高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株及其用途

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产纤溶酶和γ‑PGA的地衣芽孢杆菌菌株及其用途。针对现有公开的菌种同时联产纤溶酶的活力和γ‑PGA的产量都不高，导致生产成本较高，生产效率低下的问题，本发明筛选得到了一株地衣芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.18669。本发明的地衣芽孢杆菌能同时高产纤溶酶和γ‑PGA，液态发酵时产纤溶酶达到4834.49IU/mL，产γ‑PGA达到31.98g/L，固态发酵时产纤溶酶达到15904.68IU/g，产γ‑PGA达到381.49g/kg。本发明发酵工艺简单、快速，其所获的纤溶酶的活力高、γ‑PGA的产量高。本发明的菌株可以应用在联产纤溶酶和γ‑PGA的领域，可以用来发酵黄豆，具有广泛的用途。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株及其用途。

背景技术

随着生活节奏的加快及工作压力的增加，人们的饮食和作息规律发生改变，血栓发病率逐年增加，严重威胁人们的身体健康。治疗血栓疾病的方法主要有：外科手术、抗血小板凝集、抗凝血药及纤溶酶(链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂)等4种，普遍都费用高昂，且存在用量大、半衰期短、专一性差、副作用较多等问题。

纤溶酶是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，是纤溶系统中的一个重要组份，常用作溶栓剂。目前，纤溶酶的生产方法主要有动物提取法、细胞生物反应器合成法、基因重组合成法和微生物合成法。链激酶和尿激酶为第一代溶栓剂，纤维蛋白的选择性不足，能同时激活血栓表面和血浆中的纤溶酶原，产生全身性出血的副作用。组织型纤溶酶原激活剂和尿激酶原为第二代溶栓剂，相比第一代溶栓剂，第二代溶栓剂对纤维蛋白的选择性有所提高，但仍存在出血副作用、半衰期短、用药剂量大、价格昂贵等缺点。1987年日本科学家从日本传统发酵食品纳豆中提取出一种具有纤溶性质的酶-纳豆激酶，作为第三代溶栓剂，不仅可以直接分解纤溶蛋白，而且可以刺激细胞释放组织纤溶酶原激活剂，具有无副作用、半衰期长、溶栓效果明显、成本低等特点。相比动物提取法、细胞生物反应器合成和基因重组合成法，微生物合成具有速度快、条件易于控制、目的产物合成量大、成本低等特点，微生物成为溶栓药物的重要生产来源。纳豆激酶的发现也将产纤溶酶的功能微生物筛选来源引向了传统发酵产品微生态环境，如豆豉、豆瓣酱、腐乳等，微生物发酵生产纤溶酶逐渐成为研究热点。经过30多年的研究，产纤溶酶的微生物尤以耐热的芽孢杆菌为最多，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌等。芽孢杆菌合成的纤溶酶为丝氨酸及金属肽酶，可以水解纤维蛋白、纤维蛋白原和合成的物质，在pH＝5～12及10～75℃条件下仍能保持一定的活性。专利CN101113422A公开了一种地衣芽孢杆菌纤溶酶及其生产方法，在最佳工艺条件下获得的液态发酵液的纤溶酶的活力为320IU/mL。专利CN111454932A公开了一种纳豆菌发酵采用大豆等外品产纳豆激酶的方法，其最佳发酵工艺下生产的纳豆激酶活力可达到2326.60IU/g。由于纤溶酶的活力单位众多(IU/mL，FU/mL，U/mL等)，很难进行不同功能微生物产纤溶酶活性的比较。以IU/mL为酶活单位的报道中，多数微生物的纤溶酶活力介于300～2100IU/mL之间，纤溶酶活力相对较低。极少数微生物经发酵条件优化、诱变育种或基因工程改造可使纤溶酶活力达到4000～5500IU/mL。

