一种微生物发酵生产单细胞蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种微生物发酵生产单细胞蛋白的方法，包括如下步骤：向装有驯化培养基的反应器中通入混合气，得到驯化体系，用于对接种物进行培养和驯化；向装有发酵培养基的反应器中通入混合气，得到混合发酵体系，用于对驯化微生物进行发酵培养；将厌氧微生物和好氧微生物接种到驯化体系中，进行培养和驯化，得到驯化微生物；将驯化微生物接种到混合发酵体系中，进行发酵培养；将发酵产物进行处理，得到单细胞蛋白。本发明相较于单一底物发酵体系，同时供应混合气和有机碳源的双底物发酵体系更有助于微生物转化氨氮，生产单细胞蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及一种单细胞蛋白的生产方法。更具体的，涉及一种微生物发酵生产单细胞蛋白的方法。

背景技术

2050年世界人口预计增长到90-100亿，届时粮食需求量将增加30％-60％，而且伴随着生活水平的提高，人们会对高蛋白类食品有越来越多的额外需求。自然界中的 氮主要以N

单细胞蛋白是指可作为人类食物和动物饲料的酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物的干细胞。单细胞蛋白中粗蛋白含量高，氨基酸种类丰富，其营养价值高于植物蛋白， 且与动物蛋白类似。与现有的蛋白质供应链相比，以微生物为核心的蛋白质供应链具 有更广阔的发展前景，具体表现为：1)原料来源广泛：工业污水、啤酒废液、废甜 菜粕、果渣、玉米秸秆等废弃物均可作为生产单细胞蛋白的原料，以废弃物为底物不 仅能减轻环境负担，还能实现资源的高效回收，创造新的价值；2)生产效率高，产 量大：利用现有的发酵技术即可实现大规模生产，而且微生物繁殖快，生产效率高且 产量稳定；3)适宜条件范围广：能合成蛋白质的微生物大多在常温下即可生长繁殖， 受气候和季节的影响较小，可实现全年全天候生产；4)占地面积小，设备简单易控 制：单细胞蛋白的生产在完全可控的、封闭的自动化生物反应器中进行，不仅摆脱了 对土地和气候的依赖，而且生产过程更容易控制，活性氮利用率几乎可达100％。

综上所述，需要提供了一种微生物发酵高效生产单细胞蛋白的方法，利用微生物的发酵作用，将活性氮转化为高蛋白产品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种微生物发酵高效生产单细胞蛋白的方法。该方法将混合气与特定培养基耦合形成特定的驯化体系与混合发酵体系。驯化体系能够 对接种物进行培养与驯化，得到具有产蛋白能力的混合菌群；混合发酵体系用于对驯 化微生物进行发酵培养，利用微生物的发酵作用将体系中的活性氮转化为高附加值蛋 白产品。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种微生物发酵生产单细胞蛋白的方法，包括如下步骤：

S1、向装有驯化培养基的反应器中通入混合气，得到驯化体系，用于对接种物进行培养和驯化；

S2、向装有发酵培养基的反应器中通入混合气，得到混合发酵体系，用于对驯化微生物进行发酵培养；

S3、将厌氧微生物和好氧微生物接种到驯化体系中，进行培养和驯化，得到驯化微生物；

S4、将驯化微生物接种到混合发酵体系中，进行发酵培养；

S5、将发酵产物进行处理，得到单细胞蛋白。

本发明中，术语“厌氧微生物”是指能够进行正常进行厌氧发酵并生产沼气的混合微生物。微生物的来源主要是厌氧发酵罐出料，发酵罐的底物主要为畜禽粪便。

本发明中，术语“好氧微生物”是指能够进行正常进行好氧发酵的混合微生物。 微生物的来源主要是城市污水处理厂污泥。

本发明中，术语“驯化体系”是指该体系能够对厌氧微生物和好氧微生物进行培养与驯化，最终得到能够生产单细胞蛋白的微生物，具体是装有驯化培养基并充满混 合气的反应器。驯化后的微生物具有的功能包括：1)利用混合气或有机碳源为底物 进行生长；2)将活性氮转化为单细胞蛋白。

