液-液相分离驱动的基于蛋白质的水下粘合涂层

摘要

液‑液相分离(LLPS)驱动的基于蛋白质的水下粘合涂层是由包含海洋粘合蛋白质(MAP)结构域和液‑液相分离介导的低复杂度(LC)结构域的二聚蛋白质制成。

说明书

引言

可以通过蛋白质中的低复杂度(LC)结构域促进的液-液相分离(LLPS)与医学意义在生理学上高度相关；例如，影响蛋白质的LLPS能力的突变可以驱动神经退行性疾病如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和泛素阳性额颞叶变性(FTLD-U)的发病机制。我们的研究小组探索被像贻贝、藤壶和沙堡蠕虫那样的海洋生物使用的锚定斑块启发的生物启发的水下粘合剂。寻求开发超强的水下粘合涂层，并从已知的增加润湿的生物物理过程中汲取灵感，我们探索了使用LLPS以改善作为水下粘合剂的含有LC结构域蛋白质的润湿性质和自组装。我们证明LLPS驱动的机制促进润湿、吸附、底涂和在各种基底包括像特氟龙那样具有挑战性的材料和像微流体装置内表面那样难以接近的位置上的致密且均匀的淀粉状蛋白纳米纤维涂层的形成。此外，涂层可以在宽的pH值范围容易地沉积在基底上。我们的LLPS驱动的涂层具有的水下粘合能远大于曾经报道的最强的基于蛋白质的水下粘合剂。

发明概述

本发明提供用于制备液-液相分离(LLPS)驱动的基于蛋白质的水下粘合涂层的方法和组合物。在一个方面，本发明提供一种二聚蛋白质，其包含海洋粘合蛋白质(adhesiveprotein)(MAP)结构域和液-液相分离(LLPS)介导的低复杂度(LC)结构域。

在实施方案中：

-结构域在融合蛋白质中连接；

-结构域通过结构域上的亲和标签连接；

-海洋粘合蛋白质(MAP)包含选自以下的多肽：

a)贻贝足蛋白质(mfp5、mfp3、mfp3s)；

b)藤壶蛋白质(cp19k、cp20k和cp68k藤壶表面粘合蛋白质)；和

c)沙堡蠕虫粘合蛋白质(Pc2和Pc3)；

-低复杂度(LC)结构域包含选自以下的多肽：

LC结构域TAR DNA结合蛋白质43(TDP-43)(263-414)；

融合在肉瘤中的RNA结合蛋白质(FUS)(2-214)；

异质核内核糖核蛋白质A1(hnRNPA1)(186-320)；

异质核内核糖核蛋白质A2(hnRNPA2)(181-341)；

细胞毒性颗粒相关的RNA结合蛋白质TIA1(280-375)；

细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白质2(CPEB2)(2-137)；

脆性X智力低下蛋白质(FMRP)(466-632)；

冷诱导RNA结合蛋白质(CIRBP)(1-172)；

RNA结合基序(RNP1，RRM)蛋白质3(RBM3)(1-157)；和

酵母Sup35(2-134)；和/或

-二聚蛋白质选自特定的实例，包括：GFP-FUS LC-mfp5、mfp5-FUS LC、mfp3-TDP-43LC、mCherry-FUS LC-mfp3和Spytag-FUS LC:mfp5-spycatcher。

一方面，本发明提供淀粉状蛋白纳米纤维涂层，其包含主题二聚蛋白质，特别是在水下，并且特别是其中在基底上微图案化所述涂层。在实施方案中，所述涂层提供的水下粘合能是相应的MAP涂层的至少两倍，通常为2-3倍，通常大于30或40mJ m

一方面，本发明提供一种包含主题涂层的基底。

在实施方案中，所述基底选自金属、聚合物和无机基底，柔性和内部基底表面，例如微流体通道和微管。

一方面，本发明提供一种在基底上制备淀粉状蛋白纳米纤维涂层的方法，所述方法包括：在其中在基底上形成包含二聚蛋白质的LLPS诱导的淀粉状蛋白纳米纤维涂层的条件下孵育主题二聚蛋白质。