γ-PGA(中文名为聚-L-谷氨酸或聚谷氨酸)多由芽孢杆菌产生，是一种阴离子多肽，具备良好的水溶性和生物相容性。可与Ca

目前，同时联产纤溶酶和γ-PGA的报道较少，且联产纤溶酶和γ-PGA的微生物性能较差。胡淳罡等在“枯草杆菌SBS液体发酵联产血栓溶解酶和γ-聚谷氨酸，微生物学报，2009年49卷1期，49-55页”中公开了一种利用枯草芽孢杆菌SBS液态发酵联产纤溶酶和γ-PGA的方法，在最优条件下，纤溶酶活力为265±25IU/mL，γ-PGA的产量为1.183±0.015g/L。秦国宏在硕士学位论文“枯草芽孢杆菌联产纳豆激酶和γ-聚谷氨酸的研究”中公开了一种利用枯草芽孢杆菌NLSSe液态发酵72h联产纤溶酶和γ-PGA的方法，纤溶酶活力可达121U/mL，γ-PGA产量达到1.1g/L。Zeng wei等在“Non-sterilized fermentative co-production of poly(γ-glutamic acid)and fibrinolytic enzyme by a thermophilicBacillus subtilis GXA-28，Bioresource Technology，2013年142卷，697-700页”中公开了一种利用枯草芽孢杆菌GXA-28固态发酵大豆残渣联产纤溶酶和γ-PGA的方法，纤溶酶活力可达986U/g，γ-PGA产量可达103.5g/kg。

可见，目前采用枯草芽孢杆菌联产纤溶酶和γ-PGA的报道中，纤溶酶和γ-PGA的产量都不高。而且，还未见有采用地衣芽孢杆菌联产纤溶酶和γ-PGA的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有公开的菌种同时联产纤溶酶的活力和γ-PGA的产量都不高，导致生产成本较高，生产效率低下的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株，该菌株应用于液态发酵和固态发酵联产纤溶酶的活力和γ-PGA的产量均达到较高的水平。本发明的高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株，保藏编号为CGMCCNo.18669。保藏时间为2019年10月11日，保藏中心为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

其中，上述高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株的16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株的16SrRNA的核苷酸序列

gagtgggggggtgctatacatgcagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaatcataaaaggtggcttttagctaccacttgcagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgccgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgccggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaaattattgggcggtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaacccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggcttcctccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgccgaaggacagtc。

其中，上述高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株同时高产纤溶酶和γ-PGA。

其中，；上述高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株液态发酵时产纤溶酶达到4834.49IU/mL，产γ-PGA达到31.98g/L。

其中，上述高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株固态发酵时产纤溶酶达到15904.68IU/g，产γ-PGA达到381.49g/kg。

其中，上述高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株的生物学特征为：菌落为米白色、边缘不规则、光滑、不致密、凸起，粘液较多，革兰氏阳性，短杆，单联或二联，椭圆形中生单孢子。

其中，上述高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株的生长条件为：生长温度为33～50℃，转速100～180rpm，生长周期16～36h，pH＝6.0～8.0。

本发明还提供了一种上述高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株在联产纤溶酶和γ-PGA中的用途。

