DNA编码化合物库构建中On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物的合成方法

摘要

本发明公开了一种DNA编码化合物库构建中On‑DNA 4‑胺基喹唑啉化合物的合成方法：该方法以On‑DNA胺基化合物为原料，使用缩合剂为活化剂，在有机碱的参与下，不需要添加任何金属催化剂，在一定温度下反应一段时间后，可实现4‑羟基喹唑啉化合物的高效胺化反应。本发明所提供的On‑DNA 4‑胺基喹唑啉化合物的制备方法，反应条件温和，不使用任何金属催化剂，成本低、后处理简单、环境友好，产率高，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

说明书

技术领域

本发明属于DNA编码化合物库技术领域，具体涉及一种通过直接胺化4-羟基喹唑啉化合物的方法，实现了On-DNA胺基化合物与4-羟基喹唑啉化合物的反应，用来合成On-DNA4-胺基喹唑啉化合物。

背景技术

美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library，简称DEL)的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的库分子先被洗掉，留下与靶标有吸附的库分子再洗脱下来，这时得到的库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，通过DNA独有的聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的小分子试剂与DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的小分子试剂，再通过传统的有机合成方法把这些小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，检测并确认其对靶标的生物活性。

DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导为主利用DNA标记技术得到的DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。

除了DNA起始片段(详见本公司发明专利：CN108070009A,CN109868268A)外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利：CN107958139A)，再通过DNA合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利：CN108959855A)。

DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发，简称On-DNA化学反应。因为DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，对DNA损伤小、有较好的回收率和底物适应性广的On-DNA化学反应，才是大规模应用于DNA编码化合物库的合成所需要的。目前公开报道的On-DNA化学反应种类近120种，包括水相的、固相的和DNA模板反应(详见在线数据库DEL ChemFinder，

4-胺基喹唑啉化合物广泛存在于天然产物和药物分子的结构中，其构建引起化学家广泛的研究兴趣。为此，人们开发了许多定制合成方法，特别是环状体系的构建。然而，在DNA编码化合物库的构建中，目前尚没有文献和专利报道过On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物的合成方法。为了解决如上问题，我们希望开发一种简便、快捷的方法，用来合成On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物，以便适应大批量多孔板的DNA编码化合物库生产的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种DNA编码化合物库构建中快速构建On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种DNA编码化合物库构建中On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物的合成方法，是采用On-DNA胺类化合物直接氨化4-羟基喹唑啉化合物，来合成On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物，包括：

将摩尔浓度为0.1～2.0mM的On-DNA胺类化合物，与10～500摩尔当量的4-羟基喹唑啉化合物溶液、10-500摩尔当量的有机碱试剂和10～500摩尔当量的缩合剂溶液混合，在20～80℃下反应1～24小时，使所述On-DNA胺基化合物与4-羟基喹唑啉化合物反应得到On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物；

其中，On-DNA胺基化合物是指由一个含伯胺或者仲胺的化学基团与一段DNA序列的氨基或羧基在分子水平通过共价键进行连接所得到的On-DNA化合物；

所述DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；

所述4-羟基喹唑啉化合物是指分子结构中含有4-羟基喹唑啉杂环结构、分子量在1000以内、且不含有其它能与伯胺或者仲胺直接发生化学反应的官能团的化合物。

具体的，所述On-DNA胺基化合物的结构通式可以用DNA-R-NH

其中R

具体的，所述4-羟基喹唑啉化合物的结构通式为

具体的，所述On-DNA胺基化合物溶于无机盐缓冲溶液后的摩尔浓度是0.1～2.0mM；优选地，所述On-DNA醛基化合物溶于无机盐缓冲溶液的摩尔浓度是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2.0mM；更优选地，所述On-DNA醛基化合物溶于无机盐缓冲溶液后的摩尔浓度为1.0mM。

具体的，所述On-DNA胺基化合物溶液的溶剂是含乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的含水的混合溶剂；优选地，所述On-DNA羰基化合物溶于无机盐缓冲液。

