一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒及制备方法

摘要

本发明涉及一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒及制备方法，所述的试剂盒包括：SARS‑CoV‑2冻干检测试剂和质控试剂；所述的SARS‑CoV‑2冻干检测试剂为装有SARS‑CoV‑2反应液的SARS‑CoV‑2冻干反应管(PCR管)，SARS‑CoV‑2冻干反应管中主要成分包含(1)SARS‑CoV‑2检测的引物(和)探针：ORF1ab基因引物(和)探针、N基因引物(和)探针和人β‑actin基因引物(和)探针；(2)酶混合物：TaqDNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂；(3)PCR反应Buffer：Tris‑HCl、dNTP和Mg2+等；以及(4)冻干保护剂。本发明所述的新型冠状病毒核酸检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、常温运输和使用方便等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的分子生物检测技术领域，特别是涉及一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR 检测试剂盒及制备方法。

背景技术

新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径60nm～140nm。 临床主要表现为发热、干咳、乏力，重症患者逐渐出现呼吸困难和/或低氧血症等较严重疾病； 严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克以及难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功 能障碍[Huang C，Wang Y，Li X，Ren L，Zhao J，Hu Y，Zhang L，Fan G，Xu J，Gu X，Cheng Z，Yu T，Xia J，Wei Y，Wu W，Xie X，Yin W，Li H，Liu M，Xiao Y，Gao H，Guo L，Xie J，Wang G，Jiang R，Gao Z，JinQ，Wang J，Cao B.Clinical features of patientsinfected with 2019 novel coronavirus in[J].Lancet，2020，395(10223):497-506.]。新型冠状病毒为RNA正链病 毒，与SARS冠状病毒序列相似性达79.6％[Zhou P,Yang X L,Wang X G,Hu B,Zhang L,Zhang W,Si H R,Zhu Y,Li B,Huang C L,Chen H D,Chen J,LuoY,Guo H,Jiang R D,Liu M Q,Chen Y, Shen X R,Wang X,Zheng X S,Zhao K,Chen Q J,Deng F,Liu L L,Yan B,Zhan F X,Wang YY, Xiao G F,Shi Z L.Nature,2020,579(7798):270-273.]。2020年2月11日，国际病毒学分类委 员会暂将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2[Coronaviridae Study Group of the International Committee onTaxonomy of Viruses.The species severe acuterespiratorysyndrome-relatedcoronavirus:classifying2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2[J].NatMicrobiol，2020，5(4):536-544.]。由其引发的疾病称为新型冠状病毒肺 炎(Coronavirusdisease 2019,COVID-19)，已成为全球性重大公共卫生事件。COVID-19具 有极强的传染性，主要通过呼吸道飞沫和接触传播，人群普遍易感，感染者可出现发热、干咳、乏力、胸闷等症状[Wang C,Horby PW,Hyden FG.A novel coronavirus outbreak ofglobal health concern[J].Lancet,2020,395(10223):470-473.]。

准确快速地甄别出SARS-CoV-2感染者并对其实施隔离是目前疫情防控的最有效手段。 当前，SARS-CoV-2的检测主要是基于核酸和抗体检测两种，基于核酸检测的实时荧光RT-PCR 方法是SARS-CoV-2检测的主要方法。现有技术中，已上市或者已专利公布的核酸检测试剂 均为液体检测试剂，需要先配现用，对实验和技能要求比较高；试剂盒需要冷链运输，增加 了检测成本。而已上市的胶体金检测试剂检测灵敏度相对较低，存在一定的假阴和假阳性风 险。其他公布的基于新型冠状病毒核酸检测技术的如Crispr技术[FengZhang,Omar O Abudayyeh,Jonathan S Gootenberg.A protocol for detection ofCOVID-19 using CRISPR diagnosis.]、RT-LAMP技术[Lin Yu,Shanshan Wu,Xiaowen Hao,Xuelong Li,Xiyang Liu, ShenglongYe,HengHan,XueDong,XinLi,JiyaoLi,JianminLiu,NaLiu,WanzhongZhang,VicentPelecha no,Wei-HuaChen,XiushanYin.Rapidcolorimetric detection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)diagnostic plat-form: iLACO.doi:https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025874]在检测通量和自动化程度上均不如 RT-qPCR检测试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒及制备方法，本发 明试剂盒是一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的多重荧光检测冻干试剂盒。在有效地 对新型冠状病毒进行检测，确保准确性、特异性和敏感性高、重复性好的同时，能在短时间 内完成检测获得结果，并且可常温运输和保存。

