利用酿酒酵母生产异源大麻环萜酚的方法

摘要

本发明公开了一种能够生物合成大麻环萜酚酸的重组宿主细胞及其构建方法以及通过重组宿主细胞生物合成大麻环萜酚酸的方法，属于生物技术与医药领域。本发明以酿酒酵母为宿主，首先在宿主中过表达大麻萜酸合酶和大麻环萜酚酸合酶，然后在宿主中构建利用糖类合成大麻环萜酚酸的前体化合物橄榄醇酸的代谢途径，进一步在宿主中构建己酸到橄榄醇酸代谢途径，最后优化宿主内源甲羟戊酸途径和乙酰辅酶A的代谢途径，获得能够生物合成大麻环萜酚酸的重组酿酒酵母，提供了一种从廉价的碳源生产高附加值大麻环萜酚的新途径，生产效率高，周期短，成本低，有利于大麻环萜酚的大规模生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与医药领域，具体涉及能够生物合成大麻环萜酚(CBC)的宿主细胞及其构建方法和大麻环萜酚的生物合成方法。

背景技术

大麻(Cannabis sativa)由于其富含多种药理活性的大麻素已有数千年的应用历史。目前，已经从大麻植物中分离鉴定出超过113种大麻素并且被分为不同的类型，例如大麻萜酚型(cannabigerols，CBGs)，大麻环萜酚型(cannabichromenes，CBCs)，大麻二酚型(cannabidiols，CBDs)，Δ

目前，大麻环萜酚(CBC)和大麻萜酚(CBG)的获取途径主要通过从植物中提取或化学合成。然而化学合成工艺复杂、成本高并且产率很低。而大麻的农业种植面临若干挑战，例如植物对气候和疾病的敏感性、没有GAP标准化、大麻中的大麻环萜酚和大麻萜酚含量较低、占用耕地面积大且周期较长，而且与丰富的其他型大麻素共存，从植物中获得纯的样品费时费力，严重影响到其治疗潜力的研究。

微生物发酵具有生产效率高，周期短等优势，提供了一种从廉价的碳源生产大量高附加值产物的方法，同时，基于基因工程技术手段，通过对微生物的代谢通路改造获得具有特定功能的微生物也是近些年的研究热点，目前，通过基因工程手段获得能够生物合成大麻环萜酚酸的宿主细胞及其构建方法并将其用于大麻环萜酚酸的生物合成的相关研究还未见报道。

发明内容

本发明为解决大麻环萜酚和大麻环萜酚酸的制备方法复杂、成本高和产率低等问题，现提供以下技术方案。

本发明构建了能够生物合成大麻环萜酚酸重组酿酒酵母菌株，大麻环萜酚酸的生物合成途径中包含多个基因，一方面，优化酿酒酵母利用单糖通过其内源的甲羟戊酸途径合成大麻萜酚酸前体香叶基焦磷酸(GPP)；另一方面，构建了己酸到己酰基-CoA代谢途径，通过补给己酸利用酰基活化酶(CsAAE1)将己酸转化为己酰基-CoA，同时乙酰辅酶A羧化酶(ACC1)催化乙酰辅酶A产生丙二酰辅酶A，己酰基-CoA和三分子的丙二酰-CoA通过聚酮合酶(CsTKS)和橄榄酸环化酶(CsOAC)生成橄榄酸(OA)；此外，还构建了β-酮硫醇酶(RebktB)、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(CnpaaH1)、巴豆酸酶(Cacrt)以及反式-2-烯酰辅酶A还原酶(Tdter)代谢通路，使得酿酒酵母利用单糖通过乙酰辅酶A生成己酰辅酶A，然后通过聚酮合酶(CsTKS)和橄榄酸环化酶(CsOAC)生成橄榄酸(OA)，提高橄榄醇酸的产量。最后，通过大麻萜酸合酶(CsPT4)将香叶基焦磷酸(GPP)和橄榄酸(OA)生成大麻萜酚酸(CBGA)，通过大麻环萜酚合酶催化生成大麻环萜酚酸(CBCA)(如图1所示)。

本发明提供了一种合成大麻环萜酚酸(CBCA)重组酿酒酵母菌株，所述重组酿酒酵母菌株异源表达大麻萜酸合酶基因(CsPT4)和大麻环萜酚酸合酶基因(CBCAS)。

进一步地，所述重组酿酒酵母菌株过表达β-酮硫醇酶基因(RebktB)，3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因(CnpaaH1)，巴豆酸酶基因(Cacrt)以及反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因(Tdter)，大麻聚酮合酶基因(CsTKS)和橄榄酸环化酶基因(CsOAC)。

进一步地，所述重组酿酒酵母菌株过表达酰基活化酶基因(CsAAE1)和乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC1)。

进一步地，所述重组酿酒酵母菌株过表达HMG-辅酶A还原酶基因(tHMG1)、乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因(mvaE)、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因(mvaS)、香叶基二磷酸合成酶基因(ERG20mut)、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(ERG19)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IDI)。

进一步地，所述重组酿酒酵母菌株过表达乙醛脱氢酶基因(ALD6)、乙酰辅酶A合成酶基因(ACS2)和乙醇脱氢酶基因(ADH2)。

进一步地，大麻萜酸合酶基因、大麻环萜酚酸合酶基因、β-酮硫醇酶基因、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因、大麻聚酮合酶基因、橄榄酸环化酶基因、酰基活化酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因、HMG-辅酶A还原酶基因、乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因、香叶基二磷酸合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯基焦磷酸异构酶基因、乙醛脱氢酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因和乙醇脱氢酶基因来源于同源的或者异源的。

进一步地，大麻萜酸合酶基因来源于大麻，大麻环萜酚酸合酶基因来源于大麻；β-酮硫醇酶基因来源于罗尔斯通氏菌，3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因来源于钩虫贪铜菌，巴豆酸酶基因来源于丙酮丁醇梭菌，反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因来源于齿密螺旋体；大麻聚酮合酶基因来源于大麻，橄榄酸环化酶基因来源于大麻；酰基活化酶基因来源于大麻，乙酰辅酶A羧化酶基因来源于酿酒酵母，截短的HMG-辅酶A还原酶基因来源于酿酒酵母，乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因来源于粪肠球菌，羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因来源于粪肠球菌，香叶基二磷酸合成酶基因来源于酿酒酵母，甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸激酶基因(ERG8)来源于酿酒酵母，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因来源于酿酒酵母，异戊烯基焦磷酸异构酶基因来源于酿酒酵母；乙醛脱氢酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因和乙醇脱氢酶基因来源于酿酒酵母。

进一步地，大麻萜酸合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，大麻环萜酚酸合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；β-酮硫醇酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，巴豆酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，大麻聚酮合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，橄榄酸环化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；酰基活化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，乙酰辅酶A羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；HMG-辅酶A还原酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：11所示，乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，香叶基二磷酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，甲羟戊酸激酶基因(ERG12)的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，甲羟戊酸激酶基因(ERG8)的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，异戊烯基焦磷酸异构酶基因的核苷酸序列如SEQID NO：18所示；乙醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，乙酰辅酶A合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示，乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。