具体的，所述4-羟基喹唑啉化合物的摩尔当量是10～500当量；优选地，所述氨基酸或氨基酸衍生物的摩尔当量是10当量、20当量、30当量、40当量、50当量、60当量、70当量、80当量、90当量、100当量、150当量、200当量、250当量、300当量；更优选地，所述氨基酸衍生物的摩尔当量是200当量。

具体的，所述有机碱试剂是N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、1,8二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)、三乙烯二胺、三乙胺、三甲胺、吡啶、哌啶；优选地，所述有机碱试剂是1,8二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)。

具体的，所述有机碱试剂的摩尔当量是10～500当量；优选地，所述碱的摩尔当量是10当量、20当量、40当量、80当量、100当量、200当量、300当量、400当量、500当量；更优选地，所述碱的摩尔当量是200当量。

具体的，所述缩合剂是2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU,CAS 148893-10-1)、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷(PyBOP,CAS128625-52-5)、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP,CAS 56602-33-6)、(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyAOP,CAS156311-83-0)、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(PyBrOP,CAS 132705-51-2)，6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU,CAS 330645-87-9)；优选地，所述缩合剂是苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP,CAS 56602-33-6)。

具体的，所述缩合剂的摩尔当量是10～500当量；优选地，所述缩合剂的摩尔当量是10当量、20当量、30当量、40当量、50当量、60当量、70当量、80当量、90当量、100当量、150当量、200当量、250当量、300当量；更优选地，所述缩合剂的摩尔当量是10～500当量。

具体的，所述反应的反应温度为20～80℃；优选地，所述反应的反应温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或者80℃；更优选地，所述反应的温度为60℃。

具体的，所述反应的反应时间为0.1～24小时；优选地，所述反应的反应时间是10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、16小时、24小时；更优选地，所述反应的反应时间是3小时。

具体的，所述方法用于批量的多孔板操作；优选地，所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。

本发明提供了一种直接胺化4-羟基喹唑啉化合物的方法，实现了DNA编码化合物库构建中On-DNA胺基化合物与4-羟基喹唑啉化合物的高效反应，可用来合成On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物，扩大了本公司的DNA编码化合物库的多样性，得到的DNA编码化合物库的库分子更能满足市场的需要。本发明的方法对反应底物普适性好、条件温和、成本低、操作方便、收率高，适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

附图说明

图1为本发明用On-DNA胺基化合物3与4-羟基喹唑啉化合物4之间的反应，得到相应的On-DNA 4-胺基喹唑啉5的代表结构式。

图2为本发明中On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物的合成的反应方程式实例图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，On-DNA 4-羟基喹唑啉化合物5的合成

1)On-DNA芳胺化合物3a的合成

DNA-NH

将该on-DNA芳硝基化合物中间体溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，加入B

2)On-DNA烷基胺化合物3b的合成

DNA-NH

将该on-DNA化合物中间体溶于H

值得注意的是，On-DNA芳胺化合物3a与On-DNA烷基胺化合物3b将共同组成On-DNA胺基化合物3(DNA-R-NH

3)On-DNA 4-胺基喹唑啉化合物5的合成

上述On-DNA胺基化合物3溶于水，配制成1mM浓度溶液。将4-羟基喹唑啉化合物4(200mM的N-甲基吡咯烷酮溶液，200摩尔当量)和苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP,CAS 56602-33-6,200mM的N-甲基吡咯烷酮溶液，200摩尔当量)及1,8二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU,200mM的N-甲基吡咯烷酮溶液，200摩尔当量)混合，涡旋离心后分装到96孔板中，在60℃的PCR中反应5分钟，然后向反应液加入1mM On-DNA胺基化合物3溶液，混合、涡旋、离心后，在60℃的PCR中反应3小时。

加入乙醇沉淀：

向96孔板的反应孔加入总反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率(见图1)。如图1所示，为部分代表的On DNA胺基化合物的反应转化率，可见各On DNA胺基化合物的转化率均在50％以上，一半以上的On DNA胺基化合物的转化率达80％以上。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。