为了实现上述目的，发明的技术方案如下：一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂 盒，包括SARS-CoV-2冻干检测试剂和质控试剂；所述的SARS-CoV-2冻干检测试剂为SARS-CoV-2冻干反应管，所述的SARS-CoV-2冻干反应管中包括以下组分：

SARS-CoV-2检测的引物和探针：ORF1ab基因引物和探针、N基因引物和探针和人β-actin基因引物和探针；

酶混合物：TaqDNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂；PCR反应Buffer：Tris-HCl、dNTP和Mg

所述的冻干保护剂为甘露醇、海藻糖、葡聚糖、明胶和蔗糖中的一种或多种；

所述的质控试剂包括阳性质控品和阴性质控品；所述的阳性质控品为含有T7启动子引物 序列的ORF1ab-ssDNA(SEQ ID NO:10)冻干粉末和N-ssDNA(SEQ ID NO:11)冻干粉末； 所述的阴性质控品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水；

所述的ORF1ab-ssDNA、N-ssDNA的序列SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11：

SEQ ID NO:10

TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCCGCTTCAGC GTTCTTCGGAATGTCGGAAGTCACACCTTCGGGAACGT

SEQ ID NO:11

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAACCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGGTTATGGCCGAACCCATGCTTCAGTCAGC；

所述的ORF1ab基因引物包括ORF1ab基因正向、反向引物，ORF1ab基因探针为ORF1ab 基因荧光探针；所述的N基因引物包括N基因正向、反向引物，N基因探针为N基因荧光探 针；所述的人β-actin基因引物包括人β-actin基因正向、反向引物，人β-actin基因探针为人 β-actin基因荧光探针；

ORF1ab基因正向引物，SEQ ID NO:1，CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

ORF1ab基因反向引物，SEQ ID NO:2，GCTGACTGAAGCATGGGTTC

ORF1ab基因荧光探针，SEQ ID NO:3，CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG

N基因正向引物，SEQ ID NO:4，AGGAACTGATTACAAACATTGGC

N基因反向引物，SEQ ID NO:5，CGTTCCCGAAGGTGTGACTT

N基因荧光探针，SEQ ID NO:6，CGACATTCCGAAGAACGCTGAAGC

人β-actin基因正向引物，SEQ ID NO:7，GAGCGCGGCTACAGCT

人β-actin基因反向引物，SEQ ID NO:8，TCCTTAATGTCACGCACGAT

人β-actin基因荧光探针，SEQ ID NO:9，ACCACCACGGCCGAGCG。

进一步的，所述的冻干保护剂为海藻糖，浓度为0.5％～5％。

进一步优选的，所述的海藻糖浓度为2％。

进一步的，所述的ORF1ab基因荧光探针的5＇端标记FAM荧光标记；N基因荧光探 针的5＇端标记VIC荧光标记；人β-actin基因荧光探针5＇端标记CY5荧光标记。

进一步的，所述的ORF1ab基因正、反向引物各0.6μM，探针0.3μM，N基因正、反向 引物各0.8μM，探针0.4μM，人β-actin基因正、反向引物各0.4μM，探针0.2μM；Taq DNA 聚合酶2.5U；反转录酶80U；RNA酶抑制剂12U；dNTP 0.3mM；Mg2+4mM；海藻糖5μM； Tris-HCl 6mM，其余为灭菌去离子水，总体积为20μL。

再进一步的，所述的试剂盒还包括样本释放剂，所述的样本释放剂包括10mM～150mM 月桂酰肌氨酸钠、1mM～20mM DTT、1mM～100mM Tris-HCl、1mM～20mM EDTA和 5mM～25mM SDS。

