聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白在构建小鼠ARDS模型中的应用

摘要

本发明涉及聚肌胞苷酸和SARS‑CoV‑2棘突蛋白在构建小鼠ARDS模型中的应用，属于生物医药技术领域。该模型可用于肺部炎症的研究和药物研究开发。本发明验证了聚肌胞苷酸和SARS‑CoV‑2棘突蛋白在动物模型中，能够引起小鼠的急性肺损伤，能够模拟急性呼吸道窘迫综合征（ARDS）症状，并且能够有效诱导中性粒细胞向肺部浸润和激活，聚肌胞苷酸和SARS‑CoV‑2棘突蛋白的诱导对中性粒细胞所引起的组织损伤的诱导，存在明显的炎症反应的诱导作用，并且可以进一步应用到病毒肺部感染引起的ARDS治疗药物的研发。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白在构建小鼠ARDS模型中的应用。

背景技术

SARS-CoV-2棘突蛋白是SARS-CoV-2病毒最重要的结构蛋白，介导病毒对宿主的侵染过程，SARS-CoV-2棘突蛋白通过ACE2受体感染宿主细胞，对SARS-CoV-2的感染过程起到至关重要的作用，此外，SARS-CoV-2棘突蛋白还能引起强烈的免疫应答，可以作为疫苗开发的重要靶点。

由SARS-CoV-2引起的COVID-19最近已经影响了全世界公共卫生安全，并且已经造成全球传播。在COVID-19患者中已观察到系统性的免疫系统失调，例如淋巴细胞减少症和炎性细胞因子风暴，但目前尚没有可靠的抗病毒和抗炎症反应药物进行治疗，急性肺损伤（ALI）或急性呼吸道窘迫综合征（ARDS）模型的建立有助于急性病毒感染过程中，抗炎抗病毒药物的开发与筛选。

发明内容

本发明目的在于利用SARS-Cov-2病毒侵染肺部所造成的免疫反应特征，提供一种聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白在构建小鼠ARDS模型中的应用。

poly(I:C)，中文名：聚肌胞苷酸，别名：双链聚肌胞，聚肌苷酸-聚胞苷酸钠盐，Poly (I:C)， Poly(I) • Poly(C)，CAS号 42424-50-0，是一种TRIF依赖性toll样受体-3（TLR3）配体，是一种双链均聚物。

SARS-CoV-2棘突蛋白为SARS-CoV-2 棘突蛋白天然全长，并包括RBD，S1和S2结构域以及突变体及依据全长设计的突变体和蛋白片段。

本发明提供了一种聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白在诱导小鼠肺部产生中性粒细胞肺炎、间质肺炎和细胞因子风暴建立小鼠ARDS模型中的应用，即Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白在制备中性粒细胞造成的急性肺损伤中的应用。

具体的，本发明发现了聚肌胞苷酸的剂量为1mg/kg~5mg/kg，且SARS-CoV-2棘突蛋白剂量为5µg -15µg时能够诱导小鼠ARDS模型。

进一步的，Poly(I:C)在浓度为2.5mg/kg时，SARS-CoV-2棘突蛋白为15µg，Poly(I:C)在浓度为2.5mg/kg，SARS-CoV-2棘突蛋白为5µg时能够诱导ARDS所产生的中性粒细胞肺炎，当SARS-CoV-2棘突蛋白浓度增加到10µg和15µg时，中性粒细胞肺炎明显加重，因此Poly(I:C)在浓度为2.5mg/kg时，SARS-CoV-2棘突蛋白为15µg时，小鼠模型可以达到强烈的ARDS现象。

聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白给药方式为气管注射给药、鼻腔滴入给药、雾化给药或其它肺部直接给药方式。

本发明经研究发现：Poly(I:C)可以作为ARDS的诱导剂。

利用聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白构建小鼠ARDS模型的方法，包括以下步骤：

小鼠经腹腔麻醉后，将小鼠置于操作台上，剥出气管，注射聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白的预混液，注射体积不超过40µl，注射完成后用外科手术缝线封闭小鼠喉部伤口，用同体积同剂量的聚肌胞苷酸或生理盐水用同样方法处理后作为对照；用同体积同剂量的SARS-CoV-2棘突蛋白和人FC标签重组蛋白用同样方法处理后作为阴性对照，其中注射聚肌胞苷酸和SARS-CoV-2棘突蛋白的预混液中，聚肌胞苷酸的用量为1mg/kg~5mg/kg，SARS-CoV-2棘突蛋白的注射量为5µg -15µg，处理时间为6~48h，通过对小鼠肺部灌洗液中的中性粒细胞数量和比例的定性和定量分析来确定是否造模成功。

