一种能提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备与应用

摘要

本发明公开了一种能提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备与应用，将大豆蛋白粉过筛得到大豆蛋白微粉，加入去离子水搅拌均匀配制大豆蛋白溶液A，向悬浊液A中加入碱性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶进行分段水解，第一阶段采用碱性蛋白酶酶解，第二阶段通过复合蛋白酶及木瓜蛋白酶进行复合酶解得到大豆蛋白酶解液B，将酶解液离心取上清液C，进行超滤分离得到大豆肽D，采用大孔吸附树脂脱盐纯化得到大豆肽E，采用活性碳吸附色谱对大豆肽E进一步纯化，得到具有对枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量具有明显促进效果的大豆肽F。本发明可应用于发酵领域，且制备方法简单可控，适用于工厂量产。

说明书

技术领域

本发明涉及大豆蛋白肽制备领域，特别涉及一种提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备。

背景技术

大豆含有40％左右的蛋白质，超过其他任何粮食作物的蛋白质含量。大豆蛋白肽是大豆蛋白经蛋白酶水解或微生物发酵等方法所制得的分子量集中在1000Da以下并具有某些生物学功能的混合低聚肽。它既具有大豆蛋白质的营养学特性，也具有小分子肽所特有的物化特性。人体对大豆蛋白肽的吸收速率和吸收率均远高于大豆蛋白。而且，大豆蛋白肽对于生命活动发挥着重要的作用，在抗高血压。抗胆固醇、抗血栓的形成、消除人体的疲劳、保护肝脏、防止动脉粥样硬化、增强人体体能和肌肉力量等方面具有显著的效果。此外，大豆蛋白肽对微生物有增值效果，并促进有益菌代谢分泌，被广泛用于发酵工业。在医药行业中，大豆多肽含有降血压肽、将胆固醇肽、抗血栓肽等肽段，可生产出相应功效的药品。在化妆品行业中，大豆多肽含有一种类似于胰岛素的白蛋白多肽，是胰岛素的生长因子，具有保护人体表皮细胞，消除体内自由基，防止黑色素沉淀、抗衰老等功效，可以广泛地应用到化妆品行业中。在饲料行业中，大豆多肽包含一些寡肽，这些寡肽在动物胃肠道中不水解，不受抗营养因子的干扰而直接吸收，且比单个氨基酸的吸收速度快。大豆多肽可以替代饲料中的抗生素药物。

纳豆激酶具有很强的溶解血栓的功能，于目前临床所用的尿激酶、链激酶等溶栓药物相比，具有安全性好，易被人体吸收，作用直接迅速，药效持续时间长等优点。目前用于产纳豆激酶的菌株有保加利亚乳杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、乳酸菌、大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母菌等，本文中提供一种大豆蛋白肽可以提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量。专利《一种高分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用》中记载,获得的纳豆激酶酶活最高达到10672.5Fu/g。

目前，已有通过酶解、发酵等方法将从大豆蛋白中获得大豆蛋白肽，但由于获得大豆蛋白肽后没有进一步分离或分离工艺简单，所得大豆蛋白肽纯度较低，没有发现其具有明显提高枯草芽孢杆菌的纳豆激酶产量的功效。为此，本发明提供一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中蛋白肽不具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的缺陷，而提出的一种具有提高纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备方法。该方法的要点在于结合生物酶解技术、超滤分离技术、大孔树脂吸附分离以及活性炭吸附技术高效释放和收集大豆蛋白酶解产物中具有促进枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆肽。