再进一步优选的，25mM月桂酰肌氨酸钠、5mM DTT、10mM Tris-HCl、2mM EDTA和5mMSDS。

一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒的制备方法，包括SARS-CoV-2冻干检测 试剂的冻干，其包括以下步骤：

(1)预冻干，真空冻干机温度下降到-40～-55℃，预先冻干1～2h；

(2)真空干燥，将预先装有SARS-CoV-2反应液的SARS-CoV-2冻干反应管抽真空1～2h；

(3)解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25～-10℃保持1～2h，然后将隔板温度升至室 温25℃并保持1～2h。

进一步的，预冻干，真空冻干机温度下降到-50℃，预先冻干1.5h；真空干燥，将预先装 有SARS-CoV-2反应液的SARS-CoV-2冻干反应管抽真空1h；解析干燥阶段，再将隔板温度 升至-10℃保持1h，然后将隔板温度升至室温25℃并保持1h。

再进一步的，所述的ORF1ab-ssDNA冻干粉末和N-ssDNA的冻干粉末为与所述的SARS-CoV-2冻干检测试剂采用相同的冻干工艺而制成的冻干试剂。

本发明相比现有技术具有以下有益效果：在有效地对新型冠状病毒进行检测，确保准确性、 特异性和敏感性高、重复性好的同时，能在短时间内完成检测获得结果，并且可常温运输和 保存。

附图说明

图1A、B、C、D为不同ORF1ab基因引物探针组合筛选结果图；

图2A1～A3、B1～B3、C1～C3为不同N基因引物探针筛选结果图；

图2D1～D3、E1～E3为不同引物探针浓度优化结果图；

图2F1～F3、G1～G3为不同dNTPs浓度优化结果图；

图3-1～6为不同Taq DNA酶用量优化结果图；

图4-1～6为不同逆转录酶优化结果图；

图5为不同RNA酶抑制剂优化结果图；

图6为试剂盒特异性优化结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒，是一种预混冻干型新型冠 状病毒(SARS-CoV-2)核酸多重荧光PCR检测的试剂盒，所述的试剂盒包括：SARS-CoV-2冻 干检测试剂和质控试剂；所述的SARS-CoV-2冻干检测试剂为装有SARS-CoV-2反应液的 SARS-CoV-2冻干反应管(PCR管)，SARS-CoV-2冻干反应管中主要成分包含(1)SARS-CoV-2 检测的引物(和)探针：ORF1ab基因引物(和)探针、N基因引物(和)探针和人β-actin基因引物(和)探针；(2)酶混合物：TaqDNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂；(3) PCR反应Buffer：Tris-HCl、dNTP和Mg

具体的，一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒主要包括SARS-CoV-2冻干检测试剂和质控试剂以及样本释放剂。SARS-CoV-2冻干检测试剂成分包括ORF1ab基因、N基因和人β-actin基因的引物(和)探针，引物和探针序列如下：

如SEQ ID NO:1所示的ORF1ab基因正向引物，如SEQ ID NO:2所示的ORF1ab基因反向引物，以及如SEQ ID NO:3所示的ORF1ab基因荧光探针；如SEQ ID NO:4所示的N基因 正向引物，如SEQ ID NO:5所示的N基因反向引物，以及如SEQ ID NO:6所示的N基因荧 光探针；如SEQ ID NO:7所示的(人)β-actin基因正向引物，如SEQ ID NO:5所示的(人) β-actin基因反向引物，以及如SEQ ID NO:6所示的(人)β-actin基因荧光探针。

SARS-CoV-2检测试剂成分还应包含冻干保护剂。如：甘露醇、海藻糖、葡聚糖、明胶和蔗糖等冻干保护剂成分。优选的，冻干保护剂为海藻糖，浓度为0.5％～5％，进一步优选的， 浓度为2％。

