一种玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基及组培快繁的方法

摘要

本发明提供了一种玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基及组培快繁的方法，属于植物组培苗培育技术领域。本发明提供的玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基，以MS培养基为基础培养基，在MS培养基的基础上还包括如下质量体积浓度的组分：1.0～2.0mg/L 6‑BA、0.1～0.2mg/L NAA、30～35g/L蔗糖和6～7g/L琼脂，所述诱导增殖培养基的pH值为5.8～6.0。本发明提供的诱导增殖培养基可以同时实现不定芽的诱导和增殖，简化了组织培养的步骤，缩短了试管苗成苗周期，节约了成本，同时也避免了频繁转接对组培苗造成的污染，提高了组培苗成活率。

说明书

技术领域

本发明属于植物组培苗培育技术领域，尤其涉及一种玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基及组培快繁的方法。

背景技术

玫瑰红景天(Rhodiola rosea L.)是景天科红景天属的一种多年生草本植物，又称为蔷薇红景天，多野生于林地、山坡、干燥的石缝隙、陡岩间等，分布于陕西、甘肃、新疆、河北等地。明代李时珍在《本草纲目》中记载玫瑰红景天为“本经上品，祛邪恶气”，被称为“仙赐草”，有玫瑰香味，新鲜时更浓郁，全草均可药食两用，常用根茎，性“甘、苦，平，归肺、心经”。玫瑰红景天主要活性成分包含红景天苷及其苷元酪醇、络赛维等。大量研究表明其具有抗疲劳、耐缺氧、增强学习和记忆、兴奋中枢神经系统、改善睡眠、预防高原病、抗癌等多种生理功能，是一种很受欢迎的药食两用“适应原”植物。

红景天生长环境极其恶劣且多变，如缺氧、低温干燥、狂风、强紫外线照射、昼夜温差大等，这使其具备了其它植物所罕有的特殊适应性物质，也导致其自然资源极其匮乏。红景天种子自然萌发率低，由高山引种至低海拔地区进行驯化栽培时病虫害发生很严重，加上人们大量地采挖其野生资源，使得其已濒临灭绝的境地。因此加强红景天的组织培养及其快速繁殖，保护其自然资源及其遗传多样性极其迫切。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基及组培快繁的方法。本发明提供的玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基可以同时实现不定芽的诱导和增殖，方法操作简单，可在较短时间内得到大量红景天试管苗，实现玫瑰红景天的快速繁殖。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基，所述诱导增殖培养基以MS培养基为基础培养基，在MS培养基的基础上还包括如下质量体积浓度的组分：1.0～2.0mg/L 6-BA、0.1～0.2mg/L NAA、30～35g/L蔗糖和6～7g/L琼脂，所述诱导增殖培养基的pH值为5.8～6.0。

本发明提供了一种玫瑰红景天组培快繁的方法，包括以下步骤：

1)将种子置于上述技术方案中所述的诱导增殖培养基中进行诱导增殖培养，获得玫瑰红景天丛生芽；

2)将玫瑰红景天丛生芽接种到生根培养基中进行生根培养，获得玫瑰红景天试管苗；所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，在1/2MS培养基的基础上还包括如下质量体积浓度的组分：0.4～0.6mg/LNAA、0.5～1.0g/L活性炭、30～35g/L蔗糖和6～7g/L琼脂，所述生根培养基的pH值为5.8～6.0；

3)将获得的玫瑰红景天试管苗进行炼苗、移栽。

优选的，步骤1)所述种子在进行诱导增殖培养前，还进行促进发芽处理，所述促进发芽处理包括：用赤霉素水溶液浸泡，所述赤霉素水溶液中赤霉素的浓度为350～450mg/L，所述浸泡的时间为5～10min。