本发明的另一目的在于提供上述大豆肽的用途。

为了实现上述目的，本发明采取了以下步骤，

一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备方法，包括以下步骤，

S1，将大豆蛋白粉经筛后得到大豆蛋白微粉，加入蒸馏水配制一定浓度的大豆蛋白悬浊液A；

S2，将悬浊液A置于90～100℃的水中一定时间，并在冷却后加入亚硫酸钠以破坏蛋白的空间结构；

S3，调节大豆蛋白悬浊液的pH后，加入蛋白酶对其进行酶解；

S4，酶解一定时间后得到酶解液B，将酶解液B送入沸水中灭酶；

S5，将S4所得酶解液B放入离心机中离心分离，得到上清液C；

S6，对上清液C进行超滤分离收集所需组分后冷冻干燥后得到大豆肽粉D；

S7，将大豆肽粉D加入去离子水溶解后进行大孔吸附树脂分离纯化，冷冻干燥后得到大豆肽粉E；

S8，将大豆肽粉E加入去离子水溶解，加入活性碳吸附，然后抽滤，收集沉淀，用去离子水冲洗至中性，加入55-75％乙醇溶液，在室温下震荡解析，抽滤收集上清液，冷冻干燥后得到大豆肽。

进一步优选地，S1步骤中将大豆蛋白粉粉碎，过40-80目筛，得到大豆蛋白微粉，将所得大豆蛋白微粉溶于蒸馏水中，配置成终浓度为5％-10％的大豆蛋白悬浊液A。

S2，将悬浊液置于沸水中5-15min，冷却后加入0.1-2％的浓度为0.1-1％的亚硫酸钠溶液。

S3，用1mol/L氢氧化钠调节大豆蛋白悬浊液的pH至8-10.5，并在40-60℃水浴过中预热。

S4，向大豆蛋白悬浊液A中添加碱性蛋白酶，加酶量为2-5％，酶解温度为40-65℃，酶解至溶液pH为7时，加热灭酶后加入复合蛋白酶、木瓜蛋白酶，两种酶的添加总量为1-8％，两种酶的比例为(1-3)：1，保温40-60℃下不断搅拌，搅拌转速设定为15-25r/min，酶解3-5h，沸水浴中灭酶后得到酶解液B。

S5，将S4所得酶解液B放入离心机中离心分离，离心机转速为6000-8000r/min，离心时间10-20min，取上清液即为大豆蛋白酶解产物C。

S6，使上清液C通过1KDa的超滤膜，收集<1KDa组分，其分离参数为：上样量5L，温度4-8℃，压力0.5MPa；冷冻干燥得到大豆肽粉D；

S7，加水将大豆肽粉D溶解，采用DA201-C大孔吸附树脂对大豆肽进行脱盐纯化，室温下，将溶解后的大豆肽粉D泵入层析柱，使用55-75％乙醇进行解吸，洗脱速度1-3mL/min，收集洗脱液，真空旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得到大豆肽粉E。

S8，采用活性炭吸附分离法对大豆肽粉E进一步纯化，将大豆肽粉E加水溶解，使其终浓度为5-15mg/mL，按底物蛋白：活性炭质量比为(1-3)：1加入活性炭，调节体系pH值3.0-5.0于室温下震荡吸附1-3h后抽滤，收集沉淀，并用去离子水冲洗至中性，加入等体积55-75％乙醇溶液，在室温下震荡解析1-3h后，抽滤收集上清液，冷冻干燥得到得到一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽。

在本发明中，通过将大豆蛋白粉过筛得到大豆蛋白微粉，可以促进大豆蛋白的降解，从而提高其功能特性和水解度。本发明中加入的亚硫酸钠溶液可以打开大豆蛋白的二硫键，充分打开蛋白质的分子结构，使酶的作用位点充分暴露出来，促进大豆蛋白的降解。

在本发明中，先用碱性蛋白酶于pH8.5水解大豆蛋白，由于酶解过程中在碱性条件下进行时，质子化的氨基酸将离解，水解过程中的pH将不断下降，约1h后降到7.0左右，加热钝化碱性蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶和复合蛋白酶，在动态pH环境下进行酶解，有效减少盐的生成，以简化除盐工作。

本发明中收集1KDa组分的大豆蛋白肽，其能显著提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量。

本发明提出一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备方法，通过分步酶解得到大豆蛋白肽，对酶解后得到的大豆肽依次进行超滤分离、大孔树脂脱盐纯化、活性炭吸附得到一种具有高纯度的、分子量在1KDa以下的能够提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆肽，枯草芽孢杆菌的纳豆激酶产量达到24467.5Fu/g，而且成本低原料易得，本发明设计巧妙、工艺合理、适合推广。