在实施方案中：

-所述方法在pH3-11的pH条件下操作或可操作。

-所述基底选自金属、聚合物和无机基底，柔性和内部基底表面，例如微流体通道和微管。

-所述涂层例如通过掩模辅助的图案化或软光刻(例如微转移模塑或复制模塑)在基底上被微图案化。

本发明包括所列举的特定实施方案的所有组合，就好像每个组合已经被费力地列举一样。

附图简述

图1A-D.用于工程液-液相分离诱导的自组装水下粘合剂的组合和模块化蛋白质结构域策略。(A)在海洋贻贝的粘合斑块中起作用的粘合蛋白质mfp5的示意图。Mfp5是富含赖氨酸和多巴(Dopa)残基的贻贝粘合足蛋白质，在溶液中显示出无规卷曲结构，并且对于贻贝的界面水下粘合是必要的。(B)人类TAR DNA结合蛋白质43(TDP-43)与特定RNA一起形成介导神经元细胞中的细胞过程的TDP-43核糖核蛋白质(RNP)颗粒的示意图。TDP-43既包含RNA识别基序，又包含低复杂度结构域，该结构域是富含甘氨酸和有助于RNP颗粒的自组装的不带电荷的极性氨基酸残基的内在无序的结构域，所述RNP颗粒的自组装由称为液-液相分离(LLPS)的过程驱动。(C)通过合理地融合编码A和B中所示的蛋白质结构域的序列以形成His标记的mfp5-TDP-43LC(“MTLC”)融合蛋白质，实现粘合蛋白质的模块化遗传设计。(D)溶液中的MTLC融合蛋白质单体可以组装成由LLPS驱动的凝结的液体状液滴(左)。液体状液滴倾向于散布并吸附在表面上，促进MTLC涂层的底涂过程(中左)。液体状液滴在基底表面附近局部富集，并且这些液滴具有高浓度的蛋白质单体，因此促进基底上原纤维的形成(中右)。然后，另外的单体可以聚集在这些表面定位的原纤维上，最终在表面上形成淀粉状蛋白纳米纤维涂层。由于它们的高表面积和暴露在淀粉状蛋白核心外部的纳米纤维表面的MTLC mfp5结构域的粘合性质，MTLC纳米纤维涂层表现出强大的水下粘合。

图2A-G.LLPS诱导的MTLC粘合涂层的形态和结构表征。(A)通过在4℃和25℃下孵育MTLC单体溶液并用刚果红对相应样品进行染色(较下左)制成的粘合涂层的照片(顶部左)。两个样品的mfp5-TDP-43LC纳米纤维的X射线纤维衍射图(右)显示了淀粉状蛋白纳米纤维的交叉β脊的典型衍射图，其中子午反射(d

图3A-E.粘合涂层的水下粘合性能。(A)用于测量光滑云母表面上粘合涂层的不对称粘合的胶体AFM探针的示意图。(B)在4℃和25℃下产生的MTLC涂层的粘合力(归一化力(F/R)和粘合能(E

图4A-E.液-液相分离诱导的MTLC粘合涂层的应用。(A)未涂覆的聚四氟乙烯(TEFLON，“特氟龙”)(顶部左)和涂覆有相分离诱导的MTLC粘合剂的特氟龙(顶部右)以及未涂覆的特氟龙(底部左)和LLPS诱导的MTLC涂覆的特氟龙(底部右)上红色QD吸附的数码相机图像，以及来自水接触角分析的插图数据。在UV光(254nm)下拍摄图像。(B)形成在特氟龙上的LLPS诱导的MTLC粘合涂层的连续层的SEM截面图像(顶部)和相应的X射线光电子能谱(XPS)，显示在涂覆的特氟龙基底中代表N、O和C(来自蛋白质结构)的独特元素信号，与裸特氟龙中显示的主要F和C信号形成对比。(C)特氟龙管的UV照射照片(顶部)和3D共聚焦显微照片(底部)，显示吸附在MTLC涂覆的管内壁上的红色QD。(D)具有用红色QD后处理的MTLC涂覆的通道的微流体装置的示意图(顶部)、UV照射照片(中)和3D共聚焦显微照片(底部)。(E)显示特氟龙基底上损坏(划痕)修复的示意图。我们将溶液中纯化的MTLC单体与非粘性荧光球形聚苯乙烯(PS)微球共同注入损坏部位周围。在4℃下孵育12小时后，LLPS诱导的MTLC涂层在基底和PS微球表面上形成，起胶粘剂的作用以将微球彼此聚集并与基底表面聚集，从而将它们保持在适当的位置，并因此填充损坏部位(右)。(E)照片(顶部)和SEM(底部)图像显示使用LLPS诱导的涂层修复之前和之后损坏的特氟龙基底。在UV光(254nm)下拍摄的修复样品的照片。放大的SEM图像清楚地显示在损坏部位微球堆积并粘在一起。