进一步地，大麻萜酸合酶基因、大麻环萜酚酸合酶基因、β-酮硫醇酶基因、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因、大麻聚酮合酶基因、橄榄酸环化酶基因、酰基活化酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因、HMG-辅酶A还原酶基因、乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因、香叶基二磷酸合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯基焦磷酸异构酶基因、乙醛脱氢酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因和乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列分别具有与SEQ ID NO：1-21所示的核苷酸具有至少70％、80％、90％、95％同源性且具有相应酶的活性功能。

进一步地，大麻萜酸合酶基因、大麻环萜酚酸合酶基因、β-酮硫醇酶基因、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因、大麻聚酮合酶基因、橄榄酸环化酶基因、酰基活化酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因、HMG-辅酶A还原酶基因、乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因、香叶基二磷酸合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯基焦磷酸异构酶基因、乙醛脱氢酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因和乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1-21所示的核苷酸经过一个或多个核苷酸序列的取代、替换或缺失得到的核苷酸序列，且具有相应酶的活性功能。

进一步地，大麻萜酸合酶基因、大麻环萜酚酸合酶基因、β-酮硫醇酶基因、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因、大麻聚酮合酶基因、橄榄酸环化酶基因、酰基活化酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因、HMG-辅酶A还原酶基因、乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因、香叶基二磷酸合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯基焦磷酸异构酶基因、乙醛脱氢酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因和乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列分别为能够在中度或高度或极高度条件下与SEQ ID NO：1-21所示的核苷酸序列杂交互补的核苷酸序列，且具有相应酶的活性功能。

进一步地，大麻萜酸合酶基因、大麻环萜酚酸合酶基因、β-酮硫醇酶基因、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因、大麻聚酮合酶基因、橄榄酸环化酶基因、酰基活化酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因、HMG-辅酶A还原酶基因、乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因、香叶基二磷酸合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯基焦磷酸异构酶基因、乙醛脱氢酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因和乙醇脱氢酶基因的核苷酸序列为部分或者全部经过密码子优化后的核苷酸序列。

进一步地，大麻萜酸合酶基因插入位点位于酵母基因组416d位点、CAN1y位点或YOLCd1b位点；大麻环萜酚酸合酶基因插入位点位于酵母基因组308a位点、HIS3b位点或511b位点。β-酮硫醇酶基因插入位点位于酵母基因组SAP155b位点；3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因和巴豆酸酶基因插入位点位于酵母基因组SAP155c位点；反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因插入位点位于酵母基因组YPRCδ15c位点；大麻聚酮合酶基因和橄榄酸环化酶基因插入位点位于酵母基因组1622b位点、X4位点、XI位点3或XII5位点；酰基活化酶基因插入位点位于酵母基因组911b位点；乙酰辅酶A羧化酶基因插入位点位于酵母基因组X3位点；截短的HMG-辅酶A还原酶基因和突变的香叶基二磷酸合成酶ERG20mut(F96W，N127W)插入位点位于酵母基因组1021b位点；乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因和羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因插入位点位于酵母基因组1414a位点；甲羟戊酸激酶基因(ERG12)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因插入位点位于酵母基因组1114a位点；甲羟戊酸激酶基因(ERG8)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因插入位点位于酵母基因组1014a位点；乙醛脱氢酶基因和乙酰辅酶A合成酶基因插入位点位于酵母基因组1309a位点；乙醇脱氢酶基因插入位点位于酵母基因组X2位点。

进一步地，上述基因的拷贝数分别为1～10个。

本发明另一方面提供了一种上述重组酿酒酵母菌株的构建方法，主要包括以下步骤：

1)分别构建大麻萜酸合酶基因和大麻环萜酚酸合酶基因表达盒，通过同源重组技术将上述表达盒插入到酿酒酵母的基因组中；

2)分别构建β-酮硫醇酶基因、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式-2-烯酰辅酶A还原酶基因、大麻聚酮合酶基因和橄榄酸环化酶基因表达盒，通过同源重组将上述表达盒插入到步骤(1)得到的酿酒酵母的基因组中；

3)分别构建酰基活化酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因表达盒，通过同源重组将上述表达盒插入到步骤(2)得到的酿酒酵母的基因组中；

4)分别构建HMG-辅酶A还原酶基因、乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因、羟甲基戊二酸辅酶A合成酶基因、香叶基二磷酸合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因和异戊烯基焦磷酸异构酶基因表达盒，通过同源重组将上述表达盒插入到步骤(3)得到的酿酒酵母的基因组中；

5)分别构建乙醛脱氢酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因和乙醇脱氢酶基因表达盒，通过同源重组将上述表达盒插入到步骤(4)得到的酿酒酵母的基因组中。

进一步地，同源重组使用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。

进一步地，所述的同源重组使用CRISPR/Cas系统。

进一步地，上述基因的启动子分别为组成型启动子或诱导型启动子。

进一步地，所述启动子为GAL1、GAL10、GPD、TEF1、PGK1或ADH。

本发明提供了一种利用上述重组酿酒酵母发酵生产大麻环萜酚酸的方法，所述方法主要包括以下步骤：

1)在合适的培养基中培养上述重组酿酒酵母细胞一段时间；

2)回收发酵产生的大麻环萜酚酸；

3)通过加热或者长期储存使得大麻环萜酚酸脱羧形成大麻环萜酚。

进一步地，所述的培养基为YPD培养基。

进一步地，所述的培养基还包括己酸或橄榄醇酸。

进一步地，培养条件为转速50～300rpm，温度28～32℃，培养时间为24-120h。

进一步地，回收发酵产生的大麻环萜酚酸过程包括使用有机溶剂萃取发酵液中的大麻环萜酚酸步骤。

进一步地，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、己烷、庚烷、石油醚、或氯仿中的一种或多种混合物。

进一步地，回收发酵产生的大麻环萜酚酸过程包括破碎发酵得到的重组酿酒酵母过程。

进一步地，所述的破碎方法为高压均质破碎法、超声波破碎法、球磨破碎法、反复冻融破碎法或酶溶破碎法。

进一步地，萃取过程中所述的有机溶剂与发酵液的体积比1:1～1:20。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

1.本发明公开了一种能够生物合成大麻环萜酚酸的重组酿酒酵母菌株，提供了一种从廉价的碳源生产大量高附加值大麻环萜酚的新途径。

2.本发明构建生物合成大麻环萜酚酸的重组酿酒酵母菌株方法准确高效，所得到的重组酿酒酵母菌株遗传性能稳定。

3.本发明公开的重组酿酒酵母发酵生产大麻环萜酚酸的方法生产效率高，周期短，成本低，有利于大麻环萜酚的大规模生产和医药领域应用的拓展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1重组酿酒酵母大麻环萜酚酸生物合成途径图谱，其中，CsAAE1：酰基活化酶，ACC1：乙酰辅酶A羧化酶，RebktB：β-酮硫醇酶，CnpaaH1：3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶，Cacrt：巴豆酸酶，Tdter：反式-2-烯酰辅酶A还原酶，CsTKS：聚酮合酶，CsOAC：橄榄酸环化酶，CsPT4：橄榄醇酸香叶基转移酶，CBCAS：大麻环萜酚酸合酶。