有益效果：

本发明采用多酶协同分阶段水解的方式，因分段水解过程中无需添加酸或碱，减少了酶解过程中盐的生成，简化后期纯化脱盐工艺。

本发明结合生物酶解技术、膜超滤分离技术、DA201-C大孔吸附树脂及凝胶层析对大豆蛋白肽进行分离纯化、去除杂质，制备出具有促进枯草芽孢杆菌纳豆激酶含量的大豆肽。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段及特征易于明白了解，下面将对本发明试例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

碱性蛋白酶复合蛋白酶、木瓜蛋白酶均为商品化的酶，购于上海源叶生物科技有限公司。

实施例1

一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

S1，将大豆蛋白粉过40目筛后的到大豆蛋白微粉，用大豆蛋白微粉配制成蛋白质浓度为5％(w/v)的大豆蛋白悬浊液A。

S2，将悬浊液置于沸水水浴锅中5min，冷却后加入1％(w/v)浓度为0.5％的亚硫酸钠溶液；

S3，用1mol/L氢氧化钠调节大豆蛋白悬浊液的pH至8，并在55℃水浴过中预热10min。

S4，向大豆蛋白悬浊液A中添加碱性蛋白酶(购于上海源叶生物科技有限公司)，加酶量为2％，酶解温度为45℃，酶解至溶液pH为7时，加热灭酶后加入)，两种酶的添加总量为2％，复合蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为3：1，45℃下不断搅拌，搅拌转速设定为15r/min，搅拌3h，进行酶解，得到酶解液B。

S5，将S4所得酶解液B放入离心机中离心分离，离心机转速为6000r/min，离心时间10min，取上清液，冷冻干燥后即为大豆肽C，酶解液水解度为19.36±0.08％。

S6，对上清液C进行超滤分离纯化，使其通过10KDa超滤膜，然后一次通过3KDa和1KDa的超滤膜，酶解液被分成四个组分即组分I(M>10KDa)组分II(10KDa>M>3KDa)组分III(3KDa>M>1KDa)组分IV(M<1KDa)，收集各个组分，冷冻干燥得到四种组分的大豆肽粉D，将分离后的各组分分别加入到枯草芽孢杆菌培养基中，检测含有各个组分的培养基中的纳豆激酶产量，结果见表1，由于组分IV具有明显的提高纳豆激酶产量的效果，因此将组分IV进一步纯化，其余组分由于对枯草芽孢杆菌产纳豆激酶的促进效果不明显，则不再进一步纯化。

S7，采用DA201-C大孔吸附树脂对大豆肽组分IV(M<1KDa)进行脱盐纯化，室温下，将超滤分离后的大豆肽D(组分IV)泵入层析柱，使用55％乙醇进行解吸，洗脱速度1mL/min，收集洗脱液，真空旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得到大豆肽粉E。测定大豆肽粉E的脱盐率为96.9％，大豆蛋白肽的回收率为74.6％，如表1所示，脱盐后大豆蛋白肽比脱盐前同浓度的大豆蛋白肽具有更好的提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的效果。

S8，采用活性炭吸附分离法对大豆肽粉E进一步纯化，将大豆肽粉E加水溶解，使其终浓度为5mg/mL，按底物蛋白：活性炭质量比为1：1质量比加入活性炭，调节体系pH值值3.0于室温下震荡吸附1h后抽滤，收集沉淀，并用去离子水冲洗至中性，加入等体积75％乙醇溶液，在室温下震荡解析1h后，抽滤收集上清液，冷冻干燥得到一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽F。测定大豆蛋白肽的纯度为94.7％。

对本实施例步骤S6中所得的4个组分以及S8所得分离纯化后的大豆蛋白肽F对枯草芽孢杆菌产纳豆激酶的促进效果进行评定：枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶

平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH自然；

种子培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨15g/L，K

发酵培养基1：葡萄糖15g/L，蛋白胨15g/L，K

发酵培养基2：葡萄糖15g/L，大豆肽C15g/L，K

发酵培养基3：葡萄糖15g/L，大豆肽组分I15g/L，K

发酵培养基4：葡萄糖15g/L，大豆肽组分II 15g/L，K

发酵培养基5：葡萄糖15g/L，大豆肽组分III 15g/L，K

发酵培养基6：葡萄糖15g/L，大豆肽组分IV 15g/L，K

发酵培养基7：葡萄糖15g/L，大豆肽E15g/L，K

发酵培养基8：葡萄糖15g/L，大豆肽F15g/L，K

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061(保藏编号：CGMCC No.13932)于35℃平板活化菌种，24h后接种两环生长良好的菌体入50mL种子培养基，35℃、180rpm培养12h，然后按照2.5％(v/v)接种量转接到装液量为80mL发酵培养基/500mL三角瓶，35℃培养，转速为180rpm。发酵36h后测定各个培养基中纳豆激酶活性入表1所示。结果表明组分IV(<1KDa)的促进效果最好。

表1不同组分加入到枯草芽孢杆菌培养基中纳豆激酶的产量

实施例2

一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽及其制备方法，包括如下步骤：

S1，将大豆蛋白粉过60目筛后的到大豆蛋白微粉，用大豆蛋白微粉配制成蛋白质浓度为7％(w/v)的大豆蛋白悬浊液A。

S2，将悬浊液置于95℃水浴锅中8min，冷却后加入1％的浓度为0.5％的亚硫酸钠溶液。

S3，用1mol/L氢氧化钠调节大豆蛋白悬浊液的pH至9，并在55℃水浴过中预热。

S4，向大豆蛋白悬浊液A中添加碱性蛋白酶，加酶量为1.5％，酶解温度为55℃，酶解至溶液pH为7时，加热灭酶后加入复合蛋白酶、木瓜蛋白酶，两种酶的添加总量为3％，复合蛋白酶、木瓜蛋白酶的比例为2：1，保温55℃下不断搅拌，搅拌转速设定为20r/min，并不断添加氢氧化钠保持pH恒定，维持3h，进行酶解，得到酶解液B。

S5，将S4所得酶解液B放入离心机中离心分离，离心机转速为7000r/min，离心时间12min，取上清液，冷冻干燥后记得即为大豆肽C，酶解液水解度为20.31±0.08％。

S6，对上清液C进行超滤分离纯化，使其通过1KDa超滤膜，收集<1KDa的组分，分别冷冻干燥得到各组分的大豆肽粉D。

S7，采用DA201-C打孔吸附树脂对大豆肽进行脱盐纯化，室温下，将超滤分离后的大豆肽D泵入层析柱，使用65％乙醇进行解吸，洗脱速度2mL/min，收集洗脱液，真空旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得到大豆肽粉E。测定大豆肽粉E的脱盐率为95.3％，大豆蛋白肽的回收率为78.1％，如表一所示，脱盐后大豆蛋白肽比脱盐前同浓度的大豆蛋白肽具有更好的提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的效果。

S8，采用活性炭吸附分离法对大豆肽粉E进一步纯化，将大豆肽粉E加水溶解，使其终浓度为10mg/mL，按底物蛋白：活性炭质量比为2：1质量比加入活性炭，调节体系pH值4.0于室温下震荡吸附2h后抽滤，收集沉淀，并用去离子水冲洗至中性，加入等体积65％乙醇溶液，在室温下震荡解析2h后，抽滤收集上清液，冷冻干燥得到得到一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽F。测定大豆肽F的纯度为94.1％。

枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶

平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH自然；

种子培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨15g/L，K

发酵培养基：葡萄糖15g/L，大豆肽F15g/L，K

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061(保藏编号：CGMCC No.13932)于35℃平板活化菌种，24h后接种两环生长良好的菌体入50mL种子培养基，35℃、180rpm培养12h，然后按照2.5％(v/v)接种量转接到装液量为80mL发酵培养基/500mL三角瓶，35℃培养，转速为180rpm。发酵36h后测定培养基中纳豆激酶活性24069.8(Fu/g)