本发明中，术语“混合发酵体系”是指能够维持驯化微生物生长，以及将体系中 活性氮转化为单细胞蛋白的体系，具体是装有发酵培养基并充满混合气的反应器。

作为技术方案的进一步改进，步骤S1中，所述驯化培养基的制备包括以下步骤：

S1-1、配置基础培养基

所述基础培养基的配方为每升溶液中含有以下量的物质：磷酸二氢钾2.3g、磷 酸氢二钠2.9g、氯化铵1g、硫酸镁0.5g、碳酸钠0.5g、氯化钙0.01g、柠檬酸铁铵0.05g、硼酸0.6mg、氯化钴0.4mg、硫酸锌0.2mg、氯化锰0.06mg、钼酸钠0.06 mg、氯化镍0.04mg、硫酸铜0.02mg；

S1-2、将基础培养基在120-125℃下灭菌15-30min，冷却至室温后加入15g/L琼脂，得到驯化培养基。

优选地，步骤S1中，混合气中H

作为技术方案的进一步改进，步骤S2中，所述发酵培养基的制备包括以下步骤：

S2-1、配置基础培养基

所述基础培养基的配方为每升溶液中含有以下量的物质：磷酸二氢钾2.3g、磷 酸氢二钠2.9g、氯化铵1g、硫酸镁0.5g、碳酸钠0.5g、氯化钙0.01g、柠檬酸铁铵 0.05g、硼酸0.6mg、氯化钴0.4mg、硫酸锌0.2mg、氯化锰0.06mg、钼酸钠0.06 mg、氯化镍0.04mg、硫酸铜0.02mg；

S2-2、将基础培养基在120-125℃下灭菌15-30min，冷却至室温后添加外源有机碳源和氮源，混合均匀，得到发酵培养基。

优选地，步骤S2-2中，所述外源有机碳源为葡萄糖，葡萄糖添加量为1-100g/L；

优选地，步骤S2-2中，所述氮源为NH

优选地，步骤S2中，混合气中H

作为技术方案的进一步改进，步骤S3中，所述培养和驯化在摇床反应器中进行，反应条件为温度25-35℃，pH＝6.0-8.0，摇床反应器的振荡速率为150±50rpm。

优选地，所述摇床反应器中液相基质与摇床反应器顶空的体积比为200:415～300:315。

优选地，步骤S3中，接种物(厌氧微生物和好氧微生物)与驯化培养基用量的 体积比为50:250至50:150。

优选地，步骤S3中，每12-24小时向驯化体系内补充混合气至0.1-5atm。

优选地，步骤S3中，所述厌氧微生物和好氧微生物接种量的体积比为25:25。

优选地，步骤S3中，驯化完成的判断条件如下：驯化体系中的混合气日消耗 量>60％。

作为技术方案的进一步改进，步骤S4中，所述发酵培养在摇床反应器中进行， 反应条件为温度25-35℃，pH＝6.0-8.0，摇床反应器的振荡速率为150±50rpm。

优选地，所述摇床反应器中液相基质与反应器顶空的体积比为100:515～250:365。

优选地，步骤S4中，所述驯化微生物与混合发酵体系中的发酵培养基用量的体 积比为40:210～40:60。

优选地，步骤S4中，每12-24小时向混合发酵体系内补充混合气至0.1-5atm。

作为技术方案的进一步改进，步骤S5中，所述处理包括以下步骤：

S5-1、将发酵产物在9000-11000rpm下离心10-15min，弃去上清液；

S5-2、离心后的发酵产物用去离子水清洗后再次离心，重复1-3次；

S5-3、经过多次离心清洗后的发酵产物在103-108℃下烘烤20-28小时，得到单 细胞蛋白。

优选地，步骤S5中，所述单细胞蛋白形成的标准为以下方法中的一种或多种：1)培养基中氨氮转化量>40％；2)产品中粗蛋白含量>30％。

本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。

如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。

与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：

1)本发明设计了用于微生物培养与驯化的驯化体系和用于驯化微生物发酵培养的混合发酵体系。其中，驯化体系用于对接种物进行培养和驯化，得到具有产蛋白能 力的混合菌群；混合发酵体系用于对驯化微生物进行发酵培养，利用微生物的发酵作 用将体系中的活性氮转化为高蛋白产品。

