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一种判定蛋白质能否发生液-液相分离的方法

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一种判定蛋白质能否发生液‑液相分离的方法，属于基因工程技术领域。为了解决目前研究蛋白能否发生“液‑液相分离”所用方法步骤繁琐，费时费力，原核表达易形成包涵体的问题，本发明提供了一种判定蛋白质能否发生液‑液相分离的方法。本发明所述的方法具体包括如下步骤：构建含有体外转录启动子、待测蛋白以及标记蛋白基因的载体，以此载体为模板，PCR扩增后进行体外转录，获得融合基因的mRNA，将mRNA注射到受精卵中，培养15‑20小时之后通过荧光显微镜观察是否发生“液‑液相分离”。本发明以受精卵为载体，通过注射的方式使体外转录的mRNA在受精卵中进行表达，操作非常简单，结果清晰，并且能在短时间内获得结果。

著录项

公开/公告号CN112630197A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-04-09

原文格式PDF
申请/专利权人东北农业大学;
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申请/专利号CN201910958709.5
发明设计人王加强;王乐韵;
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申请日2019-10-10
分类号G01N21/64(20060101);
代理机构23211 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司;
代理人邓宇
地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号
入库时间 2023-06-19 10:33:45

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种判定蛋白质能否发生液-液相分离的方法。

背景技术

近年来，蛋白质液液相分离(Liquid-liquid Phase Separation,LLPS)逐渐成为生物学研究的热点之一。它在生命体的正常代谢和疾病过程中都发挥着非常重要的作用。随着越来越多的探索LLPS具体发生机制的报道，人们发现影响蛋白质LLPS的因素主要来自于两个方面：一是蛋白质序列性质，如突变及翻译后修饰的影响；二是受到体系微环境，比如温度、蛋白质浓度、pH值、盐浓度、压力等的调节。目前研究某种蛋白能否发生“液-液相分离”主要是体外表达纯化蛋白，然后在一定的缓冲液中观察该蛋白能否发生相变。该方法步骤繁琐，费时费力，涉及表达载体设计及构建、(真核或原核系统)诱导表达蛋白、蛋白纯化、蛋白透析、蛋白浓缩等环节，如果采用原核表达系统，还有可能出现表达蛋白错误折叠形成包涵体的情况，需要变性及复性处理，更增加了实验的复杂性。

发明内容

为了解决目前研究蛋白能否发生“液-液相分离”所用方法步骤繁琐，费时费力，原核表达易形成包涵体的问题，本发明提供了一种判定蛋白质能否发生液-液相分离的方法。本发明所述的方法具体包括如下步骤：

(1)构建待测蛋白质的体外转录元件，所述体外转录元件是由体外转录启动子，待测定蛋白质的基因序列与编码荧光蛋白基因相连接所形成的融合基因；

(2)体外转录获得融合基因的mRNA；

(3)将步骤(2)所获得的mRNA注射到受精卵中；

(4)对注射后的受精卵进行培养，培养15-20小时，通过荧光信号判定待测定蛋白质是否发生液-液相分离。

优选的，步骤(1)所述的体外转录启动子是T7启动子，序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，步骤(3)所述的mRNA注射到受精卵中是注射到受精卵的细胞质或细胞核中。

优选的，步骤(3)所述的mRNA注射浓度是50-300ng/μl。

优选的，其特征在于，步骤(3)所述的mRNA注射浓度是150ng/μl。

优选的，步骤(3)所述的mRNA注射参数是注射压力为80-200hpa，注射时长0.1s，补偿压力100-300hpa。

优选的，步骤(3)所述的受精卵为鼠受精卵。

优选的，步骤(1)所述受精卵培养条件是37℃，CO

优选的，步骤(4)所述的判定待测定蛋白质是否发生液-液相分离是通过荧光显微镜观察，形成的荧光信号是圆形，则发生液-液相分离，呈现弥散性分布则未发生液-液相分离。

有益效果

本发明以受精卵为载体，通过注射的方式使体外转录的mRNA在受精卵中进行表达，操作非常简单，因为能够发生液-液相分离的蛋白在受精卵中表达后是液滴状，所以在显微镜下观察是非常规则的圆形信号，结果清晰，并且能在短时间内获得结果。