优选的，步骤1)种子在进行诱导增殖培养前，还包括消毒处理，所述消毒处理的方法包括：将种子浸入75％的酒精中浸泡25～30s，用无菌水清洗后转入0.1％的HgCl

优选的，步骤1)所述诱导增殖培养的条件包括：先进行黑暗培养，得到愈伤组织；得到愈伤组织后，进行光照培养，获得玫瑰红景天丛生芽。

优选的，所述黑暗培养的条件为：温度23～25℃，湿度75％～85％，黑暗培养时间20～23d；所述光照培养的条件为：温度23～25℃，湿度75％～85％，光照强度1500～2000Lx，光照时间12～14h/d，培养时间30～40d。

优选的，步骤2)中，用于接种的丛生芽的长度为1.5～2.0cm。

优选的，步骤2)所述生根培养的条件为：温度23～25℃，湿度75％～85％，光照强度1500～2000Lx，光照时间12～14h/d，培养时间20～30d。

优选的，当获得的玫瑰红景天试管苗的不定根的长度达到2～3cm时进行炼苗，所述炼苗的时间为2～4d。

优选的，所述移栽用基质包括泥炭、蛭石和椰糠，所述基质中，泥炭、蛭石和椰糠的质量比为(2～2.5)：(1～1.5)：1。

有益效果

本发明提供了一种玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基，所述诱导增殖培养基以MS培养基为基础培养基，在MS培养基的基础上还包括如下质量体积浓度的组分：1.0～2.0mg/L 6-BA、0.1～0.2mg/L NAA、30～35g/L蔗糖和6～7g/L琼脂，所述诱导增殖培养基的pH值为5.8～6.0。本发明提供的诱导增殖培养基可以同时实现不定芽的诱导和增殖，简化了组织培养的步骤，缩短了试管苗成苗周期，节约了成本，同时也避免了频繁转接对组培苗造成的污染，提高了组培苗成活率。

进一步的，本发明还提供了一种玫瑰红景天组培快繁的方法，首先，将种子置于诱导增殖培养基中进行诱导增殖培养，获得玫瑰红景天丛生芽，本发明诱导增殖培养基可同时进行不定芽诱导和增殖培养，简化了组织培养的步骤缩短了试管苗成苗周期，节约了成本，同时也避免了频繁转接对组培苗造成的污染；获得丛生芽后，本发明将丛生芽接种到生根培养基进行生根培养，获得玫瑰红景天试管苗，本发明的生根培养基具有良好的诱导生根的效果；最后，将获得的玫瑰红景天试管苗进行炼苗、移栽。本发明提供的红景天组培快繁方法，操作简单，可在较短时间内得到大量红景天试管苗，实现玫瑰红景天的快速繁殖，极具推广价值。

附图说明

图1为实施例1玫瑰红景天诱导增殖培养1d的情况；

图2为实施例1玫瑰红景天诱导增殖培养25d的情况；

图3为实施例1玫瑰红景天诱导增殖培养40d的情况；

图4为实施例1玫瑰红景天壮苗生根培养20d情况；

图5为实施例1玫瑰红景天移栽50d的情况。

具体实施方式

本发明提供了一种玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基，所述诱导增殖培养基以MS培养基为基础培养基，在MS培养基的基础上还包括如下质量体积浓度的组分：1.0～2.0mg/L 6-BA、0.1～0.2mg/L NAA、30～35g/L蔗糖和6～7g/L琼脂，所述诱导增殖培养基的pH值为5.8～6.0；进一步优选包括如下质量体积浓度的组分：2.0mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂。在本发明中，所述诱导增殖培养基的pH值为5.8～6.0，进一步优选为5.9。本发明对培养基各组分的来源没有特殊要求，采用本领域普通市售产品即可。在本发明诱导增殖培养基中，6-BA可以促进不定芽分化和细胞分裂，NAA能够促进细胞分裂，蔗糖为碳源。本发明的诱导增殖培养基通过将6-BA和NAA的联合使用，可以同时实现不定芽的诱导和增殖，简化了组织培养的步骤缩短了试管苗成苗周期，节约了成本，同时也避免了频繁转接对组培苗造成的污染，提高了组培苗成活率。