图5A-E.(A)显示覆盖在载玻片上的由PDMS制成的流体装置的示意图。(B)通过共聚焦荧光显微镜拍摄的3D图像。(C)在UV光下拍摄的原位照片。(D)SEM图像和(E)显示通道内壁被蛋白质涂覆的SEM截面图像。

图6A-C.(A)在MTLC涂覆的表面上组装的红色OD的数码图像。(B)微PE管的3D图像。红色QD组装在MTLC涂覆的内壁上。(C)带有/不带有MTLC涂层的各种表面的水接触角测量。

图7A-C.(A)组装在通过特定掩膜板介导的光刻图案上的QD。(B)组装在软光刻图案上的QD。(C)微型图案在绿色激光下显示有序的光点，这表示实现长程有序图案。

图8A-C.(A)通过无电金属沉积在PP Eppendorf管内壁上的MTLC涂层(左)和铜沉积(右)的照片。(B)在铜沉积之前和之后由3D打印机打印的多孔树脂模型的照片。(C)铜沉积3D模型的C-V曲线。插入的图像是铜沉积3D模型的电路演示，该3D模型用作电导体以点亮二极管。

本发明的具体实施方案的描述

本文的实施方案和实施例仅以说明的方式而不是限制的方式提供。本领域的技术人员将容易认识到可以改变或修改以产生基本相似结果的各种非关键参数。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且鉴于其的各种修改或改变将被建议给本领域的技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。

本发明提供用于制备液-液相分离(LLPS)驱动的基于蛋白质的水下粘合涂层的方法和组合物。在一个方面，本发明提供一种融合蛋白质，其包含海洋粘合蛋白质(MAP)结构域和液-液相分离(LLPS)介导的低复杂度(LC)结构域。

MAP是众所周知的且研究充分的一类蛋白质(例如，Wilker等人，Curr Opin ChemBiol.2010Apr；14(2)：276-83)，包括针对功能性质修饰的重组形式，例如Yang等人Biofouling.2013；29(5):483-90。在实施方案中，只要保留功能性淀粉状蛋白纳米纤维的形成和粘合性质，MAP可以被截断。

液-液相分离(LLPS)介导的低复杂度(LC)结构域是众所周知的且研究充分的一类蛋白质结构域，具有特征性的结构-活性-关系，例如Martin等人Biochemistry.2018年5月1日；57(17):2478-248；Kato等人，Cell,2012,149(4):753-767；等。在实施方案中，只要保留LLPS介导功能，LC可以被截断。

MAP和LC结构域可以是在融合蛋白质中或通过结构域上的亲和标签被连接的连接的结构域，所述亲和标签是非共价的，例如HA、myc、FLAG或His6标签，或共价的，例如spytag、snooptag、isopeptag或dogtag。

表A.示例性的截断的功能性LLPS介导的LC结构域

TAR DNA结合蛋白质43(TDP-43)(263-414)

KHNSNRQLERSGRFGGNPGGFGNQGGFGNSRGGGAGLGNNQGSNMGGGMNFGAFSINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQQNQSGPSGNNQNQGNMQREPNQAFGSGNNSYSGSNSGAAIGWGSASNAGSGSGFNGGFGSSMDSKSSGWGM

融合在肉瘤中的RNA结合蛋白质(FUS)(2-214)

ASNDYTQQATQSYGAYPTQPGQGYSQQSSQPYGQQSYSGYSQSTDTSGYGQSSYSSYGQSQNTGYGTQSTPQGYGSTGGYGSSQSSQSSYGQQSSYPGYGQQPAPSSTSGSYGSSSQSSSYGQPQSGSYSQQPSYGGQQQSYGQQQSYNPPQGYGQQNQYNSSSGGGGGGGGGGNYGQDQSSMSSGGGSGGGYGNQDQSGGGGSGGYGQQDRG

异质核内核糖核蛋白质A1(hnRNPA1)(186-320)