附图说明

图1.pcDNA3.1-NONO-mCherry载体图谱；

图2.NONO蛋白基因与荧光蛋白基因所构成的融合蛋白基因在受精卵中表达为蛋白并发生相变的结果；

图3.pcDNA3.1-SRSF1-mCherry载体图谱；

图4.SRSF1蛋白基因与荧光蛋白基因所构成的融合蛋白基因在受精卵中表达为蛋白并发生相变的结果；

图5.pcDNA3.1–mCherry-NLS载体图谱；

图6.只有荧光蛋白基因在受精卵中表达并未发生相变的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

实施例1.判定NONO蛋白质能否发生液-液相分离的方法。

本实施例所述的判定NONO蛋白质能否发生液-液相分离的方法是按如下步骤进行的：

(1)构建待测蛋白质的体外转录元件，所述体外转录元件是由体外转录启动子，待测定蛋白质的基因序列与编码荧光蛋白基因相连接所形成的融合基因，具体步骤如下：

1)构建含有NONO蛋白质的基因序列的载体，所述NONO蛋白的CDS区序列如SEQ IDNO.1所示，所述载体中待测定蛋白质的基因序列与具有标记作用的红色荧光蛋白基因相连接，形成融合基因，所述融合基因上游连接有体外转录启动子T7启动子，序列如SEQ IDNO.2所示，本实施例将NONO蛋白质基因的体外转录元件构建到载体中，由优宝生物商品化合成，载体名称为pcDNA3.1-NONO-mCherry，货号是L2772，载体图谱如图1所示；

2)以步骤(1)所述载体为模板，分别针对T7启动子和bGH poly(A)序列设计合成PCR引物，引物名称分别为T7-F和bGH poly(A)-R，序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，PCR扩增获得所需的待测蛋白质的体外转录元件PCR试剂盒2×Vazyme LAmp Master Mix(Dye Plus)；厂家Vazyme；货号P312。

PCR体系如下：质粒模板10ng；上下游引物各0.5μL；2×Vazyme LAmp Master Mix(Dye Plus)10μL；加水补至20μL。

PCR条件：95℃2min；95℃15s，60℃15s，72℃3min,30个循环；72℃10min。

(2)体外转录获得融合基因的mRNA；

利用HiScribe

1)混合体外转录反应液。室温下融化10×reaction Buffer，其余必须冰融。

表1 体外转录体系

2)温和混合，稍事离心。37℃孵育30min。

3)加入2μL的DNase I，37℃孵育15min。

4)向上述反应体系中直接添加A体系。(勿离心混匀)

表2 体外转录体系

5)温和混匀。37℃孵育30min。

6)加入50μL的LiCl Solution。

7)充分混匀，-20℃孵育30min。

8)12000g 4℃离15min，然后用1ml的70％-80％的乙醇洗。

9)风干沉淀15min，然后用30μL无核酸酶水来悬浮RNA沉淀

10)检测RNA浓度，稀释到150ng/μL

11)分装后于-80℃保存。

(3)将步骤(2)所获得的mRNA注射到受精卵中；

利用6-8周ICR小鼠，进行超排处理，注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后25小时，人道地处死小鼠，获取体内受精卵。利用eppendorf FemtoJet 4i注射仪进行注射，注射mRNA浓度为150ng/μl，将注射参数调整为注射压力(pi)，80hpa，注射时长(ti)0.1s，补偿压力(pc)300hpa，随后将注射针插入持针器，架好注射针于操作皿中，点击注射仪clean键，在倒置显微镜下观察，利用物理磕针的方式(即注射针碰触固定针)进行针口的断口，通过判断液流流速的形式判断其注射强度，随后根据视野判断在注射压区间内调节注射压力到合理示数，随后进行受精卵原核注射。

(4)对注射后的受精卵进行培养，培养15小时，判定待测定蛋白质是否发生液-液相分离。

通过荧光显微镜进行观察，由于液-液相分离是形成液滴，是球形的，因此在激光共聚焦显微镜下观察时，若形成的荧光信号聚集成规则的圆形，则证明发生液-液相分离，否则未发生液-液相分离。

图2是NONO蛋白基因与荧光蛋白基因所构成的融合蛋白基因在受精卵中表达为蛋白并发生相变的结果，观察到的红色荧光呈现规则的圆形，说明NONO蛋白质能发生液-液相分离。

实施例2.判定SRSF1蛋白质能否发生液-液相分离的方法。

(1)构建待测蛋白质的体外转录元件，所述原件由体外转录启动子，待测定蛋白质的基因序列与编码荧光蛋白基因相连接所形成的融合基因，具体操作与实施例1相同，区别在于待判定能否发生液-液相分离的基因是SRSF1，SRSF1的CDS区如SEQ ID NO.5所示，含有SRSF1体外转录元件的载体由优宝生物商品化合成，载体名称为pcDNA3.1-SRSF1-mCherry，载体图谱如图3所示；