本发明还提供了一种上述高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株在发酵黄豆中的用途。

本发明还提供了一种采用上述地衣芽孢杆菌菌株液态发酵产纤溶酶和γ-PGA的方法，包括以下步骤：

a、菌种活化：将保藏编号为CGMCC No.18669的地衣芽孢杆菌接种到牛奶固体培养基中，在33～42℃恒温培养箱中培养12～18h；

b、种子液制备：将步骤a活化的菌种接种至种子培养基中，于33～42℃，140～180rpm条件下培养16～18h；

c、液态发酵：将步骤b得到的种子液接种至无菌发酵培养基中，于33～42℃，140～180rpm条件下培养18～24h；

d、粗酶液的提取：将发酵液于8000rpm，4℃条件下离心5min，收集上清，即为粗酶液，用于测定纤溶酶的活力；

e、γ-PGA的提取：将发酵液于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除沉淀，收集上清；向上清中加入3～4倍体积的无水乙醇，混匀后，置于-20℃沉淀12～20h；于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除上清，收集沉淀；用无水乙醇洗涤3～4次，待乙醇挥干后，加入一定体积的超纯水；于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除沉淀，收集上清，即为γ-PGA的提取液，用于测定γ-PGA的含量。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株液态发酵产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤a所述牛奶固体培养基的组成包括：牛肉膏3～5g/L，大豆蛋白胨5～10g/L，氯化钠5g/L，脱脂奶粉40～80g/L，琼脂15～20g/L，pH＝7.0。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株液态发酵产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤b所述的种子培养基的组成为：葡萄糖20～30g/L，大豆蛋白胨20～30g/L，磷酸氢二钠2～4g/L，磷酸二氢钠2～4g/L，硫酸镁0.5～1g/L，氯化钙0.4～0.6g/L，pH＝7.0～8.0。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株液态发酵产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤c所述的无菌发酵培养基组成为：大豆蛋白胨5～10g/L，硫酸镁0.5～1.0g/L，麦芽糖10～20g/L，葡萄糖2～3g/L，酵母提取物8～12g/L，虾壳粉5～10g/L，脱脂牛奶20～40g/L，pH＝7.0～8.0。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株液态发酵产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤c所述接种的量为：种子液体积为发酵液体积的1～4％。

本发明采用上述液态发酵的方法，纤溶酶的活力达到4834.49IU/mL，γ-PGA的产量达到31.98g/L。

本发明还提供了一种采用上述地衣芽孢杆菌菌株固态发酵黄豆产纤溶酶和γ-PGA的方法，包括以下步骤：

a、菌种活化：将保藏编号为CGMCC No.18669的地衣芽孢杆菌接种到牛奶固体培养基中，在33～42℃恒温培养箱中培养12～18h；

b、种子液制备：将步骤a活化的菌种接种至种子培养基中，于33～42℃，140～180rpm条件下培养16～18h；

c、黄豆蒸煮灭菌：黄豆洗净后，加入黄豆重量2～4倍的热水浸泡12～18h，滤干水分，于121℃蒸煮灭菌20～40min，之后冷却至40～50℃备用；

d、固态发酵：将步骤b中培养的种子液于11000rpm，4℃条件下离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水稀释成菌悬液，使菌悬液的浓度控制在1.0～4.0×10

e、粗酶液的提取：向发酵后的黄豆中加入黄豆重量2～4倍的无菌生理盐水，混匀，4℃浸提12～18h，离心，收集上清，即为粗酶液，用于测定纤溶酶的活力；

f、γ-PGA的提取：向发酵后的黄豆中加入黄豆重量2～4倍的无菌生理盐水，混匀，4℃浸提12～18h，离心，收集上清；向上清中加入3～4倍体积的无水乙醇，混匀，在-20℃沉淀12～20h，离心，去除上清液，收集沉淀；用无水乙醇洗涤3～4次，待乙醇挥干后，加入超纯水，离心，去除沉淀，收集上清液，即为γ-PGA的提取液，用于测定γ-PGA的含量。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株固态发酵黄豆产纤溶酶和γ-PGA的方法中，所述的菌种活化和种子液制备过程与液态发酵完全相同。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株固态发酵黄豆产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤a所述牛奶固体培养基的组成包括：牛肉膏3～5g/L，大豆蛋白胨5～10g/L，氯化钠5g/L，脱脂奶粉40～80g/L，琼脂15～20g/L，pH＝7.0。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株固态发酵黄豆产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤b所述的种子培养基的组成为：葡萄糖20～30g/L，大豆蛋白胨20～30g/L，磷酸氢二钠2～4g/L，磷酸二氢钠2～4g/L，硫酸镁0.5～1g/L，氯化钙0.4～0.6g/L，pH＝7.0～8.0。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株固态发酵黄豆产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤c所述的热水温度为45～65℃。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株固态发酵黄豆产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤e所述的离心的具体操作步骤为：在8000rpm，4℃条件下离心5min。