2)关于生产单细胞蛋白细菌的研究，大部分以纯菌为目标物研究其代谢特征。 而以纯菌为核心的无菌培养因操作繁琐、无菌环境难以维持、难以扩大培养规模等原 因，难以用于处理实际废水。与纯菌相比，混合菌群对外界环境变化有较强的缓冲能 力，且培养所需操作简单，较易实现大规模培养。本发明设计了一种驯化体系，能迅 速富集出具有产单细胞蛋白能力的混合菌群。

3)目前，处理水体中活性氮的方法有硝化-反硝化、厌氧氨氧化等，而其结果确 是将活性氮转化为N

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本 领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以 此限制本发明的保护范围。

作为本发明的一个方面，本发明一种微生物发酵生产单细胞蛋白的方法，包括如下步骤：

S1、向装有驯化培养基的反应器中通入混合气，得到驯化体系，用于对接种物进行培养和驯化；

S2、向装有发酵培养基的反应器中通入混合气，得到混合发酵体系，用于对驯化微生物进行发酵培养；

S3、将厌氧微生物和好氧微生物接种到驯化体系中，进行培养和驯化，得到驯化微生物；

S4、将驯化微生物接种到混合发酵体系中，进行发酵培养；

S5、将发酵产物进行处理，得到单细胞蛋白。

根据本发明的某些实施方式，步骤S1中，所述驯化培养基的制备包括以下步骤：

S1-1、配置基础培养基

所述基础培养基的配方为每升溶液中含有以下量的物质：磷酸二氢钾2.3g、磷 酸氢二钠2.9g、氯化铵1g、硫酸镁0.5g、碳酸钠0.5g、氯化钙0.01g、柠檬酸铁铵 0.05g、硼酸0.6mg、氯化钴0.4mg、硫酸锌0.2mg、氯化锰0.06mg、钼酸钠0.06 mg、氯化镍0.04mg、硫酸铜0.02mg；

S1-2、将基础培养基在120-125℃下灭菌15-30min，冷却至室温后加入15g/L琼脂，得到驯化培养基。

根据本发明的某些实施方式，步骤S1中，混合气中H

根据本发明的某些实施方式，步骤S2中，所述发酵培养基的制备包括以下步骤：

S2-1、配置基础培养基

所述基础培养基的配方为每升溶液中含有以下量的物质：磷酸二氢钾2.3g、磷 酸氢二钠2.9g、氯化铵1g、硫酸镁0.5g、碳酸钠0.5g、氯化钙0.01g、柠檬酸铁铵 0.05g、硼酸0.6mg、氯化钴0.4mg、硫酸锌0.2mg、氯化锰0.06mg、钼酸钠0.06 mg、氯化镍0.04mg、硫酸铜0.02mg；

S2-2、将基础培养基在120-125℃下灭菌15-30min，冷却至室温后添加外源有机碳源和氮源，混合均匀，得到发酵培养基。

进一步地，步骤S2-2中，所述外源有机碳源为葡萄糖，葡萄糖添加量为1-100g/L。有机碳源添加量过低对微生物的生长无太大促进作用，致使产量降低；添加量过高会 降低产品中粗蛋白含量。

进一步地，步骤S2-2中，所述氮源为NH

根据本发明的某些实施方式，步骤S2中，混合气中H

根据本发明的某些实施方式，步骤S3中，所述培养和驯化在摇床反应器中进行，反应条件为温度25-35℃，pH＝6.0-8.0，摇床反应器的振荡速率为150±50rpm。

进一步地，所述摇床反应器中液相基质与摇床反应器顶空的体积比为200:415至300:315。有效容积过低会影响反应器利用率；过高则无法供给微生物生长所需的混 合气，影响发酵的进行。

进一步地，步骤S3中，接种物(厌氧微生物和好氧微生物)与驯化培养基用量 的体积比为50:250至50:150。接种量过大或者过小，均会影响发酵，过大会造成混 合气供应不足，影响产物合成；过小会延长培养时间，降低反应器的产率。

进一步地，步骤S3中，每12-24小时向驯化体系内补充混合气至0.1-5atm。微 生物生长需要消耗混合气，混合气供应过少会影响微生物的发酵活性，影响发酵进行； 供应过多反应器难以维持内部压强。