图2GPP生物合成通路示意图。

图3重组酿酒酵母发酵生产的大麻环萜酚酸的液相色谱图，其中，上图：大麻环萜酚酸标准品LC-MS的液相色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为丰度；下图：大麻环萜酚酸重组基因工程菌株发酵样品LC-MS的液相色谱图。

图4重组酿酒酵母发酵生产的大麻环萜酚酸的质谱谱图，横坐标为M/Z，纵坐标为丰度。上图:大麻环萜酚酸标准品在的LC-MS质谱图；下图：大麻环萜酚酸重组基因工程菌株发酵样品的LC-MS质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

实施例1

构建能够表达大麻萜酸合酶和大麻环萜酚酸合酶的重组酵母菌株

本发明的宿主菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1，二倍体的INVSc1具有较高的鲁棒性，其复杂的基因调控网络有利于不利环境条件下酶的表达与催化。本发明基于发现香叶基焦磷酸(GPP)和橄榄醇酸(OA)在大麻萜酸合酶(CsPT4)的作用下生成大麻萜酚酸(CBGA)，大麻萜酚酸(CBGA)通过大麻环萜酚合酶(CBCAS)催化形成大麻环萜酚酸(CBCA)，构建2个基因表达盒：经过密码子优化的CsPT4基因表达盒和经过密码子优化的CBCAS基因表达盒，CsPT4基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，CBCAS基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，通过基因编辑技术将CsPT4基因表达盒整合到酿酒酵母的416d，CAN1y和YOLCd1b基因组位点；将CBCAS基因表达盒分别整合到酿酒酵母的308a，HIS3b和511b基因组位点，表达3个拷贝的CsPT4基因和CBCAS基因，获得能够表达大麻萜酸合酶和大麻环萜酚酸合酶的重组酿酒酵母菌株。

实施例2

构建能够利用糖类产大麻环萜酚酸的重组酵母菌株

为使得实施例1的重组酿酒酵母中能够生物合成橄榄醇酸，在上述重组酿酒酵母中构建利用糖类通过己酰辅酶A生成橄榄醇酸生物代谢合成途径。构建6个经过密码子优化基因表达盒：RebktB基因表达盒，CnpaaH1基因表达盒，Cacrt基因表达盒，Tdter基因表达盒，CsTKS基因表达盒和CsOAC基因表达盒。RebktB基因表达盒使用TEF1启动子和TEF1终止子，CnpaaH1基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，Cacrt基因表达盒使用GAL1启动子和ADH1终止子，Tdter基因表达盒使用PGK1启动子和HXT7终止子，CsTKS基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，CsOAC基因表达盒使用GAL1启动子和ADH1终止子。通过基因编辑技术，将RebktB基因表达盒整合到酿酒酵母SAP155b基因组位点，将CnpaaH1基因表达盒和Cacrt基因表达盒整合到酿酒酵母SAP155c基因组位点，将Tdter基因表达盒整合到酿酒酵母YPRCδ15c基因组位点，分别表达1个拷贝上述基因。将CsOAC基因表达盒和CsTKS基因表达盒组成一个表达盒组分别整合到酿酒酵母的1622b，X4，XI3，XII5基因组位点，表达4个拷贝上述基因，最终获得能够利用糖类产大麻环萜酚酸的重组酿酒酵母菌株。

实施例3

构建重组酿酒酵母中己酸到橄榄醇酸生物代谢合成途径

为了增加实施例2的重组酿酒酵母的己酰辅酶A的通量，构建重组酿酒酵母中己酸到橄榄醇酸生物代谢合成途径，构建2个基因表达盒：经过密码子优化CsAAE1基因表达盒和ACC1基因表达盒，CsAAE1和ACC1基因表达盒均使用GPD启动子和CYC1终止子，通过基因编辑技术，将ACC1基因表达盒整合到酿酒酵母X3基因组位点，过表达1个拷贝上述基因；将CsAAE1基因表达盒整合到酿酒酵母208a，911b和106a基因组位点表达3个拷贝上述基因，通过补给己酸，在CsAAE1的催化下将己酸转化为己酰辅酶A。同时，乙酰辅酶A通过ACC1催化产生的丙二酰辅酶A，己酰辅酶A与丙二酰辅酶A在大麻聚酮合酶(CsTKS)和橄榄酸环化酶(CsOAC)的作用下生成橄榄醇酸，从而提高重组酿酒酵母生物合成大麻环萜酚酸的产量。

实施例4

优化重组酿酒酵母内源甲羟戊酸途径

为了增加实施例3的重组酿酒酵母GPP的通量，进一步优化重组酿酒酵母内源甲羟戊酸途径，构建8个基因表达盒：截短的tHMG1基因表达盒，经过密码子优化的mvaE基因表达盒，mvaS基因表达盒，ERG20mut(F96W，N127W)基因表达盒，ERG12基因表达盒，ERG8基因表达盒，ERG19基因表达盒和IDI基因表达盒。tHMG1基因表达盒使用GAL1启动子和ADH1终止子，mvaE基因表达盒使用GAL1启动子和ADH1终止子，mvaS基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，ERG20mut基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，ERG12基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，ERG8基因表达盒使用GAL1启动子和ADH1终止子，ERG19基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，IDI基因表达盒使用GAL1启动子和ADH1终止子。通过基因编辑技术，将tHMG1基因表达盒和ERG20mut基因表达盒整合到酿酒酵母的1021b基因组位点，将mvaE基因表达盒和mvaS基因表达盒整合到酿酒酵母的1414a基因组位点，将ERG12基因表达盒和IDI基因表达盒整合到酿酒酵母的1114a基因组位点，将ERG8基因表达盒和ERG19基因表达盒整合到酿酒酵母的1014a基因组位点，过表达1个拷贝上述基因，从而保证重组酿酒酵母中甲羟戊酸下游途径中香叶基焦磷酸的供给。

实施例5

优化重组酿酒酵母乙酰辅酶A的代谢途径

为了增加实施例4的重组酿酒酵母细胞质中乙酰辅酶A的代谢通量，从NCBI数据库获得Saccharomyces cerevisiae来源的乙醛脱氢酶(ALD6)、乙酰辅酶A合成酶(ACS2)和乙醇脱氢酶(ADH2)，构建3个基因表达盒：ALD6基因表达盒、ACS2基因表达盒和ADH2基因表达盒。ALD6基因表达盒使用GAL10启动子和CYC1终止子，ACS2基因表达盒使用GAL1启动子和ADH1终止子，ADH2基因表达盒使用GPD启动子和CYC1终止子。通过基因编辑技术，将ALD6基因表达盒和ACS2基因表达盒整合到酿酒酵母的1309a基因组位点，将ADH2基因表达盒整合到酿酒酵母的X2基因组位点，过表达1个拷贝上述基因，提高重组酿酒酵母细胞质中乙酰辅酶A通量，为甲羟戊酸途径、橄榄醇酸以及大麻环萜酚酸的生物合成提供前体化合物。