MASASSSQRGRSGSGNFGGGRGGGFGGNDNFGRGGNFSGRGGFGGSRGGGGYGGSGDGYNGFGNDGSNFGGGGSYNDFGNYNNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGSSSSSSYGSGRRF

异质核内核糖核蛋白质A2(hnRNPA2)(181-341)

MQEVQSSRSGRGGNFGFGDSRGGGGNFGPGPGSNFRGGSDGYGSGRGFGDGYNGYGGGPGGGNFGGSPGYGGGRGGYGGGGPGYGNQGGGYGGGYDNYGGGNYGSGNYNDFGNYNQQPSNYGPMKSGNFGGSRNMGGPYGGGNYGPGGSGGSGGYGGRSRY

细胞毒性颗粒相关的RNA结合蛋白质TIA1(280-375)

INPVQQQNQIGYPQPYGQWGQWYGNAQQIGQYMPNGWQVPAYGMYGQAWNQQGFNQTQSSAPWMGPNYGVQPPQGQNGSMLPNQPSGYRVAGYETQ

细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白质2(CPEB2)(2-137)

PPPSPDSENGFYPGLPSSMNPAFFPSFSPVSPHGCTGLSVPTSGGGGGGFGGPFSATAVPPPPPPAMNIPQQQPPPPAAPQQPQSRRSPVSPQLQQQHQAAAAAFLQQRNSYNHHQPLLKQSPWSNHQSSGWGTGSM

脆性X智力低下蛋白质(FMRP)(466-632)

GQGMGRGSRPYRNRGHGRRGPGYTSGTNSEASNASETESDHRDELSDWSLAPTEEERESFLRRGDGRRRGGGGRGQGGRGRGGGFKGNDDHSRTDNRPRNPREAKGRTTDGSLQIRVDCNNERSVHTKTLQNTSSEGSRLRTGKDRNQKKEKPDSVDGQQPLVNGVP

冷诱导RNA结合蛋白质(CIRBP)(1-172)

MASDEGKLFVGGLSFDTNEQSLEQVFSKYGQISEVVVVKDRETQRSRGFGFVTFENIDDAKDAMMAMNGKSVDGRQIRVDQAGKSSDNRSRGYRGGSAGGRGFFRGGRGRGRGFSRGGGDRGYGGNRFESRSGGYGGSRDYYSSRSQSGGYSDRSSGGSYRDSYDSYATHNE

RNA结合基序(RNP1，RRM)蛋白质3(RBM3)(1-157)

MSSEEGKLFVGGLNFNTDEQALEDHFSSFGPISEVVVVKDRETQRSRGFGFITFTNPEHASVAMRAMNGESLDGRQIRVDHAGKSARGTRGGGFGAHGRGRSYSRGGGDQGYGSGRYYDSRPGGYGYGYGRSRDYNGRNQGGYDRYSGGNYRDNYDN

酵母Sup35(2-134)

SDSNQGNNQQNYQQYSQNGNQQQGNNRYQGYQAYNAQAQPAGGYYQNYQGYSGYQQGGYQQYNPDAGYQQQYNPQGGYQQYNPQGGYQQQFNPQGGRGNYKNFNYNNSLQGYQAGFQPQSQGMSLNDFQKQQKQ

在该具体实施方案中，我们设计了一种融合蛋白质，其包含来自海洋贻贝的全长粘合足蛋白质(mfp5)，人类TAR DNA结合蛋白质43的LC结构域(TDP-43)和N-末端His-标签以促进纯化(图1A-C)。mfp5是一种非常“粘”的蛋白质，富含赖氨酸和翻译后修饰的酪氨酸残基(L-3,4-二羟基苯丙氨酸；多巴)，这对于促进贻贝水下粘合的界面相互作用是必要的(图1A)。人类TDP-43是一种由两个RNA识别基序和一个LC结构域组成的淀粉状蛋白蛋白质(图1B)，已知形成LLPS驱动的核糖核蛋白质(RNP)颗粒，其介导神经元细胞中的细胞过程。

