ATRX-C抗体的制备及在HPV16阳性宫颈癌组织中的初步应用

摘要

[目的]研制和初步评价ATRX-C抗体；分析ATRX蛋白在THP-1细胞中的定位及ATRX在人乳头瘤病毒16型（HPV16）阳性宫颈癌组织中的表达和定位，为深入探讨ATRX蛋白在HPV16所致宫颈癌中的作用及机制奠定基础。
　　[方法]设计 ATRX C端基因片段(2193-2492氨基酸)引物，利用PCR扩增目的片段，双酶切后连接表达载体 pET30a，经 PCR、酶切、测序分析，构建原核表达载体pET30a/ATRX-C2193-2492；将质粒 pET30a/ATRX-C2193-2492转化 E.coli BL21，IPTG诱导表达，利用镍离子亲和层析法纯化6His-ATRX-C2193-2492蛋白，利用Western blot检测纯化产物6His-ATRX-C2193-2492；将纯化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白以皮下多点注射和腹腔注射方式免疫接种6只8周龄雌性BALB/c小鼠。初次免疫3周后，再免疫1次；第4、5周后分别再加强1次，共免疫接种4次。每次免疫前及末次免疫后7天取血，ELISA测定抗体效价。饱和硫酸铵盐析沉淀法初步纯化抗血清，并用Western blot检测之；利用间接免疫荧光检测Daxx和ATRX在THP-1细胞株中的分布与定位；收集正常宫颈组织细胞、HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变（CIN）、原位癌和浸润型宫颈癌组织标本，通过免疫组化技术检测宫颈组织中ATRX的分布和定位以及表达量；利用Western blot检测正常宫颈组织，HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变（CIN）、原位癌和浸润型宫颈癌组织细胞中ATRX的表达量。
　　[结果]经PCR、双酶切和测序鉴定，成功构建 pET30a/ATRX-C2193-2492原核表达载体；表达载体pET30a/ATRX-C2193-2492在 E.coli中诱导表达分子量约34kDa产物，且该产物能与ATRX抗体发生反应，并且纯化得到目的产物；利用纯化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白免疫小鼠，制备的抗ATRX-C2193-2492多克隆抗体，其效价为1:12800；在THP-1细胞中，ATRX显绿色信号和Daxx显红色信号，两种信号都定位于细胞核，融合时出现黄色信号；ATRX在正常宫颈组织细胞具有较高表达并主要定位在细胞核；在 HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变（CIN）组织细胞的表达与正常细胞类似；在原位癌组织细胞中表达量姣 CIN中减低，主要定位在细胞核和细胞浆；在浸润型宫颈癌组织细胞中表达量降低，主要定位在细胞浆，细胞核中表达量明显减少。
　　[结论]制备的ATRX-C2193-2492抗血清可用于检测组织和细胞中的ATRX蛋白；ATRX蛋白在THP-1细胞核和正常宫颈组织细胞中大量表达；在HPV16阳性所致的宫颈癌进程中，其表达量可能逐渐减少。

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第1章 绪 论

第2章 材料与试剂

2.1主要实验仪器

2.2 菌种、质粒和细胞株

2.3 主要实验试剂

第3章 实验方法

3.1 ATRX-C2193-2492片段的扩增

3.2 原核表达载体pET30a/ATRX-C2193-2492的构建

3.3 6His-ATRX-C2193-2492蛋白的诱导表达及其检测

3.4 6His-ATRX-C2193-2492抗体制备

3.5 ATRX-C2193-2492抗体的初步应用

3.6 宫颈组织中ATRX蛋白的表达

第4章 实验结果

4.1 PCR扩增ATRX-C2193-2492 片段

4.2 pET30a/ATRX-C2193-2492载体PCR及双酶切鉴定

4.3 融合蛋白6His-ATRX-C2193-2492的诱导表达与纯化及鉴定

4.4 ATRX-C2193-2492抗体的制备

4.5 ATRX-C2193-2492抗体的初步应用

4.6 ATRX蛋白在正常或异常宫颈组织中的表达

第5章 讨 论

第6章 结 论

参考文献

附件

综述:人乳头瘤病毒感染与肿瘤的相关性研究进展

读硕期间参与课题与论文

本研究基金资助

致谢