本发明提供了一种玫瑰红景天组培快繁的方法，包括以下步骤：

1)将种子置于上述技术方案中所述的诱导增殖培养基中进行诱导增殖培养，获得玫瑰红景天丛生芽；

2)将玫瑰红景天丛生芽接种到生根培养基中进行生根培养，获得玫瑰红景天试管苗；所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，在1/2MS培养基的基础上还包括如下质量体积浓度的组分：0.4～0.6mg/LNAA、0.5～1.0g/L活性炭、30～35g/L蔗糖和6～7g/L琼脂，所述生根培养基的pH值为5.8～6.0；

3)将获得的玫瑰红景天试管苗进行炼苗、移栽。

本发明优选将种子在进行诱导增殖培养前，进行促进发芽处理。在本发明中，所述种子优选挑选种粒饱满、无病害的成熟玫瑰红景天种子，以提高萌发率。在本发明中，所述促进发芽处理优选包括：用赤霉素水溶液浸泡，所述赤霉素水溶液中赤霉素的浓度优选为350～450mg/L，进一步优选为400mg/L；所述浸泡的时间优选为5～10min，进一步优选为10min。本发明选用上述特定浓度的赤霉素浸泡可促进种子萌发，提高种子发芽率。本发明优选在赤霉素水溶液处理后用流水冲洗，冲洗后再用洗涤剂浸泡。在本发明中，所述流水冲洗的时间优选为5～10min，进一步优选为5min；所述洗涤剂浸泡种子的时间优选为5～10min，进一步优选为10min，期间不断搅拌，去除杂质，用流水冲洗干净后滤纸吸干水分。

本发明优选在促进发芽处理后对种子进行消毒处理。本发明在进行消毒处理前，优选将促萌发处理的种子再用洗衣粉水清洗三次，冲干净泡沫后，装入网袋中，在流水下浸泡冲洗2h，以去除杂质，带走抑制种子萌发的物质。在本发明中，所述消毒处理的方法包括：将种子浸入75％的酒精中浸泡25～30s，用无菌水清洗后转入0.1％的HgCl

消毒处理后，本发明将种子置于上述技术方案中所述的诱导增殖培养基中进行诱导增殖培养，获得玫瑰红景天丛生芽。在本发明中，所述诱导增殖培养的条件优选包括：先进行黑暗培养，得到愈伤组织；得到愈伤组织后，进行光照培养，获得玫瑰红景天丛生芽。在本发明中，所述黑暗培养的条件优选为温度23～25℃，湿度75％～85％，黑暗培养时间20～23d；进一步优选为24℃，湿度80％，黑暗培养时间20d，本发明所述黑暗培养有利于愈伤组织的诱导。在本发明中，所述光照培养的条件优选为温度23～25℃，湿度75％～85％，光照强度1500～2000Lx，光照时间12～14h/d，培养时间30～40d；进一步优选为温度24℃，湿度80％，光照强度1800Lx，光照时间12h/d，培养时间35d，本发明所述光照培养可促使愈伤组织分化不定芽。光照培养后，得到玫瑰红景天丛生芽。

获得玫瑰红景天丛生芽后，本发明将玫瑰红景天丛生芽接种到生根培养基中进行生根培养，获得玫瑰红景天试管苗。本发明优选将玫瑰红景天丛生芽切下用于接种。在本发明中，用于接种的丛生芽的长度优选为1.5～2.0cm，进一步优选为2cm，本发明选择长度相近的丛生芽生根培养，组培苗更均匀，商品性更好。在本发明中，所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，在1/2MS培养基的基础上还包括如下质量体积浓度的组分：0.4～0.6mg/L NAA、0.5～1.0g/L活性炭、30～35g/L蔗糖和6～7g/L琼脂，进一步优选包括如下质量体积浓度的组分：0.5mg/LNAA、1.0g/L活性炭、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂。在本发明中，所述生根培养基的pH值为5.8～6.0，进一步优选为5.9。本发明所述生根培养基中NAA具有促进细胞分裂、诱导不定根产生的作用；活性炭可以吸附组培苗释放的自毒物质，使组培苗更加健壮；蔗糖可以为组培苗提供合适的碳源，本发明提供的生根培养基具有良好的壮苗和促生根的效果。在本发明中，所述生根培养的条件优选为温度23～25℃，湿度75％～85％，光照强度1500～2000Lx，光照时间12～14h/d，培养时间20～30d；进一步优选为温度24℃，湿度80％，光照强度1800Lx，光照时间12h/d，培养时间21d，本发明所述生根培养的条件为玫瑰红景天生根提供适宜的环境，促进其快速生根。