实施例6

重组酿酒酵母菌株发酵产大麻环萜酚酸

将实施例2获得的高产大麻环萜酚酸重组酿酒酵母菌株挑到含有3-5mL YPD(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L右旋葡萄糖)的试管中。于200rpm，30℃培养24h，直到培养基中葡萄糖耗尽。将生长饱和的菌株4500rpm离心传代培养到含有100mL YPG(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L半乳糖)的新的培养基中，200rpm，30℃培养24-48h。将发酵液或高压匀浆破碎的菌体液于4500rpm离心5min后取上清液，使用上清液1/5体积的有机溶剂乙酸乙酯萃取(5体积的发酵液加1体积的乙酸乙酯)，离心取有机层进行旋蒸，得到大麻环萜酚酸粗品，于105℃加热15分钟，然后加热至145℃持续55分钟后获得大麻环萜酚。

实施例7

重组酵母菌株发酵产大麻环萜酚酸

将实施例5获得的高产大麻环萜酚酸重组酿酒酵母菌株挑到含有3-5mL YPD(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L右旋葡萄糖)的试管中。将细胞在于200rpm，30℃培养24h，直到培养基中葡萄糖耗尽。将生长饱和的菌株4500rpm离心传代培养到含有100mL YPG(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L半乳糖、1mM橄榄醇酸或2mM己酸)的新的培养基中，200rpm，30℃培养24-48h。将发酵液或高压匀浆破碎的菌体液于4500rpm离心5min后取上清液，使用上清液1/5体积的有机溶剂乙酸乙酯萃取(5体积的发酵液加1体积的乙酸乙酯)，离心取有机层进行旋蒸，得到大麻环萜酚酸粗品，于105℃加热15分钟，然后加热至145℃持续55分钟后获得大麻环萜酚。

实施例8

大麻环萜酚的鉴定方法

将发酵液或高压匀浆破碎的菌体液于4500rpm离心5min后取上清液，使用上清液1/5体积的有机溶剂乙酸乙酯萃取(5体积的发酵液加1体积的乙酸乙酯)，离心取有机层进行旋蒸，将蒸发后的物质重悬于乙腈/0.05％甲酸水溶液(80％/20％v/v)的混合溶液中，用有机滤膜过滤后，获得含有大麻萜酚酸的高浓度有机相，通过液相色谱/飞行时间质谱联用仪进行检测分析，结果如图3和图4所示。

大麻环萜酚酸检测分析相关仪器设备和实验参数如下：仪器为安捷伦6224TOFLC/MS，柱温25℃，色谱柱为安捷伦C

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连理工大学

<120> 利用酿酒酵母生产异源大麻环萜酚的方法

<130> 20201201

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1213

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcaataata atcttcatgg gattgtcttt ggtttgtact ttttcttttc aaaccaatta 60

tcataccctt ttgaatccac acaacaaaaa tccaaaaaat tctcttttga gttatcaaca 120

tccaaaaact ccaattatta aaagttctta tgataatttc ccatctaaat actgtcttac 180

taaaaatttc catttgttgg gtcttaatag tcataataga atctcttctc agtctaggag 240

tattagagcc ggttctgacc aaatcgaggg atctccacac cacgagtctg acaacagtat 300

cgccaccaag atcttgaact tcggtcacac ttgttggaag cttcagaggc catacgtcgt 360

caagggtatg atctctattg cttgtggtct tttcggtagg gagcttttca acaatagaca 420

cttgttctct tggggtctta tgtggaaggc cttcttcgcc cttgtcccaa tcctttcttt 480

caactttttt gctgctatta tgaatcaaat ttatgacgtc gacatcgata ggatcaacaa 540

gccagacttg cctcttgtct ctggagagat gtctatcgag accgcttgga tcttgagtat 600

catcgtcgcc cttaccggtt tgattgttac catcaaattg aaaagtgctc ctctttttgt 660

ttttatttac atcttcggaa tctttgccgg tttcgcctac tctgtcccac ctatcagatg 720

gaagcagtac ccattcacta attttttgat caccattagt tctcacgtcg gacttgcctt 780

cacctcttac tctgccacta cctctgcctt gggtttgcca ttcgtctgga gaccagcctt 840

ttctttcatc atcgccttca tgaccgtcat gggaatgacc atcgccttcg ccaaagacat 900

ctctgacatc gagggtgatg ccaagtacgg tgtttctacc gtcgccacca agttgggtgc 960

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tatcggaatc atctggccac aagttttcaa atctaatatt atgatccttt ctcatgccat 1080

cttggccttt tgtttgatct tccagactag agagttggcc ttggccaact acgccagtgc 1140

cccatctaga caattcttcg aattcatttg gcttctttat tatgccgaat attttgttta 1200

tgtctttatt taa 1213

<210> 2

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgatttttg atggtactac tatgtctatt gctattggtt tgttgtctac tttgggtatt 60

ggtgctgaag ctatttccat agctaaccca caagaaaatt tcttaaaatg tttttctgag 120

tatattccaa ataatcctgc taatccaaag tttatttata ctcaacatga tcaattatat 180

atgagtgtgc tgaactctac tattcaaaat ctgagattta cttctgatac tactccaaaa 240

ccattggtta ttgttactcc atctaatgtt tctcatattc aagcttctat tttgtgttct 300

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tatatttctc aagttccatt tgctattgtt gatttgagaa atatgcatac tgttaaagtt 420

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tggattaatg aaatgaatga aaatttttct tttcctggtg gttattgtcc aactgtgggt 540

gttggtggtc atttttctgg tggtggttat ggtgctttga tgagaaatta tggtttggct 600

gctgataata ttattgatgc tcatttggtt aatgttgatg gtaaagtttt ggatagaaaa 660

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aagaaaaata tggaaattca tggtttggtt aaattgttca ataaatggca gaatattgct 840

tataaatatg ataaggactt gatgttgact acccatttta ggactagaaa cattactgat 900

aatcatggta agaacaaaac tactgttcat ggttattttt cttctatttt tttgggtggt 960

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<210> 3

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgactaggg aggtcgttgt tgtctctggt gttagaaccg ccatcggtac cttcggtggt 60

agtcttaagg acgtcgcccc agccgaattg ggtgctcttg tcgttagaga agcccttgct 120

agagcccaag tctctggaga tgatgtcgga cacgtcgtct tcggtaacgt catccaaacc 180

gagccaaggg atatgtacct tggtagagtc gctgccgtca atggtggtgt taccatcaac 240

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ttggagagtc acagaagagc ttctgctgcc atcaaggccg gatacttcaa ggaccagatc 600

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<212> DNA

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<400> 4

atgagtatca gaaccgtcgg tatcgtcgga gctggtacca tgggaaatgg aatcgcccaa 60

gcttgtgccg tcgttggatt gaacgtcgtc atggtcgaca tcagtgatgc cgctgttcaa 120

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<210> 5

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggagttga ataacgttat ccttgagaag gagggaaagg tcgctgttgt caccatcaat 60

agacctaagg ccttgaacgc ccttaactct gacaccttga aggagatgga ttatgttatt 120

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgattgtta aaccaatggt taggaataac atctgcttga acgcccaccc tcaaggttgt 60

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gctggtgcca aagcccctaa gaacgtcttg gtcttgggat gctctaacgg atacggtttg 180