实施例3

一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽及其制备方法，包括如下步骤：

S1，将大豆蛋白粉过80目筛后的到大豆蛋白微粉，用大豆蛋白微粉配制成蛋白质浓度为10％(w/v)的大豆蛋白悬浊液A。

S2，将悬浊液置于95℃水浴锅中10min，冷却后加入2％的质量浓度为1％的亚硫酸钠溶液。

S3，用1mol/L氢氧化钠调节大豆蛋白悬浊液的pH至10，并在55℃水浴过中预热。

S4，向大豆蛋白悬浊液A中添加碱性蛋白酶，加酶量为2％，酶解温度为65℃，酶解至溶液pH为7时，加热灭酶后加入复合蛋白酶、木瓜蛋白酶，两种酶的添加总量为3％，复合蛋白酶、木瓜蛋白酶的比例为1：1，保温65℃下不断搅拌，搅拌转速设定为25r/min，维持3h，进行酶解，得到酶解液B。

S5，将S4所得酶解液B放入离心机中离心分离，离心机转速为8000r/min，离心时间15min，取上清液，冷冻干燥后即得大豆肽粉C，酶解液水解度为22.15±0.02％。

S6，对上清液C进行超滤分离纯化，使其通过1KDa的超滤膜，收集<1KDa的组分，冷冻干燥得到大豆肽粉D。

S7，采用DA201-C打孔吸附树脂对大豆肽D进行脱盐纯化，室温下，将超滤分离后的大豆肽D泵入层析柱，使用75％乙醇进行解吸，洗脱速度3mL/min，收集洗脱液，真空旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得到大豆肽粉E。测定大豆肽粉E的脱盐率为97.2％，大豆蛋白肽的回收率为75.6％，脱盐后大豆蛋白肽比脱盐前同浓度的大豆蛋白肽具有更好的提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的效果。

S8，采用活性炭吸附分离法对大豆肽粉E进一步纯化，将大豆肽粉E加水溶解，使其终浓度为15mg/mL，按底物蛋白：活性炭质量比为3：1质量比加入活性炭，调节体系pH值值5.0于室温下震荡吸附3h后抽滤，收集沉淀，并用去离子水冲洗至中性，加入等体积55％乙醇溶液，在室温下震荡解析3h后，抽滤收集上清液，冷冻干燥得到一种具有提高枯草芽孢杆菌纳豆激酶产量的大豆蛋白肽F。测定大豆肽F的纯度为96.3％。

枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶

平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH自然；

种子培养基：葡萄糖12g/L，蛋白胨15g/L，K

发酵培养基：葡萄糖15g/L，大豆肽F15g/L，K

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)gs-11061(保藏编号：CGMCC No.13932)于35℃平板活化菌种，24h后接种两环生长良好的菌体入50mL种子培养基，35℃、180rpm培养12h，然后按照2.5％(v/v)接种量转接到装液量为80mL发酵培养基/500mL三角瓶，35℃培养，转速为180rpm。发酵36h后测定培养基中纳豆激酶活性24896.4(Fu/g)。

纳豆激酶的检测方法：取0.7mL50mmol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液于0.2mL0.72％(w/v)的纤维蛋白原溶液混匀后，37℃放置5min。向上述溶液中加入0.1mL凝血酶溶液(20U/mL)充分混匀，37℃放置10min。再向上述反应体系中加入0.05mL稀释的酶溶液充分混匀，于37℃水浴中保温反应，分别在反应开始后的20分钟和40分钟时，分别混匀10秒。在准确计时60分钟后加入1mL0.2mol/L的三氯乙酸终止反应，并在37℃水浴中再保温20分钟。上述放映溶液于12000r/min下离心10分钟，测定离心上清液再275nm处的吸光值。一个酶活力单位(FU)定义为在37℃，pH8.0的条件下，每分钟在275nm处吸光值变化0.01所需的酶量。

比酶活定义：每毫克蛋白所含的酶活力单位数，即比活力＝活力FU·mg