生根培养后，本发明将获得的玫瑰红景天试管苗进行炼苗、移栽。本发明优选当获得的玫瑰红景天试管苗的不定根的长度达到2～3cm时打开组培瓶盖，倒入少量无菌水，进行炼苗，所述炼苗的时间优选为2～4d，进一步优选为3d。在本发明中，所述炼苗培养的条件优选为温度23～25℃，湿度75％～85％，光照强度1500～2000Lx，光照时间12～14h/d，培养时间2～4d；进一步优选为温度24℃，湿度80％，光照强度1800Lx，光照时间12h/d，培养时间3d，本发明所述炼苗可提高玫瑰红景天移栽成活率。在本发明中，所述移栽用基质优选包括泥炭、蛭石和椰糠，所述基质中，泥炭、蛭石和椰糠的质量比优选为(2～2.5)：(1～1.5)：1，所述移栽用基质可以提高移栽后的组培苗的成活率。在本发明中，优选将移栽后的组培苗先在温度21～25℃，光照强度1500～2000lx，空气相对湿度70％～85％之间的温室中培养1～2周后，再进行室外大田移栽，可进一步提高移栽后的组培苗的成活率；移栽时间优选下午5:00～6:00之间，并浇透水。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种玫瑰红景天组培快繁的诱导增殖培养基及组培快繁的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种玫瑰红景天组培快繁的方法

(1)选择种子和促进发芽处理：筛选种粒饱满、无病害的成熟玫瑰红景天种子用400mg/L赤霉素(GA

(2)种子消毒和萌发培养：上述处理后的种子再用洗衣粉水清洗三次，冲干净泡沫后，装入网袋中，在流水下浸泡冲洗2h，在超净工作台中进行消毒。将吸干水分的种子浸入75％的酒精中浸泡30s，用无菌水清洗5次后转入0.1％的HgCl

(3)不定芽诱导和增殖：将上述灭菌处理的种子播撒至诱导增殖培养基中，其中诱导增殖培养基以MS培养基为基础培养基，在MS培养基的基础上添加如下质量体积浓度的组分：2.0mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH值为6.0；培养条件：黑暗培养20d，温度24±1℃，湿度80±5％，后光照培养，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx，培养35天，获得玫瑰红景天丛生芽。图1为玫瑰红景天诱导增殖培养1d的情况，图2为玫瑰红景天诱导增殖培养25d(黑暗培养20d，光照培养5d)的情况，图3为玫瑰红景天诱导增殖培养40d(黑暗培养20d，光照培养20d)的情况。

(4)壮苗、生根培养：将玫瑰红景天1.5～2cm的不定芽切下，接种到生根培养基中，其中生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，在1/2MS培养基的基础上添加如下质量体积浓度的组分：0.5mg/L NAA、1.0g/L活性炭、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH值为6.0；培养条件：温度24±1℃，湿度80±5％，光照12h/d，光照强度1500～2000Lx，培养20d，获得完整的玫瑰红景天试管苗，结果见图4，由图4的照片可知，玫瑰红景天试管苗的生根情况良好。

5)炼苗移栽：当玫瑰红景天组培苗不定根长度达2～3cm时，打开瓶盖，倒入少量无菌水，在室内炼苗3d后，将组培苗从生根培养基中分离，用流水洗净培养基，用稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡试管苗根部20min，用吸水纸吸干水分，移栽到泥炭、蛭石和椰糠的质量比为2:1:1的移栽基质中，浇足定根水。移栽后的试管苗先在温度24℃，光照强度1500～2000lx，湿度80±5％之间的温室中培养1周后，再进行室外大田移栽，移栽时间选择下午5:00～6:00之间，并浇透水。图5为移栽后50d的情况。