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<210> 7

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<212> DNA

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<400> 7

atgaatcatt tgagggccga gggaccagct agtgttttgg ccatcggtac cgccaaccca 60

gaaaacatcc ttttgcaaga tgaatttcca gattattatt tcagagttac caagagtgaa 120

catatgactc aattgaagga aaagtttaga aaaatttgtg ataagtctat gattaggaaa 180

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggctgtta aacatttgat cgttttgaaa ttcaaggacg agatcaccga agcccagaag 60

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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atcaccagtg aggtcgctga aacccttcac ggtagacttg ccgagattgt ctgcaactac 120

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ccagcttgga ttccagaccc agagaaagtc aagagtacca acttgggagc ccttcttgaa 300

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<400> 10

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tactcagaaa gacatacaga acttccaggt catttcattg gcctcaatac agtagataaa 120

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tgggcatacg agacgttcgg cgatgacaga accgtccaat tcgtcgccat ggccacccca 300

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ggtggtacta ataataacaa ctacgctaac gtagacttga tcgtagacat cgccgaaaga 420

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aggtctttag gtgataaaat ctcctctacc attgtcgctc aaagtgctaa agtcccatgt 600

attccatggt ctggtaccgg tgttgacacc gttcacgtgg acgagaaaac cggtctggtc 660

tctgtcgacg atgacatcta tcaaaagggt tgttgtacct ctcctgaaga tggtttacaa 720

aaggccaagc gtattggttt tcctgtcatg attaaggcat ccgaaggtgg tggtggtaaa 780

ggtatcagac aagttgaacg tgaagaagat ttcatcgctt tataccacca ggcagccaac 840

gaaattccag gctcccccat tttcatcatg aagttggccg gtagagcgcg tcacttggaa 900

gttcaactgc tagcagatca gtacggtaca aatatttcct tgttcggtag agactgttcc 960

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ctgatcctag ctatcttgaa acattatcaa ccattgtgca agttatcttc taaagtttct 3000