所述的冻干检测试剂由如下PCR反应体系构成，ORF1ab基因正、反向引物各0.6μM，探针0.3μM，N基因正、反向引物各0.8μM，探针0.4μM，β-actin基因正、反向引物各0.4μM， 探针0.2μM；Taq DNA聚合酶2.5U；反转录酶80U；RNA酶抑制剂12U；dNTP 0.3mM； Mg

所述的样本释放剂包含1％～5％月桂酰肌氨酸钠、1mM～20mM DTT、1mM～100mMTris-HCl、1mM～20mM EDTA和0.1％～0.5％SDS；优选地2.5％月桂酰肌氨酸钠、5mM DTT、10mM Tris-HCl、2mM EDTA和0.1％SDS。

SARS-CoV-2冻干试剂的冻干条件(即SARS-CoV-2冻干检测试剂的冻干)如下：(1)预冻干，真空冻干机温度下降到-40～-55℃，预先冻干1～2h；(2)真空干燥，将预先装有SARS-CoV-2反应液的SARS-CoV-2冻干反应管(即PCR管)抽真空1～2h；(3)解析干燥 阶段，再将隔板温度升至-25～-10℃保持1～2h，然后将隔板温度升至室温25℃并保持1～2h。

作为优选地，所述的SARS-CoV-2冻干试剂的冻干条件为(1)预冻干，真空冻干机温度 下降到-50℃，预先冻干1.5h；(2)真空干燥，将预先装有SARS-CoV-2反应液的SARS-CoV-2 冻干反应管(即PCR管)抽真空1h；(3)解析干燥阶段，再将隔板温度升至-10℃保持1h， 然后将隔板温度升至室温25℃并保持1h。

进一步地，所述的ORF1ab基因引物包括ORF1ab基因正向、反向引物，ORF1ab基因探针 为ORF1ab基因荧光探针；所述的N基因引物包括N基因正向、反向引物，N基因探针为N基因 荧光探针；所述的人β-actin基因引物包括人β-actin基因正向、反向引物，人β-actin基因探针为 人β-actin基因荧光探针；前述所述的SARS-CoV-2冻干检测试剂包含如下所述的基因及其对应 的引物和探针：

ORF1ab基因正向引物，SEQ ID NO:1，CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

ORF1ab基因反向引物，SEQ ID NO:2，GCTGACTGAAGCATGGGTTC

ORF1ab基因荧光探针，SEQ ID NO:3，CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG

N基因正向引物，SEQ ID NO:4，AGGAACTGATTACAAACATTGGC

N基因反向引物，SEQ ID NO:5，CGTTCCCGAAGGTGTGACTT

N基因荧光探针，SEQ ID NO:6，CGACATTCCGAAGAACGCTGAAGC

(人)β-actin基因正向引物，SEQ ID NO:7，GAGCGCGGCTACAGCT

(人)β-actin基因反向引物，SEQ ID NO:8，TCCTTAATGTCACGCACGAT

(人)β-actin基因荧光探针，SEQ ID NO:9，ACCACCACGGCCGAGCG。

本发明的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的多重荧光冻干型检测试剂盒，所述 试剂盒还包括SARS-CoV-2质控品(质控试剂)。进一步地，所述的SARS-CoV-2质控品由阳性质控品和阴性质控品组成。所述的阳性质控品为含有T7启动子引物序列的 ORF1ab-ssDNA(SEQ ID NO:10)冻干粉末和N-ssDNA(SEQ ID NO:11)冻干粉末，所述的 阴性质控品为灭菌后焦碳酸二乙酯处理水。即所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，阳 性对照为含有T7启动子引物序列的(质粒)单链DNA冻干粉末，只需添加1000μL阴性对 照即可成为工作浓度；所述的阴性对照为DEPC水。

所述的ORF1ab-ssDNA、N-ssDNA(质粒单链DNA)的序列如SEQ ID NO:10所示：

SEQ ID NO:10

SEQ ID NO:11

质粒单链DNA冻干粉末(即ORF1ab-ssDNA冻干粉末和N-ssDNA的冻干粉末)是与SARS-CoV-2冻干检测试剂相同的冻干工艺而制成的冻干试剂。

即冻干工艺同样为：

(1)预冻干，真空冻干机温度下降到-40～-55℃，预先冻干1～2h；

作为优选地，预冻干，真空冻干机温度下降到-50℃，预先冻干1.5h。

(2)真空干燥，抽真空1～2h；

作为优选地，抽真空1h。

(3)解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25～-10℃保持1～2h，然后将隔板温度升至室 温25℃并保持1～2h。