实施例2

一种玫瑰红景天组培快繁的方法，同实施例1相同，不同之处在于：诱导增殖培养基为在MS培养基的基础上添加如下质量体积浓度的组分：1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH值为6.0。

实施例3

一种玫瑰红景天组培快繁的方法，同实施例1相同，不同之处在于：增殖培养基为在MS培养基的基础上添加如下质量体积浓度的组分：1.5mg/L 6-BA、0.15mg/L NAA、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH值为6.0。

对比例1

一种玫瑰红景天组培快繁的方法，同实施例1相同，不同之处在于：诱导增殖培养基为在MS培养基的基础上添加如下质量体积浓度的组分：1.0mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH值为6.0。

对比例2

一种玫瑰红景天组培快繁的方法，同实施例1相同，不同之处在于：生根培养基为在1/2MS培养基的基础上添加如下质量体积浓度的组分：0.5mg/LIAA、1.0g/L活性炭、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH值为6.0。

对比例3

一种玫瑰红景天组培快繁的方法，同实施例1相同，不同之处在于：生根培养基为在1/2MS培养基的基础上添加如下质量体积浓度的组分：0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，pH值为6.0。

对比例4

一种玫瑰红景天组培快繁的方法，同实施例1相同，不同之处在于：移栽基质的泥炭和椰糠质量比为1∶1。

对比例5

一种玫瑰红景天组培快繁的方法，同实施例1相同，不同之处在于：移栽基质的泥炭和蛭石质量比为1∶1。

效果评价

1不定芽诱导效果考察

使用实施例1、实施例2和对比例1的方法诱导不定芽，考察不同培养基对愈伤组织和不定芽的诱导效果，检测结果如表1。

表1不同培养基对玫瑰红景天的愈伤组织和不定芽诱导的影响

由表1的结果可知，本发明实施例1～3的方法不定芽的诱导率可达84％～95％，愈伤组织的诱导率可达84％～96％，其中，实施例1的方法愈伤组织诱导率和不定芽诱导率最高；对比例1在实施例1的基础上添加激动素KT，具有促进细胞分化、分裂，诱导愈伤组织的作用，但对比例1并没有进一步提高愈伤组织和不定芽的诱导率，反而抑制了实施例1的诱导效果，说明不同的植物品种适宜的诱导愈伤组织和不定芽的激素种类和浓度是不同的，并不是所有促进愈伤组织和不定芽诱导的激素均合适，激素种类选择不当，还会对愈伤组织和不定芽的诱导起到抑制作用。

2壮苗生根效果考察

使用实施例1、对比例2和对比例3的方法诱导玫瑰红景天丛生芽生根，考察不同生根培养基对壮苗生根效果的影响，检测结果如表2。

表2不同生根培养基对玫瑰红景天生长和生根的影响

由表2的结果可知，壮苗生根培养基中，添加0.5mg/LNAA比添加0.5mg/L IAA生根效果好，植株更健壮，添加活性炭比不添加活性炭生根效果好。

3组培苗移栽效果考察

使用实施例1、对比例4和对比例5的方法培养玫瑰红景天，考察不同移栽培养基对玫瑰红景天组培苗移栽效果，检测结果如表3。

表3不同移栽培养基对玫瑰红景天移栽成活率和长势的影响

由表3的结果可知，对比例4中泥炭椰糠混合保水性好，透气性差，导致移栽的组培苗长势不好，实施例1添加蛭石增加透气性，植株移栽成活率高，长势好；对比例5中混合基质的移栽效果不如实施例1，说明泥炭、蛭石、椰糠配合使用的效果最好。

上述实施例的结果表明，本发明提供的玫瑰红景天组培快繁方法可同时进行不定芽诱导和增殖培养，简化了组织培养的步骤缩短了试管苗成苗周期，节约了成本，同时也避免了频繁转接对组培苗造成的污染，可在较短时间内得到大量红景天试管苗，实现玫瑰红景天的快速繁殖。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。