gccattttct ctactcctct acaacatatt gttgaactag aatctaaggc taccgctaag 3060

gtcgctctac aagcaagaga aattttgatt caaggcgctt taccttcggt caaggaaaga 3120

actgaacaaa ttgaacatat cttaaaatcc tctgttgtga aggttgccta tggctcatcc 3180

aatccaaagc gctctgaacc agatttgaat atcttgaagg acttgatcga ttctaattac 3240

gttgtgttcg atgttttact tcaattccta acccatcaag acccagttgt gactgctgca 3300

gctgctcaag tctatattcg tcgtgcttat cgtgcttaca ccataggaga tattagagtt 3360

cacgaaggtg tcacagttcc aattgttgaa tggaaattcc aactaccttc agctgcgttc 3420

tccacctttc caactgttaa atctaaaatg ggtatgaaca gggctgttgc tgtttcagat 3480

ttgtcatatg ttgcaaacag tcagtcatct ccgttaagag aaggtatttt gatggctgtg 3540

gatcatttag atgatgttga tgaaattttg tcacaaagtt tggaagttat tcctcgtcac 3600

caatcttctt ctaacggacc tgctcctgat cgttctggta gctccgcatc gttgagtaat 3660

gttgctaatg tttgtgttgc ttctacagaa ggtttcgaat ctgaagagga aattttggta 3720

aggttgagag aaattttgga tttgaataag caggaattaa tcaatgcttc tatccgtcgt 3780

atcacattta tgttcggttt taaagatggg tcttatccaa agtattatac ttttaacggt 3840

ccaaattata acgaaaatga aacaattcgt cacattgagc cggctttggc cttccaactg 3900

gaattaggaa gattgtccaa cttcaacatt aaaccaattt tcactgataa tagaaacatc 3960

catgtctacg aagctgttag taagacttct ccattggata agagattctt tacaagaggt 4020

attattagaa cgggtcatat ccgtgatgac atttctattc aagaatatct gacttctgaa 4080

gctaacagat tgatgagtga tatattggat aatttagaag tcaccgacac ttcaaattct 4140

gatttgaatc atatcttcat caacttcatt gcggtgtttg atatctctcc agaagatgtc 4200

gaagccgcct tcggtggttt cttagaaaga tttggtaaga gattgttgag attgcgtgtt 4260

tcttctgccg aaattagaat catcatcaaa gatcctcaaa caggtgcccc agtaccattg 4320

cgtgccttga tcaataacgt ttctggttat gttatcaaaa cagaaatgta caccgaagtc 4380

aagaacgcaa aaggtgaatg ggtatttaag tctttgggta aacctggatc catgcattta 4440

agacctattg ctactcctta ccctgttaag gaatggttgc aaccaaaacg ttataaggca 4500

cacttgatgg gtaccacata tgtctatgac ttcccagaat tattccgcca agcatcgtca 4560

tcccaatgga aaaatttctc tgcagatgtt aagttaacag atgatttctt tatttccaac 4620

gagttgattg aagatgaaaa cggcgaatta actgaggtgg aaagagaacc tggtgccaac 4680

gctattggta tggttgcctt taagattact gtaaagactc ctgaatatcc aagaggccgt 4740

caatttgttg ttgttgctaa cgatatcaca ttcaagatcg gttcctttgg tccacaagaa 4800

gacgaattct tcaataaggt tactgaatat gctagaaagc gtggtatccc aagaatttac 4860

ttggctgcaa actcaggtgc cagaattggt atggctgaag agattgttcc actatttcaa 4920

gttgcatgga atgatgctgc caatccggac aagggcttcc aatacttata cttaacaagt 4980

gaaggtatgg aaactttaaa gaaatttgac aaagaaaatt ctgttctcac tgaacgtact 5040

gttataaacg gtgaagaaag atttgtcatc aagacaatta ttggttctga agatgggtta 5100

ggtgtcgaat gtctacgtgg atctggttta attgctggtg caacgtcaag ggcttaccac 5160

gatatcttca ctatcacctt agtcacttgt agatccgtcg gtatcggtgc ttatttggtt 5220

cgtttgggtc aaagagctat tcaggtcgaa ggccagccaa ttattttaac tggtgctcct 5280

gcaatcaaca aaatgctggg tagagaagtt tatacttcta acttacaatt gggtggtact 5340

caaatcatgt ataacaacgg tgtttcacat ttgactgctg ttgacgattt agctggtgta 5400

gagaagattg ttgaatggat gtcttatgtt ccagccaagc gtaatatgcc agttcctatc 5460

ttggaaacta aagacacatg ggatagacca gttgatttca ctccaactaa tgatgaaact 5520

tacgatgtaa gatggatgat tgaaggtcgt gagactgaaa gtggatttga atatggtttg 5580

tttgataaag ggtctttctt tgaaactttg tcaggatggg ccaaaggtgt tgtcgttggt 5640

agagcccgtc ttggtggtat tccactgggt gttattggtg ttgaaacaag aactgtcgag 5700

aacttgattc ctgctgatcc agctaatcca aatagtgctg aaacattaat tcaagaacct 5760

ggtcaagttt ggcatccaaa ctccgccttc aagactgctc aagctatcaa tgactttaac 5820

aacggtgaac aattgccaat gatgattttg gccaactgga gaggtttctc tggtggtcaa 5880

cgtgatatgt tcaacgaagt cttgaagtat ggttcgttta ttgttgacgc attggtggat 5940

tacaaacaac caattattat ctatatccca cctaccggtg aactaagagg tggttcatgg 6000

gttgttgtcg atccaactat caacgctgac caaatggaaa tgtatgccga cgtcaacgct 6060

agagctggtg ttttggaacc acaaggtatg gttggtatca agttccgtag agaaaaattg 6120

ctggacacca tgaacagatt ggatgacaag tacagagaat tgagatctca attatccaac 6180

aagagtttgg ctccagaagt acatcagcaa atatccaagc aattagctga tcgtgagaga 6240

gaactattgc caatttacgg acaaatcagt cttcaatttg ctgatttgca cgataggtct 6300

tcacgtatgg tggccaaggg tgttatttct aaggaactgg aatggaccga ggcacgtcgt 6360

ttcttcttct ggagattgag aagaagattg aacgaagaat atttgattaa aaggttgagc 6420

catcaggtag gcgaagcatc aagattagaa aagatcgcaa gaattagatc gtggtaccct 6480

gcttcagtgg accatgaaga tgataggcaa gtcgcaacat ggattgaaga aaactacaaa 6540

actttggacg ataaactaaa gggtttgaaa ttagagtcat tcgctcaaga cttagctaaa 6600

aagatcagaa gcgaccatga caatgctatt gatggattat ctgaagttat caagatgtta 6660

tctaccgatg ataaagaaaa attgttgaag actttgaaat aa 6702

<210> 11

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atggctgcag accaattggt gaaaactgaa gtcaccaaga agtcttttac tgctcctgta 60

caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat aaaacagtca tttctggatc gaaagtcaaa 120

agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca ggaccttcat catctagtga ggaagatgat 180

tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa atacgtcctt tagaagaatt agaagcatta 240

ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac 300

ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg atactacgag agcggttgcg 360

gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta 420

ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt 480

tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta tcgatggtac atcttatcat 540

ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca 600

atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg atggtatgac aagaggccca 660

gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa 720

gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat caagatttgc acgtctgcaa 780

catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga gatttagaac aactactggt 840

gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta 900

gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac 960

aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct 1020

actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag 1080

ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140

gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200

aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260

tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320

caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380

aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440

tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500

gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560

tccgtcacct gcattaaatc ctaa 1584

<210> 12

<211> 2412

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgaaaaccg tcgtcatcat cgatgctctt aggactccaa tcggtaaata taagggaagt 60

ctttctcaag ttagtgccgt cgaccttggt actcacgtca ccacccagtt gcttaagagg 120

cactctacca tcagtgaaga gatcgaccaa gttattttcg gtaacgtctt gcaagctgga 180

aatggtcaga acccagctag gcaaatcgcc atcaacagtg gtttgtctca cgagatccca 240

gctatgactg tcaacgaagt ctgcggatct ggtatgaagg ccgtcatcct tgctaagcag 300

cttatccagt tgggagaggc tgaggtcttg atcgccggtg gaatcgagaa catgagtcaa 360

gctcctaagc ttcagagatt caactacgag accgagtctt atgacgcccc tttcagttct 420

atgatgtacg acggattgac cgacgctttc tctggacaag ccatgggtct tactgccgag 480

aatgtcgccg agaagtacca tgttactaga gaggagcaag accagttcag tgttcactct 540

cagcttaagg ctgcccaagc tcaagccgag ggaattttcg ctgacgaaat cgcccctctt 600

gaagtctctg gaacccttgt cgagaaggac gagggaatca gacctaactc ttctgtcgaa 660

aagcttggta ccttgaagac cgtcttcaag gaagacggaa ccgttaccgc cggtaatgcc 720

agtaccatca atgacggtgc cagtgctttg atcattgcta gtcaagaata tgccgaggcc 780

cacggtttgc cttacttggc catcattaga gactctgtcg aggttggtat cgacccagct 840

tacatgggta tctctcctat taaggctatc caaaaacttt tggctagaaa ccaacttacc 900

accgaagaga ttgatttgta cgagatcaat gaggctttcg ctgccaccag tattgtcgtc 960

cagagggagt tggccttgcc agaggagaag gttaacatct acggtggtgg tatctctttg 1020

ggtcatgcta tcggtgctac cggtgctaga ttgttgacct ctctttctta ccaattgaac 1080

cagaaggaga agaagtatgg agtcgccagt ctttgcatcg gtggtggatt gggtcttgct 1140

atgcttttgg agaggccaca gcagaagaaa aacagtagat tttatcagat gagtccagaa 1200

gagagattgg cctctctttt gaacgaagga cagatctctg ccgacaccaa gaaggagttt 1260

gagaataccg ctttgtctag tcaaatcgct aaccatatga ttgagaatca aatcagtgaa 1320

accgaggttc caatgggtgt cggtttgcat ttgactgtcg acgagactga ctacttggtt 1380

ccaatggcta ccgaggaacc tagtgtcatc gctgctcttt ctaacggtgc caagatcgcc 1440

caaggtttta agaccgtcaa ccagcaaaga ttgatgaggg gacagatcgt cttttacgac 1500

gtcgccgatg ccgaatctct tatcgacgaa cttcaagtta gagagaccga gatcttccaa 1560

caagctgagc tttcttaccc atctatcgtc aagagaggag gaggattgag ggaccttcag 1620

tatagggcct tcgacgagtc tttcgtcagt gtcgacttct tggtcgatgt caaggatgcc 1680

atgggtgcca acatcgtcaa cgccatgttg gagggtgtcg ccgagttgtt tagggagtgg 1740

ttcgctgaac aaaaaattct ttttagtatc ctttctaact acgccaccga gagtgtcgtc 1800

actatgaaga ccgctatccc agtttctaga cttagtaagg gatctaacgg aagggagatc 1860

gccgaaaaga ttgtccttgc ctctaggtac gcctctttgg acccttatag ggccgtcacc 1920

cacaataagg gaatcatgaa cggtattgag gccgttgtcc ttgccactgg aaacgatacc 1980

agagctgtct ctgcctcttg ccatgccttc gccgttaaag agggaaggta ccaaggtctt 2040

acctcttgga ccttggacgg agagcagttg atcggtgaga tcagtgtccc tttggctctt 2100

gctactgtcg gtggagccac caaggttttg ccaaagagtc aagccgccgc tgaccttttg 2160

gccgtcaccg acgctaagga gttgagtagg gttgtcgccg ctgtcggtct tgctcagaac 2220

cttgctgctc ttagggccct tgtctctgag ggaatccaga agggacacat ggctcttcaa 2280

gctaggagtc ttgccatgac cgtcggagcc actggtaaag aggttgaggc tgtcgcccag 2340

caacttaaga gacagaaaac catgaaccaa gatagggctt tggctatctt gaatgatttg 2400

agaaaacaat aa 2412

<210> 13

<211> 1152

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgactattg gtattgataa aatttctttc ttcgttccac catactacat cgacatgacc 60

