一种基于比色生物传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法

摘要

本发明公开了一种基于比色生物传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，包括：(a)、构建磁性复合材料h‑Fe3O4@ppy；(b)、h‑Fe3O4@ppy、TMB和不同浓度的H2O2孵育反应，测量紫外吸收曲线，建立过氧化氢标准曲线；(c)、按照步骤(b)测得待测样品的最大紫外吸收值，代入标准曲线，得到H2O2浓度。本发明还包括(d)、h‑Fe3O4@ppy、H2O2、TMB和不同浓度的谷胱甘肽孵育反应，分离出h‑Fe3O4@ppy，加入硫酸，建立谷胱甘肽标准曲线；(e)、按照步骤(d)测得待测样品的最大紫外吸收值，代入标准曲线，得到GSH浓度。本发明能简单快速、灵敏地检测谷胱甘肽、过氧化氢。

说明书

技术领域

本发明属于分析检测领域，涉及一种基于比色生物传感器检测谷胱甘肽(GSH)和/或过氧化氢(H

背景技术

酶被广泛地用于级联催化反应。天然酶因其高制备成本、严格的储存要求和有限的反应条件，限制了它的进一步应用。与天然酶相比，模拟酶拥有成本低、稳定性高、催化作用可调、可大规模制备和易于表面改性等优点。特别是模拟的纳米酶被广泛地应用于医学、生物检测，食品和工业等领域。近几十年来，纳米复合材料由于其独特的物理、化学性质已成为一种新型的复合材料。特别是在Fe

血红素是多种酶和特殊细胞蛋白的活性辅助因子。一些血红素纳米复合材料是天然过氧化物酶的有效替代品，显示出意想不到的酶活性，并已应用于各个领域。例如采用湿法合成的血红素石墨烯纳米片(h-GNs)可以用于单核苷酸比色检测。但是，h-GNs仍然受到不稳定的约束。此外，发明人还设计了含血红素的g-四联体纳米酶，并成功地应用于腺苷的测定。

过氧化氢(H

发明内容

本发明的目的是克服现有检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺点，提供一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe

步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe

步骤(b)、构建过氧化氢比色传感器和H

步骤(c)、样品检测：按照步骤(b)测得未知H

作为本发明所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe

步骤(d)、构建GSH比色传感器：步骤(a)构建的磁性生物复合材料h-Fe

步骤(e)、样品检测：按照步骤(d)测得未知GSH浓度的待测样品的比色和最大紫外吸收值，进行颜色比对或代入步骤(d)的谷胱甘肽标准曲线，得到待测样品中GSH浓度。

作为本发明所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe

步骤(f)、构建过氧化氢比色生物传感器：步骤(b)反应结束后，磁性分离出磁性复合材料h-Fe

步骤(e)、样品检测：依次按照步骤(b)、步骤(f)测得未知H

本发明方法的检测机理为(图1)：h-Fe

步骤(a)中，h-Fe

具体的，h-Fe

所述的Fe

所述的Fe

所述的吡咯和FeCl

所述的Fe

所述的十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为1mg/mL。十六烷基三甲基溴化铵水溶液由以下方法配制得到：将0.04gCTAB通过连续搅拌分散到40mL水溶液中，形成均匀透明的溶液。

本发明也可以将十六烷基三甲基溴化铵替换为Pluronic P-123。

步骤(b)中，以pH 3.0、5mM柠檬酸钠缓冲液为反应溶剂。体系中h-Fe

根据本发明具体实施方式，体系中加入等体积不同浓度的双氧水，双氧水中H

孵育反应的温度为45℃，孵育反应的时间为40分钟。

步骤(d)中，以pH 3.0、5mM柠檬酸钠缓冲液为反应溶剂。

体系中H

根据本发明具体实施方式，体系中加入等体积不同浓度的谷胱甘肽溶液，谷胱甘肽溶液中GSH的浓度为0μM，0.1μM，0.5μM，1μM，5μM，10μM，20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，120μM。