我们预期(i)我们设计的mfp5-TDP-43LC(MTLC)融合蛋白质单体将形成由LLPS驱动的凝结的液体状液滴，(ii)液体状液滴倾向于散布并吸附在基底表面上以促进MTLC涂层的底涂过程，(iii)液滴中MTLC的局部富集将促进淀粉状蛋白凝结物在表面的自组装，并且(iv)然后另外的MTLC单体将聚集在这些表面局部的结构上，驱动最终在基底上形成厚的淀粉状蛋白纳米纤维涂层(图1D)。我们还预计，由于它们的高表面积和存在于mfp5结构域中的粘合残基，该mfp5结构域会暴露在淀粉状蛋白核心外部的纳米纤维表面，MTLC纳米纤维涂层应表现出非常强的水下粘合。

在我们最初尝试将纯化的MTLC单体用作粘合涂层时，我们观察到了惊人的温度相关现象。具体地，当在4℃下孵育时，MTLC融合蛋白质单体在玻璃基底上形成致密且均匀的涂层。与之相比，在25℃下孵育时，载玻片上仅形成非常稀疏和不均匀的沉积物(图2A)。另外，用淀粉状蛋白-特异性染料刚果红染色揭示了在4℃下形成的MTLC涂层强烈而均匀的信号，而在25℃下形成的涂层具有弱得多的染色信号。TEM和AFM分析证实，在4℃形成的MTLC涂层材料是由分层排列的纳米纤维组成的纳米纤维网状结构(图2B)。进一步证实涂层的淀粉状蛋白性质，x射线纤维衍射分析显示了淀粉状蛋白纳米纤维的交叉β脊结构的典型衍射图案。重要的是要注意，尽管在25℃下形成的沉积物非常稀疏，但TEM和AFM揭示了这些材料也被组装成淀粉状蛋白纳米纤维。

在25℃下孵育MTLC单体产生淀粉状蛋白纳米纤维，但在玻璃基底上仅形成稀疏沉积物的观察引起我们的兴趣，我们进行了淀粉状蛋白-特异性染料测定(Thioflavin T，ThT)以监测淀粉状蛋白在低温(4℃)和高温(25℃)下随时间的组装过程(图2C)。这些测定揭示了两个不同的趋势。首先，尽管高温样品显示出在孵育开始后不久就开始的淀粉状蛋白组装，但低温样品在启动淀粉状蛋白组装之前具有更长的滞后时间。其次，高温样品的MTLC单体花了大约24小时以完成它们的组装成淀粉状蛋白纳米纤维。与之相比，低温样品的淀粉状蛋白组装过程在短的多的时间窗(约10h)完成。

我们在低温和高温下形成的涂层的厚度和覆盖均匀性方面观察到的极端差异，以及我们的发现，即温度差异改变但没有阻止MTLC单体的淀粉状蛋白组装，共同表明低温样品中的动力学受限状态(trapped state)，在此期间，MTLC单体在由LLPS驱动的过程中形成液相凝结物。LLPS的标志性特征是溶液的高浊度。在此，我们对纯化的MTLC单体溶液在4℃和25℃下经过6小时的孵育时间在600nm处进行了基于光密度测量的比浊法，并观察到，尽管4°样品的浊度从非常低的水平上升，随后急剧上升，以迅速达到持续约2小时的平稳状态，然后逐渐下降，25°样品的浊度略有上升，但然后急剧下降而没有显示任何平稳状态(图2D)。

我们认为，4℃样品的高浊度平稳状态描述了上述动力学受限状态，在此期间形成了液相凝结物。随后在不同时间点采集的低温和高温样品的宏观和微观尺度观察进一步支持了该假设。低温MTLC孵育过程的照片显示，低温样品溶液在几分钟内变浑浊，保持浑浊4-5小时，然后在第6小时变透明，此时淀粉状蛋白纳米纤维组装过程已经开始(图2E)。一致地，光学显微镜检查显示在低温MTLC样品中，在1小时内形成了液体状液滴；对于高温MTLC样品，在任何时刻都没有形成液滴(图2F，图S6)。极有趣的是，在低温MTLC样品中，这些液体状液滴的最初沉积与最终淀粉状蛋白纳米纤维形成之间的时间段，我们观察到在最初吸附的液体状液滴的紧邻区域中形成了中间“原纤维”。通过监测溶液浊度在各种实验条件下测试LC结构域介导的LLPS过程，表明温度、离子强度和溶液pH均影响LLPS驱动的液体状液滴的形成，但温度似乎施加最大的影响(图S8)。更具体地，较低的温度、较低的离子强度和较高的pH值都促进了MTLC单体的相分离。

