

210 215 220

Ser Thr Ser Lys Tyr Lys Val Thr Val Ala Glu Val Gln Arg Arg Leu

225 230 235 240

Ser Pro Pro Glu Cys Leu Asn Ala Ser Leu Leu Gly Gly Val Leu Arg

245 250 255

Arg Ala Lys Ser Lys Asn Gly Gly Arg Ser Leu Arg Glu Lys Leu Asp

260 265 270

Lys Ile Gly Leu Asn Leu Pro Ala Gly Arg Arg Lys Ala Ala Asn Val

275 280 285

Thr Leu Leu Thr Ser Leu Val Glu Gly Glu Ala Val His Leu Ala Arg

290 295 300

Asp Phe Gly Tyr Val Cys Glu Thr Glu Phe Pro Ala Lys Ala Val Ala

305 310 315 320

Glu Phe Leu Asn Arg Gln His Ser Asp Pro Asn Glu Gln Val Thr Arg

325 330 335

Lys Asn Met Leu Leu Ala Thr Lys Gln Ile Cys Lys Glu Phe Thr Asp

340 345 350

Leu Leu Ala Gln Asp Arg Ser Pro Leu Gly Asn Ser Arg Pro Asn Pro

355 360 365

Ile Leu Glu Pro Gly Ile Gln Ser Cys Leu Thr His Phe Asn Leu Ile

370 375 380

Ser His Gly Phe Gly Ser Pro Ala Val Cys Ala Ala Val Thr Ala Leu

385 390 395 400

Gln Asn Tyr Leu Thr Glu Ala Leu Lys Ala Met Asp Lys Met Tyr Leu

405 410 415

Ser Asn Asn Pro Asn Ser His Thr Asp Asn Asn Ala Lys Ser Ser Asp

420 425 430

Lys Glu Glu Lys His Arg Lys

435