其中，上述地衣芽孢杆菌菌株固态发酵黄豆产纤溶酶和γ-PGA的方法中，步骤f中所述的离心的具体操作步骤为：在11000rpm，4℃条件下离心20～30min。

本发明采用上述固态发酵黄豆的方法，纤溶酶的活力达到15904.68IU/g，γ-PGA的产量达到381.49g/kg。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌，保藏编号为CGMCCNo.18669，其可以在液体发酵或固态发酵下，同时高产纤溶酶和γ-PGA，纤溶酶的活力分别可以达到4834.49IU/mL和15904.68IU/g，γ-PGA的产量分别能够达到31.98g/L和381.49g/kg。本发明发酵工艺简单、快速，其所获的纤溶酶的活力高、γ-PGA的产量高。本发明的菌株可以应用在联产纤溶酶和γ-PGA的领域，可以用来发酵黄豆，具有广泛的用途。

本发明的高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌于2019年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 18669,保藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。分类命名为Bacillus licheniformis LZLJ。

附图说明

图1为实施例1的地衣芽孢杆菌的菌落形态图(A)和细胞形态图(B)；

图2为实施例1的地衣芽孢杆菌的系统发育树Phylogenetic tree QM12；

图3为尿激酶酶活标准曲线；

图4为使用纤维蛋白平板测定实施例4和实施例5两种方法所得纤溶酶活性，经18h后产生的水解圈；(A)：实施例4所得纤溶酶的水解圈；(B)：实施例5所得纤溶酶的水解圈；(C)：实施例4所得纤溶酶的酶活；(D)：实施例5所得纤溶酶的酶活；

图5为γ-PGA标准曲线；

图6为实施例4和实施例5两种方法所得γ-PGA的含量；(A)：实施例4所得γ-PGA的含量；(B)：实施例5所得γ-PGA的含量。

具体实施方式

泸州老窖大曲为中高温大曲，其发酵顶温可达50～60℃左右，经过发酵富集了大量的耐热芽孢杆菌，可合成大量的淀粉酶、蛋白酶等水解酶类，此外，其代谢合成的生理活性物质如吡嗪类化合物、地衣素、氨基酸活性短肽等可能会通过蒸馏进入到白酒中，使白酒具有一定的养生保健功能。本发明从泸州老窖中高温大曲微生态环境出发，筛选得到了一株高产纤溶酶和γ-PGA的芽孢杆菌菌株，并研究发现可将其应用于纤溶酶及γ-PGA的生产。本发明显著地提升了纤溶酶的活力和γ-PGA的产量，可有效提高功能微生物发酵过程中的附加值，提高发酵产率。

本发明首次筛选得到一株同时高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 18669，保藏时间为2019年10月11日，保藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。分类命名为Bacillus licheniformisLZLJ。

在筛选得到本发明的菌株之后，本发明对其进行液态发酵和固态发酵的条件都进行了优化，在最优条件下，该菌株在液态发酵条件下，纤溶酶活力高达4834.49IU/mL，γ-PGA的产量能够达到31.98g/L。在固态发酵条件下，纤溶酶活力高达15904.68IU/g，γ-PGA的产量能够达到381.49g/kg。相对于当前枯草芽孢杆菌联产纤溶酶和γ-PGA的方法，该方法获得的纤溶酶活力及γ-PGA的产量均达到一个较高的水平。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例1本发明高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌的分离鉴定

分离：从泸州老窖股份有限公司制曲中心取500g中高温大曲，放于无菌自封袋中，冰盒运回实验室，在取样30min内按照以下流程分离高产纤溶酶和γ-PGA的芽孢杆菌菌株：称取5.00g中高温大曲样品，置于盛有45mL无菌生理盐水且底部铺满玻珠的250mL三角瓶中，80℃水浴处理10～15min后，180r/min震荡摇匀30min，获得菌悬液。菌悬液用无菌生理盐水梯度稀释后，取10