进一步地，步骤S3中，所述厌氧微生物和好氧微生物接种量的体积比为25:25。

进一步地，步骤S3中，驯化完成的判断条件如下：驯化体系中的混合气日消耗 量>60％。

根据本发明的某些实施方式，步骤S4中，所述发酵培养在摇床反应器中进行， 反应条件为温度25-35℃，pH＝6.0-8.0，摇床反应器的振荡速率为150±50rpm。

进一步地，所述摇床反应器中液相基质与反应器顶空的体积比为100:515至 250:365。有效容积过低会影响反应器利用率；过高则无法供给微生物生长所需的混 合气，影响发酵的进行。

进一步地，步骤S4中，所述驯化微生物与混合发酵体系中的发酵培养基用量的 体积比为40:210至40:60。接种量过大或者过小，均会影响发酵，过大会造成混合气 供应不足，影响产物合成；过小会延长培养时间，降低反应器的生产率。

进一步地，步骤S4中，每12-24小时向混合发酵体系内补充混合气至0.1-5atm。 微生物生长需要消耗混合气，混合气供应过少会影响微生物的发酵活性，影响发酵进 行；供应过多反应器难以维持内部压强。

根据本发明的某些实施方式，步骤S5中，所述处理包括以下步骤：

S5-1、将发酵产物在9000-11000rpm下离心10-15min，弃去上清液；

S5-2、离心后的发酵产物用去离子水清洗后再次离心，重复1-3次；

S5-3、经过多次离心清洗后的发酵产物在103-108℃下烘烤20-28小时，得到单 细胞蛋白。

进一步地，步骤S5中，所述单细胞蛋白形成的标准为以下方法中的一种或多种：1)培养基中氨氮转化量>40％；2)产品中粗蛋白含量>30％。

一种可用于生产单细胞蛋白的微生物的驯化方法，具体步骤如下：

1)配置基础培养基，灭菌后添加15g/L琼脂；所述基础培养基的配方为每升溶 液中含有以下量的物质：磷酸二氢钾2.3g、磷酸氢二钠2.9g、氯化铵1g、 硫酸镁0.5g、碳酸钠0.5g、氯化钙0.01g、柠檬酸铁铵0.05g、硼酸0.6mg、 氯化钴0.4mg、硫酸锌0.2mg、氯化锰0.06mg、钼酸钠0.06mg、氯化镍 0.04mg、硫酸铜0.02mg；

2)接种厌氧微生物和好氧微生物；

3)调节驯化体系温度和pH，通入体积比为H

4)每12-24小时向反应体系内补充混合气至1atm左右；

5)当反应器内顶空中的混合气日消耗量>60％时，即认定驯化完成，获得可用 于生产单细胞蛋白的微生物。

本实施例中温度控制为30℃，摇床反应器振荡速率为150rpm，初始pH设置为 7.0，整个过程中pH控制在7.0±0.2的范围内。

本实施例驯化体系中微生物对混合气的消耗情况如下表1所示：

表1：驯化过程中微生物的混合气日消耗量

本实施例中，驯化过程中前4天每24小时向驯化体系中补充混合气至1atm；4 天后每12小时向驯化体系中补充混合气至1atm。驯化过程完成的较快，5天后驯化 微生物的混合气消耗量超过60％，且能维持稳定。

一种微生物发酵高效生产单细胞蛋白的方法，具体步骤如下：

1)配置基础培养基，灭菌后添加NH

2)向培养基中添加葡萄糖，葡萄糖添加量为8.25g/L；

3)调节温度和pH，通入体积比为H

4)每12小时向反应体系内补充混合气至1atm左右；

5)在发酵体系中培养12天后，停止反应；

6)将发酵产物在10000rpm下离心10min，弃去上清液；离心后的发酵产物用 去离子水清洗后再次离心，重复2次；

7)经过3次离心后的发酵产物在105℃下烘烤24小时，得到单细胞蛋白。

本实施例中温度控制为30℃，摇床反应器振荡速率为150rpm，初始pH设置为 7.0，整个过程中pH控制在7.0±0.2的范围内。

本实施例发酵体系中微生物的氨氮转化量及单细胞蛋白的产量分析结果如表2所示。从表2可以看出，本实施例发酵体系中氨氮转化量高于40％，产品中粗蛋白含 量高于30％，符合单细胞蛋白的形成条件。

重复实施例2，不同之处仅在于：步骤2)中，所述葡萄糖添加量为16.50g/L。

本实施例发酵体系中微生物的氨氮转化量及单细胞蛋白的产量如表2所示。从表2可以看出，本实施例发酵体系中氨氮转化量、单细胞蛋白产量均高于实施例2，产 品中粗蛋白含量与实施例2接近。

重复实施例2，不同之处仅在于：步骤2)中，所述葡萄糖添加量为24.75g/L。

本实施例发酵体系中微生物的氨氮转化量及单细胞蛋白的产量分析结果如表2所示。从表2可以看出，本实施例发酵体系中氨氮转化量、单细胞蛋白产量以及产品 中粗蛋白含量均高于实施例3。

重复实施例2，不同之处仅在于：步骤2)中，所述葡萄糖添加量为33.00g/L。

本实施例发酵体系中微生物的氨氮转化量及单细胞蛋白的产量分析结果如表2所示。从表2可以看出，本实施例发酵体系中氨氮转化量、单细胞蛋白产量高于实施 例4，但产品中粗蛋白含量减少。

重复实施例2，不同之处仅在于：步骤2)中，所述葡萄糖添加量为41.25g/L。

本实施例发酵体系中微生物的氨氮转化量及单细胞蛋白的产量分析结果如表2所示。从表2可以看出，本实施例发酵体系中氨氮转化量、单细胞蛋白产量高于实施 例5，产品中粗蛋白含量与实施例5接近。

表2：不同有机碳源添加量下各发酵体系的发酵情况

一种微生物发酵高效生产单细胞蛋白的方法，具体步骤如下：

1)配置基础培养基，灭菌后添加NH

2)调节温度和pH，通入体积比为H

3)每12小时向反应体系内补充混合气至1atm左右；

4)在发酵体系中培养12天后，停止反应；

5)将发酵产物在10000rpm下离心10min，弃去上清液；离心后的发酵产物用 去离子水清洗后再次离心，重复2次；

6)经过3次离心后的发酵产物在105℃下烘烤24小时，得到单细胞蛋白。

本对比例中温度控制为30℃，摇床反应器振荡速率为150rpm，初始pH设置为 7.0，整个过程中pH控制在7.0±0.2的范围内。

本对比例发酵体系微生物的氨氮转化量及单细胞蛋白的产量分析结果如下表3所示。从表3可以看出，本对比例发酵体系中氨氮转化量高于40％，但产品中粗蛋白 含量低于30％，就产品中粗蛋白含量而言，未达到本发明中认定的单细胞蛋白的形成 标准。

一种微生物发酵高效生产单细胞蛋白的方法，具体步骤如下：

1)配置基础培养基，灭菌后添加NH

2)向培养基中添加葡萄糖，葡萄糖添加量为16.50g/L；

3)调节温度和pH，在发酵体系中培养12天后，停止反应；

4)将发酵产物在10000rpm下离心10min，弃去上清液；离心后的发酵产物用 去离子水清洗后再次离心，重复2次；

5)经过3次离心后的发酵产物在105℃下烘烤24小时，得到单细胞蛋白。

本对比例中温度控制为30℃，摇床反应器振荡速率为150rpm，初始pH设置为 7.0，整个过程中pH控制在7.0±0.2的范围内。

本对比例发酵体系微生物的氨氮转化量及单细胞蛋白的产量分析结果如下表3所示。从表3可以看出，本对比例发酵体系中氨氮转化量低于40％，产品中粗蛋白含 量低于30％，均未达到本发明中认定的单细胞蛋白的形成标准。

表3：不同底物下各发酵体系的发酵情况

从对比例1，2和实施例3的结果来看，实施例1中驯化的微生物能够以混合气 或有机碳源中的一种或两种为底物转化氨氮，生产单细胞蛋白。但如表3所示，单一 底物发酵体系中，氨氮转化量和产品中粗蛋白含量均低于双底物发酵体系；且就产品 中粗蛋白含量而言，单一底物发酵体系未能高效生产单细胞蛋白。因此，相较于单一 底物发酵体系，同时供应混合气和有机碳源的双底物发酵体系更有助于微生物转化氨 氮，生产单细胞蛋白。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上 还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是 属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围 之列。