孵育反应的温度为45℃，孵育反应的时间为40分钟。

优选的，所述的硫酸的加入量和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的摩尔比为25～35:1，优选为30:1。

步骤(f)中，所述的硫酸的加入量和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的摩尔比为25～35:1，优选为30:1。

与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

1、h-Fe

2、利用h-Fe

3、h-Fe

4、实际临床样本分析显示GSH/GSSG在临床诊断中具有更重要的意义。

附图说明

图1为本发明基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe

图2A为实施例1所构建的检测体系中不加硫酸不同浓度H

图3A为实施例2所构建的检测体系中加入硫酸不同浓度H

图4A为实施例3所构建的检测体系中不同浓度GSH的紫外吸收曲线；图4B为实施例3所构建的检测体系中不同浓度GSH的标准曲线图；图中，GSH浓度为400μL谷胱甘肽中GSH浓度。

图5为实施例1所构建的检测体系对于GSH的选择性比较图。

图6为不同pH体系对h-Fe

图7为不同酶活性的比较图；其中，图7A、B、C分别为h-Fe

具体实施方式

通过结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行更详细的描述。虽然以下为本发明的优选具体实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

具体实施方式中Fe

实施例1

一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe

步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe

步骤(b)、磁性复合材料h-Fe

步骤(c)、样品检测：按照步骤(b)，将待测样品、TMB、h-Fe

实施例2

一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe

步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe

步骤(b)、磁性复合材料h-Fe

步骤(c)、构建过氧化氢比色生物传感器：磁性分离出磁性复合材料h-Fe

步骤(d)、样品检测：按步骤(b)、步骤(c)处理未知浓度的样品，在450nm处检测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(c)标准曲线得到样品中的过氧化氢浓度。

实施例3

一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe

步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe

步骤(b)、构建GSH比色传感器：将400μLH

步骤(c)、样品检测：按步骤(b)处理未知GSH浓度的样品，进行比色，在450nm处检测样品的最大紫外吸收值，代入谷胱甘肽标准曲线得到样品中的谷胱甘肽浓度。

实施例4

构建磁性复合材料h-Fe

实施例5

构建磁性复合材料h-Fe

实施例6

GSH的选择性实验

实施例参照实施例3步骤(b)，研究了传感器系统对常见阳离子(Na

比色法结果见图5。结果表明，除了Cys外，其余干扰物都不会干扰GSH的定量检测。Cys是GSH发挥其抗氧化能力的有效成分，还可以抑制TMB的氧化。而在实际的生物环境中，Cys含量远低于GSH，并且其对谷胱甘肽选择性的影响是可以接受的。

实施例7

不同pH体系对h-Fe

分别配制pH＝3、4、5、6、7的柠檬酸钠缓冲溶液，按照实施例1步骤(b)进行分析：分别以上述不同pH的柠檬酸钠缓冲溶液作为反应溶剂，体系中H

实施例8

为了量化材料的催化效率和亲和力，采用双倒数方法计算稳态动力学参数，包括米氏常数(Km)和最大初始速度值V

不同酶活性比较：取相同浓度的h-Fe

图7为常温、pH＝3下Fe

Fe

h-ppy纳米粒(h-ppy NPs)的制备方法如下：将0.04g CTAB通过连续搅拌分散到40mL H

应用实施例1

以人全血样品进行测定，以1.25mM加入量为基准，在全血中分别加入基准量80％、100％、120％的谷胱甘肽标准品，按照实施例3的方法测定紫外吸收信号，代入实施例3建立的谷胱甘肽标准曲线得到样品中谷胱甘肽标准品浓度，每份样品重复测定3次取平均值，计算RSD及回收率见表1。

表1.全血中谷胱甘肽加样回收率(n＝3)

应用实施例2

以人全血样品进行测定，在全血中分别加入10、20、40μM的过氧化氢标准品，按照实施例2的方法测定紫外吸收信号，代入实施例2建立的过氧化氢标准曲线得到样品中的过氧化氢标准品浓度，每份样品重复测定3次取平均值，计算RSD及回收率见表2。

表2.全血中过氧化氢加样回收率(n＝3)

以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。