我们接下来应用带耗散监测的石英晶体微天平(QCM-D)实验以检查在4℃和25℃在金表面上MTLC的不同吸附能力(图2G)。在低温下MTLC溶液的吸附能力明显高于在高温下。另外，对于低温溶液观察到的大的声学比(ΔD/ΔF)表明存在吸附在金表面上的软材料。这些结果凸显LLPS驱动的液体状凝结物在低温下在基底表面形成致密且均匀的淀粉状蛋白纳米纤维涂层中的重要作用：作为液体状液滴，这种凝结物具有有效降低用于表面润湿和后续吸附的所需的能垒的低表面能。

为了直接测量MTLC的水下粘合性能，我们使用了基于AFM的胶体探针技术，该技术评估最初在水性缓冲液中与干净和光滑的云母结合的纳米材料的不对称粘合(图3A)。我们最初检查了低温和高温MTLC涂层之间的涂层密度和均匀性差异如何影响粘合强度。低温MTLC涂层显示出比高温涂层惊人和显著更强的粘合(图3B)。实际上，低温涂层的粘合性能非常接近报道的迄今为止最强的基于蛋白质的水下粘合剂的值(水下粘合能)。粘合的巨大差异强调LLPS驱动过程在促进基底的初始底涂和润湿以及随后将局部浓缩的MTLC单体自组装成极致密和高度均匀的淀粉状蛋白纳米纤维方面的强大贡献。

注意，MTLC融合单体还包含海洋贻贝粘合斑块蛋白质，我们接下来评估了mfp5融合结构域的存在如何通过在低温下仅用TDP-43LC结构域、未修饰的MTLC或带有多巴残基的酪氨酸酶修饰的MTLC涂覆云母来影响三种不同涂层的粘合。即使没有酪氨酸酶处理，mfp5融合结构域的存在也显著提高了涂层的粘合强度：未修饰的MTFP涂层的粘合比仅由TDP-43LC结构域制成的涂层强1.6倍。令人印象深刻的是，通过酪氨酸酶处理将MTLC单体上的酪氨酸残基体外转化为DOPA残基，使淀粉状蛋白纳米纤维涂层的粘合强度提高了2.7倍以上，使其成为迄今为止报道的最强的基于蛋白质的水下粘合剂(具有接近48.1mJ m

LC结构域驱动的LLPS与另一LLPS机制(凝聚)之间存在重要区别，该另一LLPS机制(凝聚)被沙堡蠕虫用于底涂和润湿，并已经启发了现有的仿生粘合剂。凝聚层结构的形成是静电驱动的，并且因此取决于pH值，并且因此，工程化的基于电荷-电荷的凝聚层目前仅限于在窄的pH范围内使用。鉴于很可能在LC结构域中的α-螺旋和芳香族残基提供疏水力以驱动我们在低温MTLC涂层沉积过程中观察到的LLPS，我们推测基于LC结构域的LLPS可以使涂层在宽的pH值范围应用。实际上，云母上的MTLC涂层可以在4℃下在宽的pH值范围(3-11)下从溶液沉积，所有这些都超过了任何以前报道的基于蛋白质的水下粘合剂的粘合性能(图3E)。

接下来，我们承担了将MTLC涂层应用于聚四氟乙烯(PTFE，“特氟龙”)的挑战，聚四氟乙烯是一种极其“不粘”的物质。在4℃下将平的特氟龙晶片孵育过夜后，UV光(254nm)图像的比较揭示了在特氟龙上成功沉积了厚的MTLC涂层，并且水接触角分析表明该涂层显著且惊人地将疏水性PTFE表面的接触角从108.4°±1.4°降低至68.7°±2.1°(图4A)。当我们用可以通过His-tag亲和与MTLC分子相互作用的CdSeS@ZnS量子点(QD)孵育未涂覆和MTLC涂覆的PTFE晶片时，我们观察到QD均匀地吸附在涂覆的特氟龙晶片的表面上，但发现未涂覆的特氟龙上几乎没有QD存在。通过SEM的MTLC涂层的横截面图像揭示了晶片表面具有厚且均匀的涂层(图4B)。XPS光谱分析揭示了，与未涂覆的PTFE相比，涂覆有MTLC淀粉状蛋白纳米纤维的PTFE晶片几乎没有氟(F1s)信号，但从蛋白质涂覆层中有显著的氧(O1s)和氮(N1s)信号。我们还发现了，涂覆的晶片的C-F键产生的碳(C1s)信号降低，但C-O、C-N和C-C键产生的碳(C1s)信号升高。

