血清miRNA在辅助诊断脑卒中后认知障碍中的应用

摘要

本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及一种血清miRNA在辅助诊断脑卒中后认知障碍中的应用。首先公开了一种辅助诊断脑卒中后认知障碍的miRNA标志物，所述miRNA标志物选自miR‑21、miR‑132和miR‑200b中的至少一种；所述miR‑21、miR‑132和miR‑200b的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

说明书

技术领域

本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及一种血清miRNA在辅助诊断脑卒中后认知障碍中的应用。

技术背景

脑卒中后认知功能障碍是脑卒中后常见的并发症之一，在全球的发病率为20-80％不等，在我国有80.97％的脑卒中患者遗留有脑卒中后认知障碍，并有32.05％的患者可发展为中重度痴呆。认知障碍的发生使脑卒中复发几率增加2.7倍，死亡率增加2.65倍，直接影响脑卒中患者的预后，延长住院时间，给家庭和社会带来沉重的负担。早期诊断、早期干预可逆转脑卒中后认知障碍进一步发展，减少痴呆的发生。但是目前脑卒中后认知障碍的临床诊断主要依赖临床评估、神经认知功能测试及神经影像学检查，但这些方法存在主观性强、特异性差的缺点，目前尚缺乏被广泛认可的统一诊断标准。因此，寻找客观且灵敏的早期诊断方法具有重要的临床意义。

miRNA是一类长约20-23个核苷酸的小型非编码RNA，可降解mRNA或翻译其抑制从而靶向负调控相关蛋白的表达，在生理和病理的发生发展过程中具有重要作用。近年来，研究发现miRNA是用于诊断多种疾病，如阿尔茨海默症，血管性认知障碍，帕金森等，被认为是一种新颖且有价值的生物标志物。miRNA有望成为脑卒中后认知障碍诊断的潜在生物标志物，但何种miRNA可用于诊断脑卒中后认知障碍尚有待研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明发现了几种可辅助诊断脑卒中后认知障碍的miRNA标志物，具有潜在的临床应用价值。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种辅助诊断脑卒中后认知障碍的miRNA标志物，所述miRNA标志物选自miR-21、miR-132和miR-200b中的至少一种；

所述miR-21、miR-132和miR-200b的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明第二个方面公开了miR-21、miR-132和/或miR-200b作为辅助诊断脑卒中后认知障碍的分子标志物的应用；所述miR-21、miR-132和miR-200b的核苷酸序列分别如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

优选的，所述诊断产品为检测试剂盒。

更优选的，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂。

更优选的，所述检测试剂盒的检测样品为患者血样。

更优选的，所述检测试剂盒使用SYBR GREEN系统通过定量实时PCR检测miRNA的表达。

更优选的，所述定量实时PCR反应条件为：95℃预变性3min后，按照95℃15s、60℃30s、72℃ 30s为一个循环，共进行40循环。

本发明第三个方面公开了一种用于辅助诊断脑卒中后认知障碍的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括miRNA标志物；所述miRNA标志物选自miR-21、miR-132和miR-200b中的至少一种；

所述miR-21、miR-132和miR-200b的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

与现有技术相比，本发明至少具有以下区别技术特征：

本发明发现了几种新的辅助诊断脑卒中后认知障碍的miRNA标志物，该miRNA标志物具有易于检测、经济、灵敏性高等优点，具有潜在的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中四种血清miRNA的相对表达情况；

图2为本发明中几种miRNA水平与MMSE评分之间的相关性的分析示意图；

图3为本发明中几种miRNA在辅助诊断脑卒中后认知障碍中的ROC分析结果图。

具体实施方式

下面通过详细的实施例对本申请进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本申请，并不对发明内容进行限定。

实施例中所用仪器、设备、试剂均可通过各种渠道获得，例如购买得到，或可以制备而得。

实施例1

本实例证明血清miR-21、miR-124、miR-132和miR-200b在不同人群中的表达情况。

一、研究对象

研究纳入9例脑卒中后认知正常患者(PSCN)(MMSE评分＞24)和23例脑卒中后认知障碍患者(PSCI)(MMSE评分≤24)，此处MMSE为Mini-MentalState Examination的缩写，指简易精神状态量表。收集患者的血液样本进行miRNA表达水平的检测，以上两组间的年龄、身高等因素无显著性差异(P＞0.05)，脑卒中后认知障碍患者的体重稍轻于脑卒中后认知障碍患者的体重。上述样本的收集均通过伦理委员会和参与者的同意。

其中，PSCI：Post-stroke cognitive impairment，脑卒中后认知功能障碍；PSCN：post-stroke cognitive normality，脑卒中后认知功能正常。