鉴定：按照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)的步骤提取DNA，以27F、1492r为引物(27F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：5'-agagtttgatcctggctcag-3'(SEQ ID NO:2)；1492r引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：5'-tacggctaccttgttacgactt-3'(SEQ ID NO:3))扩增细菌16S rDNA序列。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，送往上海生工生物工程有限公司进行测序，获得的序列与GenBank中的模式菌株的序列进行BLAST，将其序列相似性大于99％的序列鉴定为同种，并利用VITEK2COMPACT全自动微生物鉴定系统对该菌株进行生理生化实验鉴定。

实施例2本发明地衣芽孢杆菌的菌落形态、细胞形态、生理生化特征

取实施例1分离的菌株QM12在牛奶培养基平皿上37℃培养18～36h，观察并记录菌落形态、颜色，如图1(A)和表1所示。

革兰氏染色：挑取菌落进行涂片、固定、初染、媒染、脱色、水洗、复染、干燥、显微镜观察及拍照，鉴定结果如图1(B)和表2所示。

表1 QM12的菌落形态

表2 QM12的细胞形态

对本发明所述QM12菌株16S rDNA提取，移交上海生工生物工程有限公司测序，序列已存储在GenBank数据库中，序列编号为MT645703.1，基于序列绘制的系统发育树如图2所示，初步鉴定QM12为Bacillus licheniformis。

对分离的QM12菌株经VITEK 2COMPACT全自动微生物鉴定系统进行生理生化特征鉴定，其鉴定结果为Bacillus licheniformis，鉴定结果的可信度高达96％(Excellentidentification)，其生理生化反应结果如表3所示。

表3地衣芽孢杆菌在BCL鉴定卡上的生化反应结果

综合16S rDNA测序鉴定结果和生理生化鉴定结果，QM12为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，并命名为：Bacillus licheniformis LZLJ。

实施例3牛奶培养基、种子培养基和发酵培养基的制备

牛奶培养基的制备：牛肉膏4g/L，大豆蛋白胨6g/L，氯化钠5g/L，脱脂奶粉45g/L，琼脂15/L，pH＝7.0，121℃高温高压灭菌15min。

种子培养基的制备：葡萄糖25g/L，大豆蛋白胨20/L，磷酸氢二钠3g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁0.6g/L，氯化钙0.4g/L，pH＝7.4，121℃高温高压灭菌20min。

发酵培养基的制备：大豆蛋白胨6g/L，硫酸镁0.5g/L，麦芽糖10g/L，葡萄糖2g/L，酵母提取物8g/L，虾壳粉5g/L，脱脂牛奶25g/L，pH＝7.2，121℃高温高压灭菌15min。

实施例4液态发酵制备纤溶酶和γ-PGA

①菌种活化：将实施例1分离得到的地衣芽孢杆菌接种到牛奶固体培养基(pH＝7.0)中，在42℃恒温培养箱中培养12h；

②种子液制备：将步骤①中活化好的菌种，无菌条件下，用接种环挑2～3环至装有80mL无菌种子培养基(pH＝7.4)的250mL三角瓶中，于42℃，160rpm条件下培养16h；

③液态发酵：种子液按发酵液体积3.5％的量接种到装有200mL无菌发酵培养基(pH＝7.2)的500mL三角瓶中，于42℃，160rpm条件下培养24h；

④粗酶液的提取：将发酵液于8000rpm，4℃条件下离心5min，收集上清，即为粗酶液，用于测定纤溶酶的活力；

⑤γ-PGA的提取：将发酵液于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除沉淀，收集上清。向上清中加入3～4倍体积的无水乙醇，混匀后，置于-20℃沉淀12～20h。于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除上清，收集沉淀。用无水乙醇洗涤3～4次，待乙醇挥干后，加入一定体积的超纯水。于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除沉淀，收集上清，即为γ-PGA的提取液，用于测定γ-PGA的含量。

实施例5固态发酵制备纤溶酶和γ-PGA

①菌种活化：将本发明所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis LZLJ)接种到牛奶固体培养基(pH＝7.0)中，在42℃恒温培养箱中培养12h；

②种子液制备：将步骤①中活化好的菌种，无菌条件下，用接种环挑2～3环至装有80mL无菌种子培养基(pH＝7.4)的250mL三角瓶中，于42℃，160rpm条件下培养16h；