gccttggctg aagccagaaa cgtcgacccc ggtaagttcc acatcggaat cggacaagac 120

cagatggctg tcaaccctat cagtcaagat atcgtcacct tcgctgctaa cgctgccgaa 180

gccatcttga ccaaggagga taaggaggcc attgacatgg tcatcgtcgg aaccgagagt 240

agtatcgacg agtctaaggc cgctgctgtc gtccttcata gattgatggg tatccagcct 300

ttcgctagat ctttcgagat caaggaggct tgttacggtg ctaccgctgg acttcagttg 360

gccaagaatc atgtcgccct tcacccagat aagaaggttt tggtcgttgc cgccgatatc 420

gccaagtacg gattgaacag tggaggtgag ccaacccaag gtgccggtgc cgttgccatg 480

ttggtcgcct ctgaacctag aattttggct cttaaggagg acaacgtcat gcttacccaa 540

gatatctacg acttctggag acctaccggt cacccatacc caatggtcga cggaccattg 600

agtaacgaga cctacattca gtctttcgcc caagtttggg atgaacacaa gaagaggacc 660

ggtttggact tcgctgatta cgatgccttg gccttccata tcccatacac caaaatggga 720

aaaaaggccc ttcttgccaa aatctctgac cagaccgagg ctgagcaaga aaggatcttg 780

gctagatacg aagagtctat catctactct agaagggtcg gtaacttgta caccggttct 840

ctttacttgg gtttgatctc tttgttggag aacgctacca cccttaccgc cggaaaccag 900

atcggtttgt tcagttacgg ttctggagcc gttgccgaat tcttcactgg tgagcttgtc 960

gccggttacc agaatcacct tcagaaggag acccatcttg cccttttgga caacagaacc 1020

gagcttagta tcgccgagta cgaggccatg ttcgctgaga ctcttgacac cgacatcgac 1080

caaacccttg aggatgaatt gaagtattct atctctgcta ttaacaatac tgttagaagt 1140

tatagaaact aa 1152

<210> 14

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60

gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120

gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180

gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240

aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttactggtt ggtcgccgat 300

gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

gttggggaaa ttgccatctg ggacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420

aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480

accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540

gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600

tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660

gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720

gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780

gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840

aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900

attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960

gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020

actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059

<210> 15

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgtcattac cgttcttaac ttctgcaccg ggaaaggtta ttatttttgg tgaacactct 60

gctgtgtaca acaagcctgc cgtcgctgct agtgtgtctg cgttgagaac ctacctgcta 120

ataagcgagt catctgcacc agatactatt gaattggact tcccggacat tagctttaat 180

cataagtggt ccatcaatga tttcaatgcc atcaccgagg atcaagtaaa ctcccaaaaa 240

ttggccaagg ctcaacaagc caccgatggc ttgtctcagg aactcgttag tcttttggat 300

ccgttgttag ctcaactatc cgaatccttc cactaccatg cagcgttttg tttcctgtat 360

atgtttgttt gcctatgccc ccatgccaag aatattaagt tttctttaaa gtctacttta 420

cccatcggtg ctgggttggg ctcaagcgcc tctatttctg tatcactggc cttagctatg 480

gcctacttgg gggggttaat aggatctaat gacttggaaa agctgtcaga aaacgataag 540

catatagtga atcaatgggc cttcataggt gaaaagtgta ttcacggtac cccttcagga 600

atagataacg ctgtggccac ttatggtaat gccctgctat ttgaaaaaga ctcacataat 660

ggaacaataa acacaaacaa ttttaagttc ttagatgatt tcccagccat tccaatgatc 720

ctaacctata ctagaattcc aaggtctaca aaagatcttg ttgctcgcgt tcgtgtgttg 780

gtcaccgaga aatttcctga agttatgaag ccaattctag atgccatggg tgaatgtgcc 840

ctacaaggct tagagatcat gactaagtta agtaaatgta aaggcaccga tgacgaggct 900

gtagaaacta ataatgaact gtatgaacaa ctattggaat tgataagaat aaatcatgga 960

ctgcttgtct caatcggtgt ttctcatcct ggattagaac ttattaaaaa tctgagcgat 1020

gatttgagaa ttggctccac aaaacttacc ggtgctggtg gcggcggttg ctctttgact 1080

ttgttacgaa gagacattac tcaagagcaa attgacagct tcaaaaagaa attgcaagat 1140

gattttagtt acgagacatt tgaaacagac ttgggtggga ctggctgctg tttgttaagc 1200

gcaaaaaatt tgaataaaga tcttaaaatc aaatccctag tattccaatt atttgaaaat 1260

aaaactacca caaagcaaca aattgacgat ctattattgc caggaaacac gaatttacca 1320

tggacttcat aa 1332

<210> 16

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgtcagagt tgagagcctt cagtgcccca gggaaagcgt tactagctgg tggatattta 60

gttttagata caaaatatga agcatttgta gtcggattat cggcaagaat gcatgctgta 120

gcccatcctt acggttcatt gcaagggtct gataagtttg aagtgcgtgt gaaaagtaaa 180

caatttaaag atggggagtg gctgtaccat ataagtccta aaagtggctt cattcctgtt 240

tcgataggcg gatctaagaa ccctttcatt gaaaaagtta tcgctaacgt atttagctac 300

tttaaaccta acatggacga ctactgcaat agaaacttgt tcgttattga tattttctct 360

gatgatgcct accattctca ggaggatagc gttaccgaac atcgtggcaa cagaagattg 420

agttttcatt cgcacagaat tgaagaagtt cccaaaacag ggctgggctc ctcggcaggt 480

ttagtcacag ttttaactac agctttggcc tccttttttg tatcggacct ggaaaataat 540

gtagacaaat atagagaagt tattcataat ttagcacaag ttgctcattg tcaagctcag 600

ggtaaaattg gaagcgggtt tgatgtagcg gcggcagcat atggatctat cagatataga 660

agattcccac ccgcattaat ctctaatttg ccagatattg gaagtgctac ttacggcagt 720

aaactggcgc atttggttga tgaagaagac tggaatatta cgattaaaag taaccattta 780

ccttcgggat taactttatg gatgggcgat attaagaatg gttcagaaac agtaaaactg 840

gtccagaagg taaaaaattg gtatgattcg catatgccag aaagcttgaa aatatataca 900

gaactcgatc atgcaaattc tagatttatg gatggactat ctaaactaga tcgcttacac 960

gagactcatg acgattacag cgatcagata tttgagtctc ttgagaggaa tgactgtacc 1020

tgtcaaaagt atcctgaaat cacagaagtt agagatgcag ttgccacaat tagacgttcc 1080

tttagaaaaa taactaaaga atctggtgcc gatatcgaac ctcccgtaca aactagctta 1140

ttggatgatt gccagacctt aaaaggagtt cttacttgct taatacctgg tgctggtggt 1200

tatgacgcca ttgcagtgat tactaagcaa gatgttgatc ttagggctca aaccgctaat 1260

gacaaaagat tttctaaggt tcaatggctg gatgtaactc aggctgactg gggtgttagg 1320

aaagaaaaag atccggaaac ttatcttgat aaataa 1356

<210> 17

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgaccgttt acacagcatc cgttaccgca cccgtcaaca tcgcaaccct taagtattgg 60