二、研究方法

1.血清样本的采集

用抗凝管采集患者血样，1h内进行处理，4℃下820g离心10min，取上清液。吸约1ml上清转至洁净的1.5ml离心管中，4℃下1600g再次离心10min。

2.提取总RNA

根据mirVana PARIS试剂盒(Ambion，Austin,Texas)说明书中所示步骤，进行血清总RNA抽提；在1.5ml EP管中加入血清，加入等体积的2xDenturing solution后立即涡旋充分混匀，于冰上5min；加入2倍血清体积的酸酚氯仿，涡旋1min充分混匀。室温下离心1000g，5min；回收上层水相至新试管中，加入1.25倍体积的无水乙醇，充分混匀；将过滤柱置于收集管中，吸取上一步中混合液，置于过滤柱上，(每个过滤柱不超过700μl液体)1000g离心15s，将混合液过滤。上述条件重复离心1-3次，至裂解液乙醇混合液完全过滤；用洗脱液I洗脱过滤柱，离心5-10s，丢弃收集管中的液体，在过滤柱上加入500μl洗脱液2/3，洗脱方法同上一步，洗脱2次；弃收集管中液体，将过滤柱置于收集管上，离心1min，去掉剩余的液体；将过滤柱转移到新收集管中。将95℃预热的洗脱液或DEPC水置于过滤柱中心，盖上管盖离心20-30s，回收；收集洗脱液，并用Nano Drop超微量分光光度计测定所提取样品RNA纯度及浓度。

3.逆转录

通过搜索和阅读相关文献，我们选择了四种miRNA(miR-124，miR-132，miR-200b，miR-21)进行研究。使用Bio-Rad逆转录试剂盒进行RNA逆转录反应，以合成miRNA特异性cDNA。所述miR-21、miR-132、miR-200b和miR-124的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

RNA反转录反应：冰上配制反转录体系，使用PCR仪进行RNA反转录反应，制备样品cDNA。

3.1反转录体系配方(10μl体系为例)：

①5×iScript Reaction mix 2μl；

②iScript Reverse Transcriptase 0.5μl；

③RNA 1μg；

加水至10μl。

3.2RNA反转录反应条件为：

①25℃ 5min；

②42℃ 30min；

③85℃ 5min；

4℃保存。

4.qPCR检测

使用SYBR GREEN荧光系统通过定量实时PCR(qRT-PCR)检测特定miRNA的表达。选择miR-39作为内源性对照。

4.1mRNA实时荧光定量PCR反应体系(10μl体系为例)：

①10μl SYBR GREEN加入2μl引物正反链混合物，加入1μl的样品cDNA并用；

②Nuclease-free water定量至10μl后混匀离心。

mRNA实时荧光定量PCR反应条件：95℃预变性3min后，按照95℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 30s为一个循环，共进行40循环。

然后进行熔解曲线分析以评估PCR特异性。通过使用2

三、结果

miRNA的相对表达情况如图1所示。PSCI患者中miR-21的表达水平比PSCN中高3.47倍(4.47±4.54比1.34±2.08，Mann-Whitney检验，P＜0.001)。PSCI患者中miR-132和miR-200b的水平也较高，分别高4.55倍(10.82±9.65vs.1.95±3.27)和3.96倍(9.67±7.91vs.1.95±3.37)。(Mann-Whitney检验，P＜0.01)。但是，PSCI和PSCN患者之间的miR-124水平没有显着差异。

从本实施例可知，miR-21、miR-132和miR-200b可作为辅助诊断脑卒中后认知障碍的分子标志物。

实施例2

本实例证明差异性表达的miRNA与认知功能之间的相关性，及其在脑卒中后认知障碍中的诊断价值。

一、研究方法

(1)取材过程及qPCR分析过程同实施例1

(2)相关性分析

利用SPSS进行Spearman相关分析来统计miRNA水平与MMSE(Mini-MentalStateExamination，简易精神状态量表)评分之间的相关性。此外，为了检测3种差异性表达的miRNA在脑卒中后认知障碍中的诊断作用，利用SPSS进行ROC分析，检测差异性表达的3种miRNA的特异性和灵敏性。

二、结果

miR-21和MMSE评分之间存在显着正相关(r＝0.488，P＝0.005)。但是，未观察到其它miRNA的表达水平与认知功能之间存在着显着相关性(P＞0.05)，具体如图2所示。

ROC分析结果显示miR-21的诊断作用最佳，AUC为0.865(95％CI，0.710-1.000)，灵敏性为88.89％，特异性为82.61％。miR-132和miR-200b也表现出良好的诊断性能，AUC分别为0.821(95％CI，0.647-0.996)，0.836(95％CI，0.673-0.999)，灵敏度分别为77.78％，77.78％，特异性分别为86.96％，91.30％，具有较高的灵敏性和特异性，且miR-200b的特异性高于miR-132。具体可见图3和表1。

表1

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海市浦东新区周浦医院(上海健康医学院附属周浦医院)

<120> 血清miRNA在辅助诊断脑卒中后认知障碍中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caacaccagu cgaugggcug u 21

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uaacagucua cagccauggu cg 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uaauacugcc ugguaaugau ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uaaggcacgc ggugaaugcc aa 22