(2)体外转录获得融合基因的mRNA；具体操作与实施例1相同。

(3)将步骤(2)所获得的mRNA注射到受精卵中；具体操作与实施例1相同，不同之处在于注射mRNA浓度调整为50ng/μl，进行原核注射注射压力(pi)，200hpa，注射时长(ti)0.1s，补偿压力(pc)100hpa。

(4)对注射后的受精卵进行培养，培养16小时，判定待测定蛋白质是否发生液-液相分离。具体操作与实施例1相同。

图4是SRSF1蛋白基因与荧光蛋白基因所构成的融合蛋白基因在受精卵中表达为蛋白并发生相变的结果，观察到的红色荧光呈现规则的圆形，说明SRSF1蛋白质能发生液-液相分离。

实施例3.判定NONO蛋白质能否发生液-液相分离的方法。

与实施例1相同，不同之处在于注射mRNA浓度调整为300ng/μl，进行胞质注射，对注射后的受精卵进行培养，培养20小时，判定待测定蛋白质是否发生液-液相分离。

按照实施例3的操作，也能获得与实施例1相类似的结果，能够说明NONO蛋白质能发生液-液相分离。

实施例4.实施例1的对比例。

实施例4与实施例1操作步骤相同，区别在于步骤(1)构建的载体不含有待测目的蛋白的基因，由优宝生物商品化合成，载体名称为pcDNA3.1–mCherry-NLS，载体图谱如图5所示，序列如SEQ ID NO.6所示。

对照组注射的是仅有荧光蛋白表达的mRNA，结果如图6所示，能够看到对照组荧光蛋白不能发生液-液相分离，红色荧光信号呈现弥散分布。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

核苷酸序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种判定蛋白质能否发生液-液相分离的方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> NONO的CDS区

<400> 1

atgcagagca ataaagcctt taacttggag aagcagaatc atactccaag gaagcatcat 60

cagcatcacc accagcagca ccatcagcag caacagcagc agcagcagca acagccaccc 120

ccaccaatac ctgcaaatgg ccagcaggcc agcagccaga atgaaggctt gactattgac 180

ctgaagaatt ttaggaaacc aggagagaag acctttacac agcgtagccg tctctttgtg 240

ggcaatcttc cccctgatat cactgaggag gaaatgagga aactatttga gaaatatgga 300

aaagcaggcg aagttttcat tcataaggat aaaggctttg gctttattcg cttggaaaca 360

cgaaccctag cggaaattgc caaagtggag ctggacaaca tgcccctccg tgggaagcag 420

ctgcgagtgc gctttgcctg tcacagtgca tcccttacag tccgcaacct tcctcagtac 480

gtgtcgaacg aactgctgga agaagccttt tctgtgttcg gccaggtgga gagggctgta 540

gtcattgtgg atgaccgagg aaggccctca gggaaaggca ttgttgagtt ctcagggaag 600

ccagctgctc ggaaagctct ggacagatgc agtgaaggct ccttcttgct gactacattt 660

cctcggcctg tgactgtgga gcctatggac cagttagatg atgaagaggg acttccagag 720

aaactggtta taaaaaacca gcaattccac aaggagagag aacagccacc cagatttgca 780

caacctggct cctttgagta tgagtatgcc atgcgctgga aggcactcat tgagatggag 840

aagcaacagc aggatcaagt ggatcggaac atcaaggagg ctcgtgagaa gctggagatg 900

gagatggagg ctgcacgtca tgagcaccag gttatgctaa tgaggcagga tttgatgaga 960

cgtcaagaag agcttcggag aatggaggag ctgcataacc aagaggttca gaagcgaaag 1020

cagttagaac tcaggcagga agaggaacgc aggcgccgtg aggaagagat gcggcgacag 1080

caagaggaaa tgatgcgccg acagcaggaa ggattcaagg gaaccttccc tgatgcgaga 1140

gaacaagaga tacggatggg ccaaatggct atgggaggtg ctatgggcat aaacaataga 1200

ggcgcgatgc cccctgctcc tgtgccacct ggtactccag ctcctccagg acctgccact 1260

atgatgccag atggaaccct tggattgacc ccaccaacaa ctgaacgttt tggccaagct 1320

gcaacaatgg aaggaattgg agcaattggt ggaactcctc ctgcattcaa ccgtccagct 1380

ccgggagctg aatttgctcc aaataaacgc cgccgatatt ag 1422

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<212> DNA

<213> T7启动子

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<212> DNA

<213> T7-F

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<212> DNA

<213> bGH poly(A)-R

<400> 4

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<211> 1419

<212> DNA

<213> SRSF1的CDS区

<400> 5