gggaaaaggg acacgaagtt gaatctgccc accaattcgt ccatatcagt gactttatcg 120

caagatgacc tcagaacgtt gacctctgcg gctactgcac ctgagtttga acgcgacact 180

ttgtggttaa atggagaacc acacagcatc gacaatgaaa gaactcaaaa ttgtctgcgc 240

gacctacgcc aattaagaaa ggaaatggaa tcgaaggacg cctcattgcc cacattatct 300

caatggaaac tccacattgt ctccgaaaat aactttccta cagcagctgg tttagcttcc 360

tccgctgctg gctttgctgc attggtctct gcaattgcta agttatacca attaccacag 420

tcaacttcag aaatatctag aatagcaaga aaggggtctg gttcagcttg tagatcgttg 480

tttggcggat acgtggcctg ggaaatggga aaagctgaag atggtcatga ttccatggca 540

gtacaaatcg cagacagctc tgactggcct cagatgaaag cttgtgtcct agttgtcagc 600

gatattaaaa aggatgtgag ttccactcag ggtatgcaat tgaccgtggc aacctccgaa 660

ctatttaaag aaagaattga acatgtcgta ccaaagagat ttgaagtcat gcgtaaagcc 720

attgttgaaa aagatttcgc cacctttgca aaggaaacaa tgatggattc caactctttc 780

catgccacat gtttggactc tttccctcca atattctaca tgaatgacac ttccaagcgt 840

atcatcagtt ggtgccacac cattaatcag ttttacggag aaacaatcgt tgcatacacg 900

tttgatgcag gtccaaatgc tgtgttgtac tacttagctg aaaatgagtc gaaactcttt 960

gcatttatct ataaattgtt tggctctgtt cctggatggg acaagaaatt tactactgag 1020

cagcttgagg ctttcaacca tcaatttgaa tcatctaact ttactgcacg tgaattggat 1080

cttgagttgc aaaaggatgt tgccagagtg attttaactc aagtcggttc aggcccacaa 1140

gaaacaaacg aatctttgat tgacgcaaag actggtctac caaaggaata a 1191

<210> 18

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg 60

caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg aaattattcc attacaacaa 120

agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct 180

ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac 240

gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag 300

ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg aacaaggtga attactttta 360

caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt ggactaacac atgctgctct 420

catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta agctagacga taagattaag 480

ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa 540

actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc attacatggc accaagcaat 600

gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa 660

aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat 720

gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta cgccttggtt taagattatt 780

tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg acctttctga agtggaaaat 840

gacaggcaaa ttcatagaat gctataa 867

<210> 19

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgactaagc tacactttga cactgctgaa ccagtcaaga tcacacttcc aaatggtttg 60

acatacgagc aaccaaccgg tctattcatt aacaacaagt ttatgaaagc tcaagacggt 120

aagacctatc ccgtcgaaga tccttccact gaaaacaccg tttgtgaggt ctcttctgcc 180

accactgaag atgttgaata tgctatcgaa tgtgccgacc gtgctttcca cgacactgaa 240

tgggctaccc aagacccaag agaaagaggc cgtctactaa gtaagttggc tgacgaattg 300

gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360

ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgctgc tgcctatgcc 420

gacaaagtca acggtagaac aatcaacacc ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480

gagccaatcg gtgtctgtgg tcaaattatt ccatggaact ttccaataat gatgttggct 540

tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600

acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660

gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720

agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780

tcttctgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840

gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaccaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900

aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgac 960

gaactattgg ctgctttcaa ggcttacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg taatccattt 1020

gacaaggcta acttccaagg tgctatcact aaccgtcaac aattcgacac aattatgaac 1080

tacatcgata tcggtaagaa agaaggcgcc aagatcttaa ctggtggcga aaaagttggt 1140

gacaagggtt acttcatcag accaaccgtt ttctacgatg ttaatgaaga catgagaatt 1200

gttaaggaag aaatttttgg accagttgtc actgtcgcaa agttcaagac tttagaagaa 1260

ggtgtcgaaa tggctaacag ctctgaattc ggtctaggtt ctggtatcga aacagaatct 1320

ttgagcacag gtttgaaggt ggccaagatg ttgaaggccg gtaccgtctg gatcaacaca 1380

tacaacgatt ttgactccag agttccattc ggtggtgtta agcaatctgg ttacggtaga 1440

gaaatgggtg aagaagtcta ccatgcatac actgaagtaa aagctgtcag aattaagttg 1500

taa 1503

<210> 20

<211> 2052

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atgacaatca aggaacataa agtagtttat gaagctcaca acgtaaaggc tcttaaggct 60

cctcaacatt tttacaacag ccaacccggc aagggttacg ttactgatat gcaacattat 120

caagaaatgt atcaacaatc tatcaatgag ccagaaaaat tctttgataa gatggctaag 180

gaatacttgc attgggatgc tccatacacc aaagttcaat ctggttcatt gaacaatggt 240

gatgttgcat ggtttttgaa cggtaaattg aatgcatcat acaattgtgt tgacagacat 300

gcctttgcta atcccgacaa gccagctttg atctatgaag ctgatgacga atccgacaac 360

aaaatcatca catttggtga attactcaga aaagtttccc aaatcgctgg tgtcttaaaa 420

agctggggcg ttaagaaagg tgacacagtg gctatctatt tgccaatgat tccagaagcg 480

gtcattgcta tgttggctgt ggctcgtatt ggtgctattc actctgttgt ctttgctggg 540

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tacctacctc ctgtttcatg tgacgctgaa gatcctctat ttttattata cacttccggt 840

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caacgtcaca aggctaccca tttctatgtg gctccaactg ctttaagatt aatcaaacgt 1140

gtaggtgaag ccgaaattgc caaatatgac acttcctcat tacgtgtctt gggttccgtc 1200

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tgtatcattg accctgttac aggtgtggaa ttagaaggta atgatgtcga aggtgtcctt 1440

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gataatttac gtagagaatt gatcttacaa gttaggggtg agattggtcc tttcgcctca 1860

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<210> 21

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgtctattc cagaaactca aaaagccatt atcttctacg aatccaacgg caagttggag 60

cataaggata tcccagttcc aaagccaaag cccaacgaat tgttaatcaa cgtcaagtac 120

tctggtgtct gccacaccga tttgcacgct tggcatggtg actggccatt gccaactaag 180

ttaccattag ttggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240

aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300

tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360

acccacgacg gttctttcca agaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420

cctcaaggta ctgacttggc tgaagtcgcg ccaatcttgt gtgctggtat caccgtatac 480

aaggctttga agtctgccaa cttgagagca ggccactggg cggccatttc tggtgctgct 540

ggtggtctag gttctttggc tgttcaatat gctaaggcga tgggttacag agtcttaggt 600

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gacttcacca aagagaagga cattgttagc gcagtcgtta aggctaccaa cggcggtgcc 720

cacggtatca tcaatgtttc cgtttccgaa gccgctatcg aagcttctac cagatactgt 780

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