③黄豆蒸煮灭菌：将精选的黄豆清洗干净后，按黄豆重量加入2倍45℃的热水浸泡14h，将水淋干后，取150g装于白瓷盘(20cm×30cm)中，于121℃蒸煮灭菌20min，蒸煮结束后，冷却至40～50℃用于接种；

④固态发酵：将步骤②中培养的种子液于11000rpm，4℃条件下离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水稀释成菌悬液，使菌悬液的浓度控制在1.0×10

⑤粗酶液的提取：将发酵后的黄豆按质量加入2倍的无菌生理盐水，用涡旋混合仪充分混合后，置于4℃浸提12～18h，于8000rpm，4℃条件下离心5min，收集上清，即为粗酶液，用于测定纤溶酶的活力；

⑥γ-PGA的提取：将发酵后的黄豆按质量加入2～4倍的无菌生理盐水，用涡旋混合仪充分混合后，置于4℃浸提12～18h，于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除沉淀，收集上清。向上清中加入3～4倍体积的无水乙醇，混匀后，置于-20℃沉淀12～20h。于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除上清液，收集沉淀。用无水乙醇洗涤3～4次，待乙醇挥干后，加入一定体积的超纯水。于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除沉淀，收集上清液，即为γ-PGA的提取液，用于测定γ-PGA的含量。

实施例6纤溶酶活力的测定

尿激酶标准曲线制作：将尿激酶标品用无菌水稀释成1000IU/mL、800IU/mL、600IU/mL、400IU/mL、200IU/mL和100IU/mL等6个梯度的标准液。准确吸取10μL尿激酶标准液注入琼脂糖-纤维蛋白原平板孔中，一个浓度做三个平行。然后，静置吸附15～20min，37℃培养18h，从三个方向用游标卡尺测定溶解圈的直径，取平均值计算各溶解圈面积(mm

纤溶酶活力计算：准确吸取10uL适度稀释的粗酶液，注入琼脂糖-纤维蛋白原平板孔中，一个浓度做三个平行。然后，静置吸附15～20min，37℃培养18h，从三个方向用游标卡尺测定溶解圈的直径，取平均值计算各溶解圈面积(mm

实施例7γ-PGA含量的测定

固态发酵提取液于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除沉淀，收集上清。向上清中加入3～4倍体积的无水乙醇，混匀后，置于-20℃沉淀12～20h。然后，于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除上清液，收集沉淀。用无水乙醇洗涤3～4次，待乙醇挥干后，加入一定体积的超纯水溶解沉淀后，于11000rpm，4℃条件下离心20～30min，去除沉淀，收集上清液，即为γ-PGA的提取液。冷冻干燥后，用于高效液相色谱绘制γ-PGA标准曲线，如图5所示。图6所示为实施例4和实施例5两种方法所得γ-PGA的含量，可见，液态发酵与固态发酵产纤溶酶最高可达31.98g/L和381.49g/kg。

序列表

<110> 泸州品创科技有限公司

<120> 高产纤溶酶和γ-PGA的地衣芽孢杆菌菌株及其用途

<130> A210058K（序）

<141> 2021-02-03

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtgggggg gtgctataca tgcagtcgag cggaccgacg ggagcttgct cccttaggtc 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tgcttgattg aaccgcatgg ttcaatcata aaaggtggct 180

tttagctacc acttgcagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgccgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttaggga 420

agaacaagta ccgttcgaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480

taactacgtg ccagcagccg ccggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaaattatt 540

gggcggtaaa gcgcgcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 600

ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 660

gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 720

tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgcagca 840

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaaccctt 960

accaggtctt gacatcctct gacaacccta gagatagggc ttcctccttc gggggcagag 1020

tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag aatgttgggt taagtcccgc 1080

aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc 1140

cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200

gctacacacg tgctacaatg ggcagaacaa agggcagcga agccgcgagg ctaagccaat 1260

cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat 1320

cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380

cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tggagccagc 1440

cgccgaagga cagtc 1455

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac tt 22