利用我们的LLPS驱动的MTLC过程涂覆难以接近的表面的能力，我们还进行了用于涂覆难以接近的内表面包括柔性特氟龙管的内表面(图4C)和微流体装置的通道(图4D)的概念验证演示。同样，MTLC涂层吸附QD的能力使我们能够对这些和其他挑战性的基底(例如，高柔性聚对苯二甲酸乙二醇酯(“聚脂薄膜(Mylar)”)薄膜)进行后处理，并且从而可视化MTLC涂层(图S22)；在这些材料上成功形成厚且均匀的MTLC涂层，强调了我们的LLPS驱动的技术可用于涂覆极其多样的表面。

为了进一步探索我们的LLPS驱动的MTLC粘合剂的实际应用，我们转向将这些材料用作用于通过将溶液中的纯化的MTLC单体与非粘性聚苯乙烯(PS)微球共同注入到PTEF基底上刮伤的损坏部位修复损坏(图4E)的水下胶粘剂。在4℃下孵育12小时后，在损坏部位的表面和微球表面形成了LLPS驱动的MTLC涂层；涂层起胶粘剂的作用以将微球彼此聚集并聚集到基底表面，从而将它们保持在适当的位置并填充损坏部位。荧光和SEM图像均显示了微球特别聚集在损坏部位，清楚地证明LLPS驱动的涂层对于损坏修复的效用。

实施例

我们用代表性的MAP-LC二聚蛋白质组合证明了功能性。我们证明了FUS LC、GFP-FUS LC、GFP-FUS LC-mfp5均具有可逆的液-液相分离性质，并且GFP-FUS LC-mfp5在显示绿色荧光的同时显示水下粘合。我们证明了还构建了mfp5-FUS LC、mfp3-TDP-43LC和mCherry-FUS LC-mfp3，并且mCherry-FUS LC-mfp3在显示红色荧光的同时具有水下粘合。我们证明了Spytag-FUS和mfp5-spycatcher是分别构建的。当两种蛋白质以1:1的摩尔比混合时，它们共价相互作用以形成表现出水下粘合的共轭蛋白质。

MTLC粘合剂可以沉积在难以接近的界面上，例如微流体装置中的通道和微管壁。图5(A)是显示由覆盖在载玻片上的PDMS制成的流体装置的示意图。将MTLC注入到流体装置中并在4℃下孵育。然后将QD注入流体装置中，以组装在内壁上的MTLC涂层上。然后通过蒸馏水洗涤通道。(B)通过共聚焦荧光显微镜拍摄3D图像。(C)在UV光下拍摄原位照片。(D)SEM图像和(E)SEM截面图像显示通道的内壁被蛋白质涂覆。

MTLC涂层可以用作各种基底的通用涂层。图6A-C：(A)组装在MTLC涂覆的表面上的红色OD的数码图像。(B)微PE管的3D图像。红色QD组装在MTLC涂覆的内壁上。(C)带有/不带有MTLC涂层的各种表面的水接触角测量。铁氟龙板：108.4°+1.4°，68.7°+2.1°；PS板：88.6°+1.5°，85.2°+1.0°；盖玻片：58.3°+1.9°，76.0°+2.5°；硅晶片：48.6°+2.3°，80.3°+1.3°；铝箔：53.5°+3.9°，67.5°+0.9°；铁片：66.8°+1.6°，75.3°+1.7°。

作为用于结合特定物体的图案化阵列的MTLC涂层。图7A-C：(A)组装在通过特定掩膜板介导的光刻图案上的QD。(B)组装在软光刻图案上的QD。(C)微型图案在绿色激光下显示有序的光点，这表明实现长程有序图案。

用于电子装置的MTLC涂层：在具有挑战性的表面上沉积金属层等。图8A-C：(A)通过无电金属沉积在PP Eppendorf管内壁上的MTLC涂层(左)和铜沉积(右)的照片。(B)在铜沉积之前和之后由3D打印机打印的多孔树脂模型的照片。(C)铜沉积的3D模型的C-V曲线。插入的图像是铜沉积的3D模型的电路演示，该3D模型用作电导体以点亮二极管。