对小鼠肺部灌洗液中的中性粒细胞数量和比例的定性和定量分析的具体过程如下：对小鼠肺部灌洗液中的中性粒细胞数量和比例的定性和定量分析的具体过程如下：小鼠经腹腔麻醉后，用剪刀和镊子剥出小鼠气管后，用18G~26G医用静脉留置针插入小鼠气管中，移除静脉留置针的硬质针头，并将装有1ml生理盐水的注射器接到留置针上并注入气管和肺泡中，抽回液体，重复灌洗三次，离心灌洗液，将所有三次离心的肺泡灌洗液细胞合并，首先用红细胞裂解液去除肺泡灌洗液中的红细胞，接着用PBS重悬细胞后，丢掉上清，加入FC受体阻断抗体孵育15分钟，在管中加入APC标记的抗小鼠GR-1抗体标记小鼠中性粒细胞，冰上孵育30分钟后，加入1ml 4℃的PBS重悬细胞后，离心弃去上清，重悬细胞于200µl 4℃的PBS中，用流式细胞仪检测。

优选地，聚肌胞苷酸的用量为2.5mg/kg，SARS-CoV-2棘突蛋白的注射量为15µg。

利用上述方法构建的小鼠ARDS模型。

上述的小鼠ARDS模型在小鼠ARDS实验中的应用。

本发明的优点：

急性呼吸道窘迫综合征（ARDS）是SRAS-Cov-2, SRAS-Cov，MERS， H1N1病毒急性感染病人的第一死因，目前针对病人的支持治疗主要包括肺通气和激素治疗，没有针对不同病毒感染的靶向药物，病毒感染引起ARDS的机制也不够明确。在动物模型中诱导急性病毒感染引起的ARDS能够为医生和科研工作者提供一个研究平台，研究针对病毒感染所引起的ARDS的分子机制和治疗靶点。本发明的Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白能够稳定有效的在小鼠模型中诱导因病毒感染引起的ARDS，从而模拟出由诱导由SRAS-Cov-2病毒感染引起的肺损伤和间质肺炎症状，为SRAS-Cov-2的研究提供一个安全，有效的动物模型，并且该模型使用的造模试剂Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白不具有病毒的复制能力，也不具有感染能力，不需要再高安全级别的P3/P4实验室进行，为广大科研工作者提供一个简单，有效的SRAS-Cov-2模型，尽快开发出针对SRAS-Cov-2引起的人类肺炎和ARDS症状的特效药物。

附图说明

图1为Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白于8周龄雄性BALB/c小鼠气管注射诱导的ARDS，其中，Poly(I:C)在剂量为2.5mg/kg，SARS-CoV-2棘突蛋白为15µg时能诱导ARDS模型小鼠，在Poly(I:C) 2.5mg/kg建模6 h后，诱导中性粒细胞性肺炎，GR-1阳性的小鼠中性粒细胞大量浸润到肺泡中；

图2为小鼠肺泡灌洗液中，炎症相关细胞因子分析。其中两种炎症细胞因子IL-6和TNF-α出现最为显著的升高，并且与Poly(I:C)或SARS-CoV-2棘突蛋白单组分相比，合并Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白处理小鼠显示出显著的TNF-α水平升高；

图3为Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白处理小鼠后，小鼠肺部组织的病理变化，其中，与生理盐水对照组和Poly(I:C)单组分对照组，经Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白处理后的小鼠肺组织出现明显的中性粒细胞性肺炎，并且随着时间推移而加重。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

试剂

poly(I:C)购自Invivogen公司，SARS-CoV-2棘突蛋白购自金斯瑞公司，人FC蛋白对照购自ARCO公司，BALB/c小鼠购自维通利华公司，细胞因子检测试剂盒购自Biolegend，阿弗丁购自易瑞公司，红细胞裂解液购自索莱宝公司，APC标记抗小鼠GR-1抗体和FC受体阻断抗体购自Biolegend。

仪器与器材：

微量注射针（Hamilton）；电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；海尔医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；流式细胞仪（BD FACS Calibur）；

具体实验流程如下：

（1）小鼠病毒感染性ARDS模型的建立

8周龄的BALB/c雄性小鼠分为五组，每组4只，经腹腔注射阿弗丁麻醉后，将小鼠置于操作台上，用剪刀小心打开小鼠甲状腺上覆盖的皮肤，后用镊子分离气管附近的肌肉并剥出气管，用微量进样器注射Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白的预混液，Poly(I:C) 的注射量为2.5mg/kg小鼠，SARS-CoV-2棘突蛋白的注射量为每只小鼠15μg，预混液注射体积不超过40µl防止小鼠干性溺水，注射完成后用外科手术缝线封闭小鼠喉部伤口，记为Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白组，用同体积同剂量的Poly(I:C)或生理盐水造模用同样方法处理后作为对照，分别记为Poly(I:C)组和生理盐水组，SARS-CoV-2棘突蛋白15µg和人FC标签重组蛋白15µg用同样方法处理后作为阴性对照，分别记为SARS-CoV-2棘突蛋白组和人FC蛋白对照组。

Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白建立小鼠病毒感染性ARDS模型后6小时，小鼠经腹腔阿弗丁注射麻醉后，用剪刀和镊子剥出小鼠气管后，用26G医用静脉留置针插入小鼠气管中，移除静脉留置针的硬质针头，并将装有1ml生理盐水的注射器接到留置针上，缓缓注入气管和肺泡中，接着缓缓抽回液体，重复灌洗三次，并将第一次抽回的液体用于肺泡灌洗液细胞亚群鉴定和细胞因子分析。将所有三次离心的肺泡灌洗液细胞合并后用流式细胞术鉴定中性粒细胞比例。

将所有三次的肺泡灌洗液离心得到细胞后，首先用红细胞裂解液去除肺泡灌洗液中的红细胞，按照说明书量进行操作，最后用1 ml的PBS重悬细胞后，丢掉上清，加入5µl小鼠FC受体阻断抗体处理，以阻断FC受体对检测抗体的非特异性结合，FC受体阻断抗体孵育15分钟后，在管中加入APC标记的抗小鼠GR-1抗体5µl标记小鼠中性粒细胞，冰上孵育30分钟后，加入1ml 于4℃预冷的PBS重悬细胞后，离心弃去上清，重悬细胞于4℃的200µl PBS中，用流式细胞仪进行检测，同样的方法同时处理所有实验组和对照组，结果如图1所示。

由图1可知，Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白能够引起小鼠中性粒细胞性肺炎(图1A和B)，Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白处理后的小鼠肺泡灌洗液的中性粒细胞比例，相对于单病毒核酸组分Poly(I:C)或单病毒蛋白组分SARS-CoV-2棘突蛋白，显示出肺泡灌洗液的中性粒细胞明显的增加，*p<0.05。

（2）肺泡灌洗液细胞因子分析

Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白建立小鼠病毒感染性ARDS模型后6小时，小鼠经腹腔阿弗丁注射麻醉后，用剪刀和镊子剥出小鼠气管后，用26G医用静脉留置针插入小鼠气管中，移除静脉留置针的硬质针头，并将装有1ml生理盐水的注射器接到留置针上，缓缓注入气管和肺泡中， 接着缓缓抽回液体，重复灌洗三次，并将第一次抽回的液体用于肺泡灌洗液细胞亚群鉴定和细胞因子分析。

第一次取出的肺泡灌洗液样本离心取上清，用多细胞因子检测试剂盒进行细胞因子分析，按照试剂说明书进行操作，用流式细胞仪检测小鼠炎症相关细胞因子，使用试剂盒配套的分析软件LEGENDplex v8.0分析实验结果，结果如图2所示。

由图2可知，Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白能够引起小鼠ARDS，Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白处理后的小鼠肺泡灌洗液的炎症细胞因子浓度，相对于单病毒核酸组分Poly(I:C) 或单病毒蛋白组分SARS-CoV-2棘突蛋白，显示出肺泡灌洗液的炎症细胞因子TNF-α明显增加。相对于单病毒蛋白组分，显示出肺泡灌洗液的炎症细胞因子IL-6明显增加，而相对于Poly(I:C)无明显差异。该结果显示出Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白在小鼠肺部引起的以IL-6和TNF-α为主要驱动因子的炎症细胞因子风暴，引起小鼠的ARDS，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

（3）小鼠肺组织病理学分析

分别在Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白建立小鼠病毒感染性ARDS模型后6小时、24小时和48小时，以同体积同剂量的Poly(I:C)或生理盐水造模24h作为对照，造模过程和剂量同步骤（1），用戊巴比妥钠麻醉处死小鼠后，完整取出小鼠肺部，用福尔马林固定24h后，梯度酒精脱水，用石蜡包埋后切片，每片厚度3µm，取小鼠肺组织三个不同深度的石蜡切片进行苏木精-伊红染色（H&E），并探索了不同建模后6，24，48小时三个时间点中，肺损伤的严重程度，具体详见图3。

由图3可知，Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白能够引起小鼠的肺部组织损伤，H&E染色显示出Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白在处理小鼠24后引起明显的组织损伤现象，这种组织损伤以中性粒细胞性肺炎和间质肺炎为主，并且随着时间的增加而加重，相对于单病毒核酸组分Poly(I:C)，Poly(I:C) 和SARS-CoV-2棘突蛋白可以明显诱导小鼠肺部损伤。

综上可以看出：本发明经研究发现Poly(I:C)和SARS-CoV-2棘突蛋白能够诱导ARDS小鼠模型。

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。