作为优选地，隔板温度升至-10℃保持1h，然后将隔板温度升至室温25℃并保持1h。

进一步地，ORF1a/b基因Taqman探针(即ORF1ab基因荧光探针)的5＇端标记FAM 荧光标记；N基因Taqman探针(即N基因荧光探针)的5＇端标记VIC荧光标记；(人)β-actin 基因荧光探针5＇端标记CY5荧光标记。

采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

(1)常温运输及保存。本发明所制成的(SARS-CoV-2冻干检测)试剂盒可进行常温保 存和运输，避免试剂反复冻融，检测结果更稳定。

(2)试剂预分装。本发明所制成的(SARS-CoV-2冻干检测)试剂盒仅包含SARS-CoV-2 冻干检测试剂(预分装与PCR8排管或者96孔PCR板或者384孔PCR板中)和阳性对照冻 干试剂及阴性DEPC水3种组份。

(3)操作便捷。拥护仅需溶解阳性对照，向冻干试剂中加入相应量的提取的核酸作为稀 释液即可直接扩增检测。

由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针，并优化试剂冻干条件， 发展了能够快速、有效地检测SARS-CoV-2ORF1a/b基因和N基因以及用于反应体系监控的 人β-actin基因，制备了基于该方法的检测试剂盒。本发明通过大量实验验证，本发明的引物 探针试剂盒及检测方法比常规方法准确性更高、特异性优良，同时最低检出限可达200copies/mL，说明敏感性较高；对浓度为500copies/ml的SARS-CoV-2假病毒参考品重复10次检测，ORF1ab和N基因的Ct值的变异系数(CV％)均小于5％；与冠状病毒(NL63，OC43，229E，HKU1)，腺病毒(3型、7型)、人副流感病毒(1、2、3型)、甲型流感病毒(H1N1 (2009)、H3N2)、乙型流感病毒(Yamagata Victoria)、呼吸道合胞病毒(A型)、肺炎 支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌无交叉反应；同时试剂 盒可以可以常温保存和运输；操作简单，不用配制PCR体系，直接加入核酸模板即可，大大 简化操作、降低污染风险、减少试剂用量、缩短反应时间，可以为新型冠状病毒的防治提供 先进、有效的早期快速检测技术和监测手段的同时，也为新型冠状病毒的防治争取到极为宝 贵的快速反应时间。

下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒的制备：

(1)引物与探针的设计与筛选

从NCBI和GSAID数据库中下载的新型冠状病毒基因组序列，用MEGA6.0生物学软件进行比对，选择中国疾病预防控制中心(CDC)和世界卫生组织(WHO)公布选择的ORF1ab 和N基因的保守区域，利用PrimerExpress2.0和primer premier5.0软件设计引物探针，引物、探针均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所有设计的引物和探针序列信息见表1。

表1引物及探针靶基因及序列信息

Table 1 Primer and probe target genes and sequence information

25μl反应体系的配制：60mMTris-HCl 5μl，10×solution I 2.5μl，10μmol/L上、下游引物 各0.5μl，10μmol/L探针0.25μl，25mmol/L dNTPs 0.2μl，25mM Mg

扩增程序：50℃20min；95℃5min；循环1次；再按95℃10s→58℃35s，循环 40次；单点荧光检测在58℃。

ORF1ab-F2/R2/P2组合较ORF1ab-F1R1P1组合扩增曲线的平台期荧光高度高，“S型”曲 线更为明显，确定ORF1ab-F2/R2/P2为最优组合；N-F2/R2/P2和N-F1R1P1均具有较好的“S 型”曲线，一致的平台期荧光高度，但N-F2/R2/P2组合的检测灵敏度较N-F1/R1/P1高，因此 确定N-F2/R2/P2为最优组合(见附图1A、B、C、D)。

(2)反应体系的优化

SARS-CoV-2冻干前反应液主要由60mMTris-HCl，Mg

不同引物探针浓度对ORF1ab、N和ActB基因的扩增有影响(见附图2A1～A3、B1～B3和C1～C3)。ORF1ab基因在3种引物探针浓度下均有较好的扩增线型，在引物：探针浓度 为240：120nmol/L时，不同梯度的假病毒扩增的“△Ct”值均一，确定ORF1ab的引物探针浓 度为240：120nmol/L；N基因在引物：探针浓度为200:100nmol/L和240：120nmol/L时扩增 线型较差，不同梯度的假病毒扩增的“△Ct”值明显不一致，在引物：探针浓度为280:140nmol/L时扩增线型好，平台期的荧光强度响应值“△Rn”和不同梯度的假病毒扩增的“△Ct”值均一， 确定N基因的引物探针浓度为280:140nmol/L；同样确定ActB的引物探针浓度为 120:60nmol/L。

不同dNTPs浓度对SARS-CoV-2的检测灵敏度和扩增曲线有影响(见图2D1～D3和E1～E3)。dNTPs浓度为150μmol/L时，SARS-CoV-2对1.0×10

3种Taq DNA聚合酶用量下，ORF1ab和N基因对SARS-CoV-2假病毒标准品均有扩增，不同Hotstart HiTaq酶用量对检测Ct值和扩增线型有影响。在Hotstart HiTaq酶用量为1.5U/ 反应时ORF1ab基因梯度“△Ct”值不一致；在Hotstart HiTaq酶用量为2.5U/反应时，ORF1ab 和N基因平台期荧光强度响应值“△Rn”不一致，ORF1ab基因梯度Ct值差异大；当Hotstart HiTaq酶用量为2.0U/反应时，平台期荧光强度响应值“△Rn”基本一致，扩增的“△Ct”值均一 (见附图2F1～F3和G1～G3)，确定体系中Hotstart HiTaq酶最适用量为2.0U/反应。

在Super M-MuLV用量为40U/反应和60U/反应时，ORF1ab和N基因对对1.0×10

3种RNA酶抑制剂的用量对N基因Ct值和扩增线型影响不大，ORF1ab基因在RNasin浓度为10U/反应时平台期荧光强度响应值“△Rn”不一致，标准品扩增Ct值不呈梯度。6U/反应和8U/反应时，ORF1ab和N基因均有较好的扩增结果(见附图4-1～6)。考虑试剂盒的长 期稳定性，最终确定最适RNasin的用量为8U/反应。

(3)检测体系的冻干与试剂盒组装

预冻干，真空冻干机温度下降到-50℃，预先冻干1.5h；将预先装有SARS-CoV-2反应液 的PCR管抽真空干燥1h；再将隔板温度升至-10℃保持1h，然后将隔板温度升至室温25℃并 保持1h。冻干型SARS-CoV-2检测试剂盒主要由SARS-CoV-2检测试剂、阳性对照和阴性对 照组成。其中阳性对照为单练DNA冻干粉末，含有T7启动子引物序列，阴性对照为DEPC水。

冻干型SARS-CoV-2检测试剂见图5，所有反应管内试剂均匀冻干在底部。

实施例2：试剂盒的性能研究：

(1)灵敏度

用梯度稀释的SARS-CoV-2假病毒标准品(1.0×10

当样本浓度大于5.0×10

表2试剂盒的检测灵敏度

Table2 The results of kit sensitivity

(2)特异性

用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取冠状病毒(NL63，OC43，229E，HKU1)、腺病毒(3 型、7型)、人副流感病毒(1、2、3型)、甲型流感病毒(H1N1(2009)、H3N2)、乙型 流感病毒(Yamagata Victoria)和呼吸道合胞病毒(A型)核酸；用磁珠法细菌/支原体基因组 DNA提取试剂盒提取肺炎支原体、肺炎衣原体核酸、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和化脓性 链球菌核酸；测试SARS-CoV-2 RT-qPCR冻干检测试剂盒的特异性。

用SARS-CoV-2 RT-qPCR检测试剂对冠状病毒(NL63，OC43，229E，HKU1)、腺病毒 (3型、7型)、人副流感病毒(1、2、3型)、甲型流感病毒(H1N1(2009)、H3N2)、 乙型流感病毒(Yamagata Victoria)、呼吸道合胞病毒(A型)、肺炎支原体、肺炎衣原体核 酸、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌核酸及阴性对照和阳性对照核酸进行检测。 结果表明，SARS-CoV-2 RT-qPCR检测试盒阳性对照ORF1ab和N基因阳性对照扩增结果为 阳性，对常见的呼吸道病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体和呼吸系统致病菌核酸无非特异性反 应(见图6)，试剂盒特异性好。

(3)重复性

用优化的SARS-CoV-2 RT-qPCR冻干检测试剂盒对精密度参考品J1(500copies/mL)进 行10次重复检测，比较ORF1ab基因和N基因Ct值的变异系数CV％。

用优化的SARS-CoV-2 RT-qPCR检测试剂盒对精密度参考品J1(500copies/mL)进行10 次重复检测，结果见表3。ORF1ab和N基因对500copies/mL的低浓度精密度参考品的Ct值 变异系数分别为1.64％和1.90％，均小于5％。表明本研究所构建的SARS-CoV-2 RT-qPCR检 测试剂盒重复性好。

表3试剂盒精密度检测结果

Table3The results of kit precision

(4)样本的检测

用本发明构建的SARS-CoV-2 RT-qPCR冻干检测试剂盒作为考核试剂盒，用市售NMPA 取得注册证的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)作为对照试剂， 采用盲法过对1000例回顾性标本进行检测，计算考核试剂盒的阳性符合率、阴性符合率、总 符合率及Kappa值。对10例输入性SARS-CoV-2阳性样本进行检测，考察试剂盒对前瞻性样 本的检测能力。

对过往检测的1000例回顾性样本采用双盲试验和对照试验的方法检测结果见下表4。 本研究所构建的SARS-CoV-2RT-qPCR检测试剂盒与对照试剂盒的阳性符合率100％，阴性符 合率99.89％，总符合率99.9％，Kappa值0.99。对2020年7月至8月份输入性10例SARS-CoV-2 阳性样本检测结果为阳性，表明SARS-CoV-2RT-qPCR检测试剂盒性能好，可用于临床对 SARS-CoV-2的检测，临床适用性好。

表4 1000例临床样本比对结果

Table4 Comparison results of 1000 clinical samples

阳性符合率：54/54＝100％；

阴性符合率：945/946＝99.89％；

总符合率：(54+945)/1000＝99.9％；

Kappa＝(P0-Pe)/(1-Pe)＝0.99。

一致性系数Kappa(K)值计算＝0.99(Kappa≥0.75表明两者一致性良好， 0.75>Kappa≥0.4表明一致性一般，Kappa<0.4则表明二者一致性较差)，本试验中Kappa值 ＝0.99，大于0.75，可认为二者一致性良好。

序列表

<110>南通海关综合技术中心（江苏国际旅行卫生保健中心南通分中心、南通海关口岸门诊部）

<120>一种冻干型新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒及制备方法

<160>11

<170> SIPOSequenceListing 1 .0

<210> 1

<211>21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

GCTGACTGAAGCATGGGTTC

<210> 3

<211>28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG

<210> 4

<211>23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

AGGAACTGATTACAAACATTGGC

<210> 5

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

CGTTCCCGAAGGTGTGACTT

<210> 6

<211>24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

CGACATTCCGAAGAACGCTGAAGC

<210> 7

<211>16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

GAGCGCGGCTACAGCT

<210> 8

<211>20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

TCCTTAATGTCACGCACGAT

<210> 9

<211>17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ACCACCACGGCCGAGCG

<210> 10

<211>94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGGAAGTCACACCTTCGGGAACGT

<210> 11

<211>94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCCGAACCCATGCTTCAGTCAGC