抑制微小RNA的非规范性靶标的诱导RNA干扰的核酸及其用途

摘要

本发明涉及诱导RNA干扰的核酸，其抑制微小RNA的非规范靶基因，其中特异性微小RNA的部分序列已被修改。通过使用本发明的诱导RNA干扰的核酸，有效提高了微小RNA通过抑制非规范靶基因而表现出的生物学功能，或者具有选择性表现常规微小RNA的仅一种生物学功能(即抑制非规范靶基因的功能)的益处。本发明的诱导干扰的核酸能够调节细胞周期、分化、去分化、形成、运动、分裂、增殖或死亡，并且本发明有望可用于各种领域，例如药物和化妆品领域。

说明书

技术领域

本发明涉及抑制基因表达的诱导RNA干扰的核酸及其用途，特别是涉及通过选择性抑制微小RNA的非规范(noncanonical)靶标而显示出有用的效果的诱导干扰的核酸及其用途。

本申请要求于2018年5月31日提交的韩国专利申请KR10-2018-0063054，于2018年5月31日提交的韩国专利申请KR10-2018-0063055，于2019年5月31日提交的韩国专利申请KR10-2019-0064333，于2019年5月31日提交的韩国专利申请10-2019-0064334，于2019年5月31日提交的韩国专利申请KR10-2019-0064335和于2019年5月31日提交的韩国专利申请KR10-2019-0064386的优先权和权益，其全部公开内容通过引用合并于此。

背景技术

RNA干扰是在转录后水平抑制基因表达的现象。自然发生的RNA干扰现象是由microRNA(miRNA)引起的。MiRNA由18至25个核苷酸组成，大多数miRNA是由约21个核苷酸组成的小RNA，具有通过Argonaute蛋白与靶基因的信使RNA(mRNA)互补的碱基序列。动物miRNA与Argonaute蛋白缔合(associated)，以具有与靶mRNA配对的部分碱基。在这种情况下，当在基于miRNA 5’末端的位置1至8的核苷酸所定义的种子区域中至少6个连续碱基被配对时，该序列被识别为靶标，最重要的是，当至少5’末端的2至7位的6个碱基连续与靶mRNA配对时，通过充分降解相应的靶mRNA或抑制翻译来抑制mRNA的表达(Lewis BP等人，2003，Cell，115(7)，787-98)。由于miRNA通过配对碱基配对识别靶基因的mRNA，因此一个miRNA通常可能影响数百至数千个基因的表达。

miRNA对靶基因表达的抑制作用是基因表达的主要机制之一，在正常情况下会参与细胞的分化和生长，并且在功能异常时会导致癌症，退行性疾病或糖尿病，因此，miRNA作为生命的关键吸引了人们的注意。因此，为了人为地诱导miRNA的基因表达抑制作用，具有miRNA的种子区域的RNA干扰物质(siRNA或shRNA)被设计成被转染到细胞中，从而人为地分化细胞或改变其功能，并且在某些情况下，被用作疾病的治疗剂。因此，通过Argonaute识别靶mRNA的miRNA种子区域中的互补碱基配对对于展现RNA干扰物质(例如miRNA)的适当功能是重要的。特别地，为了施加这种RNA干扰物质，需要鉴定miRNA的每种功能。在此，根据抑制了哪个靶基因来确定miRNA的功能，因此需要对miRNA的所有靶基因(靶标)进行分析。

在转录组水平上，发明人首次通过Ago HITS-CLIP(或称为CLIP-Seq)对miRNA靶复合物进行了研究。Ago HITS CLIP测定法是一种方法，其通过对细胞或组织样品进行紫外线照射，通过细胞中RNA与Argonaute蛋白(Ago)之间的共价键形成复合物，然后使用Ago特异性识别抗体通过免疫沉淀分离RNA-Ago复合物，并通过下一代测序分析分离的RNA。因此，可以准确地分析与Ago结合的miRNA，与其互补配对的靶mRNA基团及其位置(Chi S等人，Nature，2009，460(7254)：479-86)。

结果，发明人鉴定了miRNA可以结合靶mRNA，尽管不与miRNA种子区域准确互补地结合。更具体地，通过与至少6个连续碱基的完全配对，尤其是最显著地是通过5'末端的2至7位碱基配对，由miRNA的5'末端的1至8位的碱基序列限定的miRNA种子区域与mRNA的结合，被称为规范(canonical)靶标识别。尽管与上述规则不同，与miRNA种子区域没有连续且准确的互补性，但是将识别为miRNA的靶标并与miRNA结合称为非规范靶标识别。根据AgoHITS-CLIP分析的结果，可以看出miRNA通过种子区域对非规范靶标的识别频率约为规范识别频率的50％。

因此，可以看出，被设计为包括miRNA种子区域的序列的常规RNA干扰物质(例如，siRNA或shRNA)通过抑制除规范靶基因之外的若干种非规范靶基因而具有生物学功能。

发明内容

[技术问题]

因此，本发明旨在解决被设计为包括miRNA种子区域的完整序列的常规RNA干扰物质的局限性，并提高了效率。

更具体地，被设计为包括miRNA种子区域的完整序列的常规RNA干扰物质同时抑制规范靶基因和非规范靶基因，并且规范靶基因被强烈抑制，而非规范靶基因被非常弱地抑制。因此，本发明旨在提供诱导RNA干扰的核酸，其具有有效提高通过常规的miRNA抑制非规范靶基因而表现出的生物学功能的作用，或选择性地表现出生物学功能中的一种，即常规miRNA抑制非规范靶基因仅表现出的生物学功能。

[技术方案]

为了解决上述问题，本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因。

更具体地，本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因，

其中诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5'末端的2至7位的碱基序列，其是与靶mRNA配对相关的最重要位点，该碱基序列具有在5’末端的2至5位的4个碱基以及在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括包含G：A和G：U摆动配对的所有互补碱基，以允许结合至在所述miRNA的5至6位之间所述靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过所述凸起的消失而成为连续的碱基对，或者

所述诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶或腺嘌呤替代，优选地，在基于从miRNA的5'末端起1至9个碱基的碱基序列的5'末端的2至7位的序列中至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶或腺嘌呤替代，使得相应位点的G：A或G：U摆动配对变成U：A或A：U的规范碱基对。

优选地，特异性miRNA具有选自miR-124、miR-155、miR-122、miR-1、let-7、miR-133、miR-302和miR-372的相同种子序列，并且由18至24个碱基组成。

优选地，诱导RNA干扰的核酸在5’末端的2至7位具有任何一个或多个碱基序列：

具有碱基序列5'-AA GGC C-3'(miR-124-BS)的诱导RNA干扰的核酸，作为抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：1)；

具有碱基序列5'-GG AGU U-3'(miR-122-BS)的诱导RNA干扰的核酸，作为抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：2)；

具有碱基序列5'-UA AUG G-3'(miR-155-BS)的诱导RNA干扰的核酸，作为抑制miR-155的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：3)；或

具有碱基序列5'-GG AAU U-3'(miR-1-BS)的诱导RNA干扰的核酸，作为抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：4)。

优选地，诱导RNA干扰的核酸的碱基序列由以下的任何一种或多种表示：

具有碱基序列5'-UAA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3'(miR-124-BS)的诱导RNA干扰的核酸，作为抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：5)；

具有碱基序列5'-UGG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3'(miR-122-BS)的诱导RNA干扰的核酸，作为抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：6)；

具有碱基序列5'-UUA AUG GCU AAU CGU GAU AGG-3'(miR-155-BS)的诱导RNA干扰的核酸，作为抑制miR-155的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：7)；或

具有碱基序列5'-UGG AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3'(miR-1-BS)的诱导RNA干扰的核酸，作为抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：8)。

优选地，诱导RNA干扰的核酸是从5’末端起的第1至第9个碱基之间的碱基序列中的任何一个或多个：

诱导RNA干扰的核酸，其优选具有修改的碱基序列，其中在5’末端的2至7位的序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，例如碱基序列5'-UAA UGC ACG-3'(miR-124-G4U)(SEQID NO：9)、5'-UAA GUC ACG-3'(miR-124-G5U)(SEQ ID NO：10)或5'-UAA UUC ACG-3'(miR-124-G4,5U)(SEQ ID NO：11)，作为抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

诱导RNA干扰的核酸，其优选具有修改的碱基序列，其中在5’末端的2至7位的序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，例如5'-UUG AAU GUA-3'(miR-1-G2U)(SEQ ID NO：12)、5'-UGU AAU GUA-3'(miR-1-G3U)(SEQ ID NO：13)、5'-UGG AAU UUA-3'(miR-1-G7U)(SEQID NO：14)、5'-UUU AAU GUA-3'(miR-1-G2,3U)(SEQ ID NO：15)、5'-UGU AAU UUA-3'(miR-1-G3,7U)(SEQ ID NO：16)、5'-UUG AAU UUA-3'(miR-1-G2,7U)(SEQ ID NO：17)或5'-UUUAAU UUA-3'(miR-1-G2,3,7U)(SEQ ID NO：18)，作为抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

作为抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的，具有碱基序列5'-UUGAGU GUG-3'(miR-122-G2U)(SEQ ID NO：19)、5'-UGU AGU GUG-3'(miR-122-G3U)(SEQ IDNO：20)、5'-UGG AUU GUG-3'(miR-122-G5U)(SEQ ID NO：21)、5'-UGG AGU UUG-3'(miR-122-G7U)(SEQ ID NO：22)、5'-UGG AGU GUU-3'(miR-122-G9U)(SEQ ID NO：23)、5'-UUUAGU GUG-3'(miR-122-G2,3U)(SEQ ID NO：24)、5'-UUG AUU GUG-3'(miR-122-G2,5U)(SEQID NO：25)、5'-UUG AGU UUG-3'(miR-122-G2,7U)(SEQ ID NO：26)、5'-UUG AGU GUU-3'(miR-122-G2,9U)(SEQ ID NO：27)、5'-UGU AUU GUG-3'(miR-122-G3,5U)(SEQ ID NO：28)、5'-UGU AGU UUG-3'(miR-122-G3,7U)(SEQ ID NO：29)、5'-UGU AGU GUU-3'(miR-122-G3,9U)(SEQ ID NO：30)、5'-UGG AUU UUG-3'(miR-122-G5,7U)(SEQ ID NO：31)、5'-UGG AUUGUU-3'(miR-122-G5,9U)(SEQ ID NO：32)或5'-UGG AGU UUU-3'(miR-122-G7,9U)(SEQ IDNO：33)的诱导RNA干扰的核酸，并且优选具有修改的碱基序列，其中在5’末端的2至7位的序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，例如5'-UUG AGU GUG-3'(miR-122-G2U)(SEQ ID NO：19)、5'-UGU AGU GUG-3'(miR-122-G3U)(SEQ ID NO：20)、5'-UGG AUU GUG-3'(miR-122-G5U)(SEQ ID NO：21)、5'-UGG AGU UUG-3'(miR-122-G7U)(SEQ ID NO：22)、5'-UUU AGUGUG-3'(miR-122-G2,3U)(SEQ ID NO：24)、5'-UUG AUU GUG-3'(miR-122-G2,5U)(SEQ IDNO：25)、5'-UUG AGU UUG-3'(miR-122-G2,7U)(SEQ ID NO：26)、5'-UGU AUU GUG-3'(miR-122-G3,5U)(SEQ ID NO：28)、5'-UGU AGU UUG-3'(miR-122-G3,7U)(SEQ ID NO：29)或5'-UGG AUU UUG-3'(miR-122-G5,7U)(SEQ ID NO：31)；

诱导RNA干扰的核酸，其具有修改的碱基序列，其中在5’末端的2至7位的序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，例如碱基序列5'-UUU UGU CCC-3'(miR-133-G4U)(SEQ IDNO：34)、5'-UUU GUU CCC-3'(miR-133-G5U)(SEQ ID NO：35)或5'-UUU UUU CCC-3'(miR-133-G4,5U)(SEQ ID NO：36)，作为抑制miR-133的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

具有碱基序列5'-UUA GGU AGU-3'(let-7-G2U)(SEQ ID NO：37)、5'-UGA UGUAGU-3'(let-7-G4U)(SEQ ID NO：38)、5'-UGA GUU AGU-3'(SEQ ID NO：39)、5'-UGA GUUAUU-3'(let-7-G8U)(SEQ ID NO：40)、5'-UUA GUU AGU-3'(let-7-G2,4U)(SEQ ID NO：41)、5'-UUA GUU AGU-3'(let-7-G2，5U)(SEQ ID NO：42)、5'-UUA GGU AUU-3'(let-7-G2,8U)(SEQ ID NO：43)、5'-UGA UUU AGU-3'(let-7-Glet G4,5U)(SEQ ID NO：44)、5'-UGA UGUAUU-3'(let-7-G4,8U)(SEQ ID NO：45)或5'-UGA GUU AUU-3'(let-7-G5,8U)(SEQ ID NO:46)，并且优选具有修改的碱基序列，其中基于5’末端的2至7位中的序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，例如5'-UUA GGU AGU-3'(let-7-G2U)(SEQ ID NO：37)、5'-UGA UGU AGU-3'(let-7-G4U)(SEQ ID NO：38)、5'-UGA GUU AGU-3'(let-7-G5U)(SEQ ID NO：39)、5'-UUAUGU AGU-3'(let-7-G2,4U)(SEQ ID NO：41)、5'-UUA GUU AGU-3'(let-7-G2,5U)(SEQ IDNO：42)或5'-UGA UUU AGU-3'(let-7-G4,5U)(SEQ ID NO：42)(ID NO：44)作为抑制let-7的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

诱导RNA干扰的核酸，优选具有修改的碱基序列，其中在基于5'末端的2至7位的序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，例如5'-UAA UUG CUU-3'(miR-302a-G4U)(SEQ ID NO：47)、5'-UAA GUU CUU-3'(miR-302a-G6U)(SEQ ID NO：48)或5'-UAA UUU CUU-3'(miR-302a-G4,6U)(SEQ ID NO：49)，作为抑制miR-302a的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；或

诱导RNA干扰的核酸，优选具有修改的碱基序列，其中在从5’末端起的2至7位的序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，例如5'-AAA UUG CUG-3'(miR-372-G4U)(SEQ ID NO：50)、5'-AAA GUU CUG-3'(miR-372-G6U)(SEQ ID NO：51)、5'-AAA GUG CUU-3'(miR-372-G9U)(SEQ ID NO：52)、5'-AAA UUU CUG-3'(miR-372-G4,6U)(SEQ ID NO：53)、5'-AAA UUGCUU-3'(miR-372-G4,9U)(SEQ ID NO：54)或5'-AAA GUU CUU-3'(miR-372-G6,9U)(SEQ IDNO：55)，作为抑制miR-372的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸。

优选地，诱导RNA干扰的核酸具有一个或多个以下碱基序列：

作为抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的，具有碱基序列5'-UAAUGC UGC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G4U)(SEQ ID NO：56)、5'-UAA GUC ACGCGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G5U)(SEQ ID NO：57)或5'-UAA UUC ACG CGG UGA AUGCCA A-3'(miR-124-G4,5U)(SEQ ID NO：58)的诱导RNA干扰的核酸；

作为抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的，具有碱基序列5'-UUGAAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G2U)(SEQ ID NO：59)、5'-UGU AAU GUA AAG AAUUAU GUA U-3'(miR-1-G3U)(SEQ ID NO：60)、5'-UGG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G7U)(SEQ ID NO：61)、5'-UUU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G2,3U)(SEQ ID NO：62)、5'-UGU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G3,7U)(SEQ ID NO：63)、5'-UUU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G2,7U)(SEQ ID NO：64)或5'-UUUAAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G2,3,7U)(SEQ ID NO：65)的诱导RNA干扰的核酸；

作为抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的，具有碱基序列5'-UUGAGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G2U)(SEQ ID NO：66)、5'-UGU AGU GUG ACAAUG GUG UUU G-3'(miR-122-G3U)(SEQ ID NO：67)、5'-UGG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G5U)(SEQ ID NO：68)、5'-UGG AGU UUG ACA AUG GUG UU U G-3'(miR-122-G7U)(SEQ ID NO：69)、5'-UGG AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G9U)(SEQ IDID：70)、5'-UUGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G2,3U)(SEQ ID NO：71)、5'-UUGU AGU GUG ACA GUG UUU G-3'(miR-122-G2,5U)(SEQ ID NO：72)、5'-UUG AGU UUG ACAAUG GUG UUU G-3'(miR-122-G2,7U)(SEQ ID NO：73)、5'-UUG AGU GUU ACA AUG GUG UUUG-3'(miR-122-G2,9U)(SEQ ID NO：74)、5'-UGU AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3(miR-122-G3，5U)(SEQ ID NO：75)、5'-UGU AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G3,7U)(SEQID NO：76)、5'-UGU AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G3,9U)(SEQ ID NO：77)、5'-UGG AUU UUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G5,7U)(SEQ ID NO：78)、5'-UGG AUUGUU ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G5,9U)(SEQ ID NO：79)或5'-UGG AGU UUU ACA AUGGUG UUU G-3'(miR-122-G7,9U)(SEQ ID NO：80)的诱导RNA干扰的核酸；

作为抑制miR-133的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的，具有碱基序列5'-UUUUGU CCC CUU CAA CCA GCU G-3'(miR-133-G4U)(SEQ ID NO：81)、5'-UUU GUU CCC CUUCAA CCA GCU G-3'(miR-133-G5U)(SEQ ID NO：82)或5'-UUU UUU CCC CUU CAA CCA GCUG-3'(miR-133-G4,5U)(SEQ ID NO：83)的诱导RNA干扰的核酸；

作为抑制let-7的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，具有碱基序列5'-UUA GGUAGU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G2U)(SEQ ID NO：84)、5'-UGA GUU AGU AGU AGG UUGUAU AGU U-3'(let-7-G4U)(SEQ ID NO：85)、5'-UGA GUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G5U)(SEQ ID NO：86)、5'-UGA GGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G8U)(SEQID NO：87)、5'-UUA UGU AGU AGG UUG UAU UGU U-3'(let-7-G2,4U)(SEQ ID NO：88)、5'-UUA UGU AGU AGU AGG UUG UGU AGU U-3'(let-7-G2,5U)(SEQ ID NO：89)、5'-UGA UGUGGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G2,8U)(SEQ ID NO：90)、5'-UGA UGU GGU AUUAGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G4,5U)(SEQ ID NO：91)、5'-UGA UGU AUU AGG UUG UAUAGU U-3'(let-7-G4,8U)(SEQ ID NO：92)或5'-UGA GUU AUU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G5,8U)(SEQ ID NO：93)的诱导RNA干扰的核酸；

作为抑制miR-302a的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的，具有碱基序列5'-UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3'(miR-302a-G4U)(SEQ ID NO：94)、5'-UAA GUU CUUCCA UGU UUU GGU GA-3'(miR-302a-G6U)(SEQ ID NO：95)或5'-UAA UUU CUU CCA UGU UUUGGU GA-3'(miR-302a-G4,6U)(SEQ ID NO：96)的诱导RNA干扰的核酸；或

作为抑制miR-372的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的，具有碱基序列5'-AAAUUG CUG CGA CAU UUG AGC GU-3'(miR-372-G4U)(SEQ ID NO：97)、5'-AAA GUU CUG CGACAU UUG AGC GU-3'(miR-372-G6U)(SEQ ID NO：98)、5'-AAA GUG CUG CGA CAU UUG AGCGU-3'(miR-372-G9U)(SEQ ID NO：99)、5'-AAA UUU CUG CGA CAU UUG AGC GU-3'(miR-372-G4,6U)(SEQ ID NO：100)、5'-AAA UUG CUU CGA CAU UUG AGC GU-3'(miR-372-G4,9U)(SEQ ID NO：101)或5'-AAA GUU CUU CGA CAU CUG UUG AGC GU-3'(miR-372-G6,9U)(SEQID NO：102)的诱导RNA干扰的核酸。

本发明提供了用于抑制miRNA的非规范靶基因表达的组合物，其包括诱导RNA干扰的核酸。

本发明提供了抑制miRNA的非规范靶基因表达的方法，该方法包括将包含诱导RNA干扰的核酸的组合物施用于受试者。

本发明提供了诱导RNA干扰的核酸用于抑制miRNA的非规范靶基因表达的用途。

本发明提供了用于调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、分裂、增殖或凋亡的组合物，其包括诱导RNA干扰的核酸。

本发明提供了调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、分裂、增殖或凋亡的方法，该方法包括将包含诱导RNA干扰的核酸的组合物施用于受试者。

本发明提供了诱导RNA干扰的核酸用于调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、分裂、增殖或凋亡的用途。

优选地，该组合物是选自以下的任何一种或多种组合物：

用于诱导癌细胞死亡的组合物，其包括抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于诱导神经突分化的组合物，其包括抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于诱导肝癌细胞的细胞周期停滞的组合物，其包含抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于促进肌细胞分化或肌纤维化的组合物，其包含抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于诱导肌细胞死亡的组合物，其包括抑制miR-155的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于诱导神经母细胞瘤细胞死亡的组合物，其包括抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于促进神经母细胞瘤的细胞分裂或增殖的组合物，其包含抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于诱导心肌肥大的组合物，其包含抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于诱导心肌肥大的组合物，其包含抑制miR-133的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于诱导癌细胞的细胞周期停滞的组合物，其包含抑制let-7的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于诱导肝细胞的细胞周期进行活性的组合物，其包含抑制let-7的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于促进去分化的组合物，其包含抑制miR-302a的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；

用于促进去分化的组合物，其包含抑制miR-372的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸；或

用于抑制肝癌细胞的细胞迁移的组合物，其包含抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸。

本发明提供了制备诱导RNA干扰的核酸的方法，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因的表达，该方法包括以下步骤：

构建诱导RNA干扰的核酸，所述诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5'末端的2至5位的4个碱基以及在6位和7位的碱基的序列，所述在6位和7位的碱基相同并且与能够与所述特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括包含G：A和G：U摆动配对的所有互补碱基，以允许结合至在所述miRNA的5至6位之间所述靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过所述凸起的消失而成为连续的碱基对，或

构建诱导RNA干扰的核酸，所述诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中在特异性miRNA的5'末端的第1至9个碱基之间的碱基序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，其中在相应位点的G：A或G：U摆动配对变成规范碱基序列U：A或A：U。

另外，本发明提供了筛选用于调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、分裂、增殖或死亡的测试材料的方法，包括以下步骤：

将诱导RNA干扰的核酸转染到靶细胞中；

用测试材料处理靶细胞；和

确认抑制靶细胞中诱导RNA干扰的核酸的miRNA的非规范靶基因的表达水平或表达。

另外，本发明提供如下的诱导RNA干扰的核酸：

1.2’OMe修改的诱导RNA干扰的核酸

本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因，其中

诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5’末端的2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，以允许结合至在miRNA的5位至6位之间靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过凸起的消失而成为连续的碱基对，并且

特异性miRNA的特征是，添加甲基(2'OMe)到从5'末端起第6个核苷酸的核糖基环的2'位。

优选地，诱导RNA干扰的核酸仅抑制相应的诱导RNA干扰的核酸的规范种子靶基因的表达。

优选地，诱导RNA干扰的核酸的特征在于特异性地抑制特异性miRNA的非规范成核凸起位点，并去除能够新产生的非规范成核凸起位点。

此外，本发明提供了用于抑制miRNA的非规范靶基因表达的组合物，其包括诱导RNA干扰的核酸。

此外，本发明提供了抑制miRNA的非规范靶基因表达的方法，miRNA包括诱导RNA干扰的核酸。

此外，本发明提供了诱导RNA干扰的核酸用于抑制miRNA的非规范靶基因表达的用途。

此外，本发明提供了制备诱导RNA干扰的核酸的方法，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因的表达，该方法包括以下步骤：

构建诱导RNA干扰的核酸，所述诱导RNA干扰的核酸具有在从所述特异性miRNA的5'末端起2至5位的4个碱基以及在6位和7位的碱基的序列，所述在6位和7位的碱基相同并且与能够与所述特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包含G：A和G：U摆动配对)，以允许结合至在所述miRNA的5至6位之间所述靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过所述凸起的消失而成为连续的碱基对；和

将甲基(2'OMe)添加到从特异性miRNA的5'末端起第6个核苷酸的核糖基环的2'位。

2.抑制miRNA的非规范成核凸起靶位点的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：103至528)

本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因，其中

诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5’末端的2至5位的4个碱基以及在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，以允许结合至在miRNA的5至6位之间所述靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过凸起的消失而成为连续的碱基对。

优选地，诱导RNA干扰的核酸的特征在于选择性地仅抑制非规范成核凸起位点并且不抑制miRNA的规范靶基因。

优选地，特异性miRNA由6至24个碱基组成，其包括在选自以下之一的相同种子序列的5’末端的2至5位的4个碱基的序列：let-7/98/4458/4500,miR-125a-5p/125b-5p/351/670/4319,miR-124/124ab/506,miR-9/9ab,miR-29abcd,miR-103a/107/107ab,miR-221/222/222ab/1928,miR-26ab/1297/4465,miR-15abc/16/16abc/195/322/424/497/1907,miR-126-3p,miR-30abcdef/30abe-5p/384-5p,miR-33ab/33-5p,miR-34ac/34bc-5p/449abc/449c-5p,miR-19ab,miR-99ab/100,miR-17/17-5p/20ab/20b-5p/93/106ab/427/518a-3p/519d,miR-27abc/27a-3p,miR-218/218a,miR-22/22-3p,miR-185/882/3473/4306/4644,miR-181abcd/4262,miR-338/338-3p,miR-127/127-3p,miR-101/101ab,miR-149,miR-324-5p,miR-24/24ab/24-3p,miR-33a-3p/365/365-3p,miR-139-5p,miR-138/138ab,miR-143/1721/4770,miR-25/32/92abc/363/363-3p/367,miR-574-5p,miR-7/7ab,miR-145,miR-135ab/135a-5p,miR-148ab-3p/152,miR-28-5p/708/1407/1653/3139,miR-130ac/301ab/301b/301b-3p/454/721/4295/3666,miR-3132,miR-155,miR-485-3p,miR-132/212/212-3p,hsa-miR-9-3p,miR-374ab,miR-129-3p/129ab-3p/129-1-3p/129-2-3p,hsa-miR-126-5p,miR-425/425-5p/489,miR-423-3p,miR-21/590-5p,miR-31,hsa-miR-20b-3p,hsa-let-7d-3p,miR-191,miR-18ab/4735-3p,miR-369-3p,hsa-miR-5187-5p,miR-382,miR-485-5p/1698/1703/1962,hsa-miR-136-3p,miR-576-3p,miR-204/204b/211,miR-769-5p,miR-342-5p/4664-5p,miR-361-5p,miR-199ab-3p/3129-5p,miR-142-3p,miR-299-5p/3563-5p,miR-193/193b/193a-3p,hsa-miR-1277-5p,miR-140/140-5p/876-3p/1244,hsa-miR-30a/d/e-3p,hsa-let-7i-3p,miR-409-5p/409a,miR-379/1193-5p/3529,miR-136,miR-154/872,miR-4684-3p,miR-361-3p,miR-335/335-5p,miR-423a/423-5p/3184/3573-5p,miR-371/373/371b-5p,miR-1185/3679-5p,miR-3613-3p,miR-93/93a/105/106a/291a-3p/294/295/302abcde/372/373/428/519a/520be/520acd-3p/1378/1420ac,miR-876-5p/3167,miR-329/329ab/362-3p,miR-582-5p,miR-146ac/146b-5p,miR-380/380-3p,miR-499-3p/499a-3p,miR-551a,miR-142-5p,hsa-miR-17-3p,miR-199ab-5p,miR-542-3p,miR-1277,hsa-miR-29c-5p,miR-3145-3p,hsa-miR-106b-3p,hsa-miR-22-5p,miR-744/1716,hsa-miR-132-5p,miR-488,miR-501-3p/502-3p/500/502a,miR-486-5p/3107,miR-450a/451a,hsa-miR-30c-3p,miR-499-5p,miR-421,miR-197,miR-296-5p,miR-326/330/330-5p,miR-214/761/3619-5p,miR-612/1285/3187-5p,miR-409-3p,miR-378/422a/378bcdefhi,miR-342-3p,miR-338-5p,miR-625,miR-200bc/429/548a,hsa-miR-376a-5p,miR-584,miR-411,miR-573/3533/3616-5p/3647-5p,miR-885-5p,hsa-miR-99-3p,miR-876-3p,miR-654-3p,hsa-miR-340-3p,miR-3614-5p,hsa-miR-124-5p,miR-491-5p,miR-96/507/1271,miR-548a-3p/548ef/2285a,hsa-miR-32-3p,miR-3942-5p/4703-5p,miR-34b/449c/1360/2682,hsa-miR-23a/b-5p,miR-362-5p/500b,miR-677/4420,miR-577,miR-3613-5p,miR-369-5p,miR-150/5127,miR-544/544ab/544-3p,hsa-miR-29a-5p,miR-873,miR-3614-3p,miR-186,miR-483-3p,hsa-miR-374a-3p,miR-196abc,hsa-miR-145-3p,hsa-miR-29b-2-5p,hsa-miR-221-5p,miR-323b-3p,miR-616,miR-330-3p,hsa-miR-7-3p,miR-187,hsa-miR-26a-3p,miR-452/4676-3p,miR-129-5p/129ab-5p,miR-223,miR-4755-3p,miR-1247,miR-3129-3p,hsa-miR-335-3p,miR-542-5p,hsa-miR-181a-3p,hsa-miR-186-3p,hsa-miR-27b-5p,miR-491-3p,miR-4687-3p,hsa-miR-101-5p,miR-4772-5p,miR-337-3p,hsa-miR-223-5p,hsa-miR-16/195-3p,miR-3677-3p,hsa-miR-766-5p,miR-299/299-3p/3563-3p,miR-3140-3p,miR-532-5p/511,hsa-miR-24-5p,miR-4778-5p,miR-642b,miR-483-5p,miR-767-5p,hsa-miR-31-3p,miR-574-3p,miR-3173-3p,miR-2127/4728-5p,hsa-miR-103a-2-5p,miR-3591-3p,hsa-miR-625-3p,hsa-miR-15b-3p,miR-522/518e/1422p,miR-548d-3p/548acbz,hsa-miR-452-3p,miR-192/215,miR-1551/4524,hsa-miR-425-3p,miR-3126-3p,hsa-miR-125b-2-3p,miR-324-3p/1913,hsa-miR-141-5p,hsa-miR-365a/b-5p,hsa-miR-29b-1-5p,miR-563/380-5p,miR-1304,miR-216c/1461/4684-5p,hsa-miR-2681-5p,miR-194,miR-296-3p,hsa-miR-205-3p,miR-888,miR-4802-3p,hsa-let-7a/g-3p,miR-762/4492/4498,hsa-miR-744-3p,hsa-miR-148b-5p,miR-514/514b-3p,miR-28-3p,miR-550a,hsa-miR-125b-1-3p,hsa-miR-506-5p,hsa-miR-1306-5p,miR-3189-3p,miR-675-5p/4466,hsa-miR-34a-3p,hsa-miR-454-5p,miR-509-5p/509-3-5p/4418,hsa-miR-19a/b-5p,miR-4755-5p,hsa-miR-93-3p,miR-3130-5p/4482,hsa-miR-488-5p,hsa-miR-378a-5p,miR-575/4676-5p,miR-1307,miR-3942-3p,miR-4677-5p,miR-339-3p,miR-548b-3p,hsa-miR-642b-5p,miR-188-5p,hsa-miR-652-5p,miR-2114,miR-3688-5p,hsa-miR-15a-3p,hsa-miR-181c-3p,miR-122/122a/1352,miR-556-3p,hsa-miR-218-2-3p,miR-643,miR-140-3p,miR-1245,hsa-miR-2115-3p,miR-518bcf/518a-3p/518d-3p,miR-3200-3p,miR-545/3065/3065-5p,miR-1903/4778-3p,hsa-miR-302a-5p,hsa-miR-183-3p,miR-3144-5p,miR-582-3p,miR-4662a-3p,miR-3140-5p,hsa-miR-106a-3p,hsa-miR-135a-3p,miR-345/345-5p,miR-125a-3p/1554,miR-3145-5p,miR-676,miR-3173-5p,hsa-miR-5586-3p,miR-615-3p,miR-3688-3p,miR-4662a-5p,miR-4659ab-5p,hsa-miR-5586-5p,hsa-miR-514a-5p,miR-10abc/10a-5p,hsa-miR-888-3p,miR-3127-5p,miR-508-3p,hsa-miR-185-3p,hsa-miR-200c-5p,hsa-miR-550a-3p,miR-513c/514b-5p,miR-490-3p,hsa-miR-5187-3p,miR-3664-3p,miR-3189-5p,miR-4670-3p,miR-105/105ab,hsa-miR-135b-3p,hsa-miR-5010-3p,miR-493/493b,miR-3605-3p,miR-188-3p,hsa-miR-449c-3p,miR-4761-5p,miR-224,miR-4796-5p,hsa-miR-551b-5p,miR-556-5p,hsa-miR-122-3p,miR-4677-3p,miR-877,miR-576-5p,miR-490-5p,hsa-miR-589-3p,miR-4786-3p,hsa-miR-374b-3p,hsa-miR-26b-3p,miR-3158-3p,miR-4423-3p,miR-518d-5p/519bc-5p520c-5p/523b/526a,miR-4707-3p,hsa-miR-10a-3p,miR-526b,hsa-miR-676-5p,hsa-miR-660-3p,hsa-miR-5004-3p,miR-193a-5p,hsa-miR-222-5p,miR-4661-3p,hsa-miR-25-5p,miR-4670-5p,miR-659,miR-1745/3194-3p,hsa-miR-182-3p,miR-298/2347/2467-3p,hsa-miR-130b-5p,miR-4746-3p,miR-1893/2277-5p,miR-3619-3p,hsa-miR-138-1-3p,miR-4728-3p,miR-3127-3p,miR-671-3p,hsa-miR-211-3p,hsa-miR-2114-3p,hsa-miR-877-3p,miR-3157-5p,miR-502-5p,miR-500a,miR-548g,miR-523,hsa-miR-584-3p,miR-205/205ab,miR-4793-5p,hsa-miR-363-5p,hsa-miR-214-5p,miR-3180-5p,miR-1404/2110,miR-3157-3p,hsa-miR-191-3p,miR-1346/3940-5p/4507,miR-4746-5p,miR-3939,hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-500a-3p,hsa-miR-196b-3p,hsa-miR-675-3p,hsa-miR-548aj/g/x-5p,miR-4659ab-3p,hsa-miR-5001-3p,hsa-miR-1247-3p,miR-2890/4707-5p,hsa-miR-150-3p,hsa-miR-629-3p,miR-2277-3p,miR-3547/3663-3p,miR-34bc-3p,miR-518ef,miR-3187-3p,miR-1306/1306-3p,miR-3177-3p,miR-1ab/206/613,miR-128/128ab,miR-1296,miR-598/598-3p,miR-887,miR-1-5p,miR-376c/741-5p,miR-374c/655,miR-494,miR-651,miR-1301/5047,miR-381-5p,miR-216a,miR-300/381/539-3p,miR-1249,miR-579,miR-656,miR-433,miR-1180,miR-597/1970,miR-190a-3p,miR-1537,miR-874-5p,miR-410/344de/344b-1-3p,miR-370,miR-219-2-3p/219-3p,miR-3620,miR-504/4725-5p,miR-2964/2964a-5p,miR-450a-2-3p,miR-511,miR-6505-3p,miR-433-5p,miR-6741-3p,miR-370-5p,miR-579-5p,miR-376c-5p,miR-376b-5p,miR-552/3097-5p,miR-1910,miR-758,miR-6735-3p,miR-376a-2-5p,miR-585,miR-451和miR-137/137ab,在6和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补。

优选地，诱导RNA干扰的核酸包括由SEQ ID NO：103至528中的任一个或多个表示的碱基序列(参见表3)。

此外，本发明提供了用于抑制miRNA的非规范靶基因表达的组合物，其包括诱导RNA干扰的核酸。

此外，本发明提供了抑制miRNA的非规范靶基因表达的方法，该方法包括将包含诱导RNA干扰的核酸的组合物施用于受试者。

此外，本发明提供了诱导RNA干扰的核酸用于抑制miRNA的非规范靶基因的用途。

此外，本发明提供了制备诱导RNA干扰的核酸的方法，其抑制miRNA的非规范靶基因的表达，其中在诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列被修改，该方法包括以下步骤：

构建诱导RNA干扰的核酸，所述诱导RNA干扰的核酸具有在从所述特异性miRNA的5'末端起2至5位的4个碱基以及在6位和7位的碱基的序列，所述在6位和7位的碱基相同并且与能够与所述特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，以允许结合至在所述miRNA的5至6位之间所述靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过所述凸起的消失而成为连续的碱基对。

3.抑制miRNA的非规范G：A摆动靶位点的诱导RNA干扰的核酸(SEQ ID NO：529至863)

本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改诱导RNA干扰的核酸的双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因，其中

所述诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中在特异性miRNA的5'末端的第2至9个碱基之间的碱基序列中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶替代，并且在相应位点的G：A摆动配对变成规范碱基序列U：A。

优选地，诱导RNA干扰的核酸包括从特异性miRNA的5'末端的第2个碱基开始的6至8个连续碱基的序列，其中

至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶碱基替代。

优选地，诱导RNA干扰的核酸选择性地仅抑制与G：A摆动配对结合的miRNA的非规范靶基因，而不抑制miRNA的规范靶基因。

优选地，特异性miRNA由6至24个碱基组成，其包括选自以下中的一种：hsa-miR-1-3p,hsa-miR-194-5p,hsa-miR-193a-5p,hsa-miR-15b-3p,hsa-miR-200c-5p,hsa-miR-214-5p,hsa-miR-134-5p,hsa-miR-145-3p,hsa-miR-22-5p,hsa-miR-423-3p,hsa-miR-873-3p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-143-3p,hsa-miR-485-5p,hsa-miR-409-5p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-223-3p,hsa-miR-144-5p,hsa-miR-379-5p,hsa-miR-146b-5p/hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-539-5p,hsa-miR-296-5p,hsa-miR-767-5p,hsa-miR-34a-5p/hsa-miR-34c-5p,hsa-let-7f-5p/hsa-let-7d-5p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7a-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-miR-202-3p/hsa-let-7i-5p/hsa-miR-98-5p/hsa-let-7c-5p/hsa-let-7g-5p,hsa-miR-1271-3p,hsa-miR-138-5p,hsa-miR-19b-3p/hsa-miR-19a-3p,hsa-miR-27a-5p,hsa-miR-146b-3p,hsa-miR-7-5p,hsa-miR-423-5p,hsa-miR-324-5p,hsa-miR-629-5p,hsa-miR-139-3p,hsa-miR-30d-5p/hsa-miR-30e-5p/hsa-miR-30a-5p/hsa-miR-30c-5p/hsa-miR-30b-5p,hsa-miR-221-3p/hsa-miR-222-3p,hsa-miR-509-3p,hsa-miR-769-5p,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-185-5p,hsa-miR-508-3p/hsa-miR-219a-5p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-103a-3p/hsa-miR-107,hsa-miR-542-3p,hsa-miR-219a-2-3p,hsa-miR-29c-3p/hsa-miR-29a-3p/hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-125b-1-3p,hsa-miR-411-5p,hsa-miR-196a-5p/hsa-miR-196b-5p,hsa-miR-3622a-5p,hsa-miR-127-5p,hsa-miR-22-3p,hsa-miR-153-3p,hsa-miR-15b-5p/hsa-miR-16-5p/hsa-miR-424-5p,hsa-let-7g-3p/hsa-miR-493-5p/hsa-let-7c-3p,hsa-let-7i-3p,hsa-miR-218-5p,hsa-miR-1307-5p,hsa-miR-127-3p,hsa-miR-210-3p,hsa-miR-187-3p,hsa-miR-192-3p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-500a-3p,hsa-miR-203a-3p,hsa-miR-30c-2-3p,hsa-miR-488-3p,hsa-miR-301a-3p/hsa-miR-301b-3p,hsa-miR-126-3p,hsa-miR-26b-3p,hsa-miR-324-3p,hsa-miR-3065-3p,hsa-miR-124-5p,hsa-miR-345-5p,hsa-miR-615-3p,hsa-miR-889-5p/hsa-miR-135a-5p/hsa-miR-135b-5p,hsa-miR-18a-5p,hsa-miR-708-5p/hsa-miR-28-5p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-100-3p,hsa-miR-873-5p,hsa-miR-4662a-5p,hsa-miR-99b-3p/hsa-miR-99a-3p,hsa-miR-433-5p,hsa-miR-3605-5p,hsa-miR-744-5p,hsa-miR-1296-5p,hsa-miR-133a-3p,hsa-miR-382-5p,hsa-miR-425-5p,hsa-miR-377-5p,hsa-miR-3180-3p,hsa-miR-758-3p,hsa-miR-93-3p,hsa-miR-154-5p,hsa-miR-124-3p,hsa-miR-194-3p,hsa-miR-375,hsa-miR-148a-5p,hsa-miR-2277-5p,hsa-miR-17-3p,hsa-miR-4772-3p,hsa-miR-329-5p,hsa-miR-182-5p/hsa-miR-96-5p,hsa-miR-2467-5p/hsa-miR-485-5p,hsa-miR-149-5p,hsa-miR-29b-2-5p,hsa-miR-122-3p,hsa-miR-302a-3p/hsa-miR-520a-3p/hsa-miR-519b-3p/hsa-miR-520b/hsa-miR-519c-3p/hsa-miR-520c-3p/hsa-miR-519a-3p,hsa-miR-532-5p,hsa-miR-132-5p,hsa-miR-541-5p,hsa-miR-671-3p,hsa-miR-518e-3p,hsa-miR-487a-5p,hsa-miR-589-5p/hsa-miR-146b-5p/hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-196b-5p/hsa-miR-196a-5p,hsa-miR-486-3p,hsa-miR-378a-3p,hsa-miR-27b-5p,hsa-miR-6720-3p,hsa-miR-574-3p,hsa-miR-29a-5p,hsa-miR-30c-2-3p/hsa-miR-30c-1-3p,hsa-miR-199b-3p,hsa-miR-574-5p,hsa-miR-4677-3p,hsa-miR-654-3p,hsa-miR-652-3p,hsa-miR-19a-3p/hsa-miR-19b-3p,hsa-let-7c-5p/hsa-miR-98-5p/hsa-let-7g-5p/hsa-let-7f-5p/hsa-miR-202-3p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-let-7a-5p/hsa-let-7d-5p/hsa-let-7i-5p,hsa-miR-3663-3p,hsa-miR-152-3p/hsa-miR-148b-3p/hsa-miR-148a-3p,hsa-miR-193b-5p,hsa-miR-502-3p/hsa-miR-501-3p,hsa-miR-299-3p,hsa-miR-140-5p,hsa-miR-96-5p/hsa-miR-182-5p,hsa-miR-193b-3p,hsa-miR-365a-3p,hsa-miR-486-5p,hsa-miR-493-3p,hsa-miR-548am-5p,hsa-miR-20b-5p/hsa-miR-20a-5p/hsa-miR-93-5p/hsa-miR-17-5p/hsa-miR-106b-5p,hsa-miR-541-3p,hsa-miR-452-5p,hsa-miR-221-5p,hsa-miR-518f-3p,hsa-miR-370-3p,hsa-miR-107/hsa-miR-103a-3p,hsa-miR-338-3p,hsa-miR-409-3p,hsa-let-7d-5p/hsa-let-7g-5p/hsa-let-7i-5p/hsa-let-7f-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-let-7a-5p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7c-5p,hsa-miR-130b-3p/hsa-miR-301a-3p/hsa-miR-130a-3p/hsa-miR-301b-3p,hsa-miR-512-3p,hsa-miR-191-5p,hsa-miR-509-3-5p,hsa-miR-92a-3p/hsa-miR-92b-3p/hsa-miR-363-3p/hsa-miR-25-3p/hsa-miR-32-5p,hsa-miR-183-5p,hsa-miR-1307-3p,hsa-miR-499a-5p/hsa-miR-208a-3p,hsa-miR-186-5p,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-450a-5p,hsa-miR-101-3p/hsa-miR-144-3p,hsa-miR-320a,hsa-miR-199b-5p/hsa-miR-199a-5p,hsa-miR-135a-5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-26a-5p,hsa-miR-34c-5p,hsa-miR-125b-5p,hsa-miR-526b-5p,hsa-miR-16-5p/hsa-miR-15b-5p/hsa-miR-424-5p/hsa-miR-15a-5p,hsa-miR-9-3p,hsa-miR-363-5p,hsa-miR-1298-3p,hsa-miR-148a-3p,hsa-miR-302a-3p,hsa-miR-9-5p,hsa-miR-28-3p,hsa-miR-508-3p,hsa-miR-137,hsa-miR-5010-5p,hsa-miR-523-5p,hsa-miR-128-3p,hsa-miR-199a-5p/hsa-miR-199b-5p,hsa-miR-181a-2-3p,hsa-miR-27a-3p/hsa-miR-27b-3p,hsa-let-7d-3p,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-424-3p,hsa-miR-181a-3p,hsa-miR-10a-5p,hsa-miR-196b-5p,hsa-miR-92a-1-5p,hsa-miR-483-5p,hsa-miR-1537-3p,hsa-miR-106b-5p/hsa-miR-20a-5p/hsa-miR-17-5p/hsa-miR-93-5p,hsa-miR-30a-3p/hsa-miR-30e-3p,hsa-miR-374a-3p,hsa-miR-675-5p,hsa-miR-503-5p,hsa-miR-340-5p,hsa-miR-208a-3p,hsa-miR-200b-3p/hsa-miR-200c-3p,hsa-miR-518f-5p/hsa-miR-523-5p,hsa-miR-625-3p,hsa-miR-194-5p,hsa-let-7g-3p,hsa-miR-514a-5p,hsa-miR-381-3p,hsa-miR-513c-5p/hsa-miR-514b-5p,hsa-miR-520a-5p,hsa-miR-125b-5p/hsa-miR-125a-5p,hsa-miR-141-3p,hsa-miR-874-3p,hsa-miR-202-5p,hsa-miR-140-3p,hsa-miR-361-3p,hsa-miR-513b-5p,hsa-miR-33a-5p,hsa-let-7a-5p/hsa-let-7c-5p/hsa-let-7b-5p/hsa-let-7d-5p/hsa-let-7f-5p/hsa-let-7e-5p/hsa-let-7i-5p/hsa-let-7g-5p,hsa-miR-136-3p,hsa-miR-508-5p,hsa-miR-204-5p/hsa-miR-211-5p,hsa-miR-146a-5p/hsa-miR-146b-5p,hsa-miR-23a-3p,hsa-miR-21-3p,hsa-miR-877-5p,hsa-miR-302a-5p,hsa-miR-139-5p,hsa-miR-99a-5p/hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99b-5p,hsa-miR-216a-5p和hsa-miR-3157-3p,并且优选地，一种修改的碱基序列，其中在基于5'末端的位置2至7或2至9中的序列中至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶替代，以允许在相应位点的G：A摆动配对成为规范碱基对U：A。

优选地，诱导RNA干扰的核酸具有6至8个连续碱基的序列，该序列包含从5’末端起的2至7个或2至9个碱基，由SEQ ID NO：529至863中的任何一个或多个表示(参见表4)。

此外，本发明提供了用于抑制miRNA的非规范靶基因表达的组合物，其包括诱导RNA干扰的核酸。

此外，本发明提供了抑制miRNA的非规范靶基因表达的方法，其包括将包含诱导RNA干扰的核酸的组合物施用于受试者。

此外，本发明提供了诱导RNA干扰的核酸在抑制miRNA的非规范靶基因表达中的用途。

此外，本发明提供了制备诱导RNA干扰的核酸的方法，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因的表达，该方法包括以下步骤：

构建诱导RNA干扰的核酸以具有修改的碱基序列，其中从特异性miRNA的5'末端的第二个碱基开始的6至8个连续碱基的序列中的至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶碱基替代。

在下文中，将详细描述本发明。

当miRNA与靶标mRNA结合时，即使与miRNA种子区域不完全互补，也会被识别为miRNA靶标并与mRNA结合，这称为非规范靶标识别。本发明人着眼于miRNA的非规范靶标识别，以开发通过修改miRNA的部分序列来选择性抑制miRNA的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，并阐明了其效率，从而完成了本发明。

本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因，其中

诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5’末端的2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A或G：U摆动配对)，以允许结合至在miRNA的5至6位之间靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过凸起的消失而成为连续的碱基对，或

诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中在特异性miRNA的5'末端的第1至9个碱基之间的碱基序列(尤其是基于5'末端的第2至7个碱基的序列)中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶或腺嘌呤替代，以允许在相应位点的G：A或G：U摆动配对成为规范碱基对U：A或A：U。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸可以是诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链，优选包括miRNA，小发夹RNA(shRNA)和小干扰RNA(siRNA)，DsiRNA，lsiRNA，ss-siRNA，asiRNA，piRNA或内源性小干扰RNA(endo-siRNA)。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸基于miRNA的两种非规范靶标识别。

更具体地，miRNA识别正常的靶基因以及非规范靶基因。miRNA识别的非规范靶基因不具有与miRNA完全对应的互补关系。

miRNA识别的非规范靶基因和抑制非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的方面如下。

识别miRNA结合的非规范靶基因的一种类型与miRNA的5’末端的1至5位的所有碱基具有连续的互补关系。但是，在被miRNA的5'末端的6位碱基识别的基因(与miRNA的5'末端的6位碱基配对)中，miRNA的5'末端的6位碱基识别的碱基是在以凸起形式推入紧接的连续的碱基后与miRNA具有互补关系的碱基，而不是与miRNA的5'末端的5位碱基具有互补关系的碱基直接相邻的碱基。

一方面，抑制被miRNA识别的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5’末端的2至5位的4个碱基的序列。此外，4个碱基序列中的2个连续碱基相同，并且具有与可以与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补的碱基序列，以及可以与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基包括所有互补碱基，包括G：A和G：U摆动配对。

与特异性miRNA的碱基序列相比，抑制特异性miRNA识别的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸通常包括在特异性miRNA的5’末端的2至5位的至少4个碱基的序列。

此外，诱导RNA干扰的核酸的5’末端的第6和第7个碱基可以是相同的，并且这两个碱基可以与能与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补的碱基，包括G：A和G：U摆动配对。例如，特异性miRNA的第6个碱基：可以与第6个碱基配对的碱基：与可以与第6个碱基配对的碱基互补的碱基的排列可以是(A：U，G：A，C)，(G：A，U，C：U，A，G)，(U：G，A：C，U)或(C：G：C)。例如，当特异性miRNA的第6个碱基为A时，从诱导RNA干扰的核酸的5’末端起的第6和第7个碱基的序列可以是AA或CA；当特异性miRNA的第6个碱基为G时，从诱导RNA干扰的核酸的5’末端起的第6和7个碱基的序列可以是UG，AG或GG；当特异性miRNA的第6个碱基为U时，从诱导RNA干扰的核酸的5’末端起的第6和7个碱基的序列可以是CU或UU；或当特异性miRNA的第6个碱基为C时，则从诱导RNA干扰的核酸的5’末端起的第6和7个碱基的序列可以为CC。

优选地，从诱导RNA干扰的核酸的5’末端起的第6个碱基与特异性miRNA的5'末端起的第6个碱基是相同的，并且从诱导RNA干扰的核酸的5’末端起的第7个碱基与从特异性miRNA的5'末端起的第6个碱基是相同的。

此外，诱导RNA干扰的核酸优选包括从特异性miRNA的5’末端起的第7个碱基作为从其5’末端起的第8个碱基。

在另一方面，被miRNA识别的非规范靶基因和抑制该非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸的方面如下。

在miRNA识别的非规范靶基因的情况下，除了互补配对A:U,G:C,C:G或U:A之外，miRNA的碱基和miRNA识别的靶基因还具有G：A或G：U摆动配对关系。

当miRNA和miRNA识别的靶基因处于G：A摆动关系时，特异性miRNA的碱基：特异性miRNA识别的特异性基因的碱基：抑制特异性miRNA识别的靶基因的诱导RNA干扰的核酸的碱基的排列是G：A：U。另外，当miRNA和miRNA识别的靶基因具有G：U摆动关系时，特异性miRNA的碱基：特异性miRNA识别的特异性基因的碱基：抑制特异性miRNA识别的靶基因的诱导RNA干扰的核酸的碱基的排列是G：U：A。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中从特异性miRNA的5'末端起的第1至第9个碱基的碱基序列中的一个或多个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)碱基替代。此外，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中在从特异性miRNA的5’末端起的第1至第9个碱基的序列(优选，从特异性miRNA的5’末端起的第2至7个碱基的序列)中的一个或多个鸟嘌呤(G)碱基被腺嘌呤(A)碱基替代。当从特异性miRNA的5’末端起的第1至第9个碱基的碱基序列中包含一个或多个鸟嘌呤(G)碱基时，所有包含的鸟嘌呤(G)碱基均可被尿嘧啶(U)或腺嘌呤替代(A)，并且至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)替代。当在从特异性miRNA的5’末端起的第1至第9个碱基的碱基序列(优选，从特异性miRNA的5’末端起的第2至7个碱基的碱基序列)中包含至少一个鸟嘌呤(G)时，除了被尿嘧啶或腺嘌呤替代的碱基以外的其他碱基可能与特异性miRNA的碱基相同。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸选择性地抑制miRNA的非规范靶基因，而不抑制miRNA的规范靶基因。

根据本发明的一示例性实施方案(参见图2)，调节根据本发明的诱导RNA干扰的核酸的靶基因的miRNA表达的功能对于非规范靶基因是特异性的，并且没有显示出对规范靶基因的抑制作用。

因此，当使用根据本发明的诱导RNA干扰的核酸时，仅非规范靶基因的表达可以被选择性地抑制，从而选择性地仅诱导通过诱导RNA干扰的核酸的表达抑制所期望的效果。

在本发明中，特异性miRNA可以是选自miR-124、miR-155、miR-122、miR-1、miR-133、let-7、mR-302a和miR-372中的一种或多种。

在本发明中，人miR-124、miR-155、miR-122、miR-1、miR-133、let-7、miR-302a和miR-372各自的碱基序列分别描述于在miRNA序列数据库miRBase(http://www.mirbase.org/)中的MIMAT0000422，MIMAT0000646，MIMAT0000421，MIMAT0000416，MIMAT0000427，MIMAT0000062，MIMAT0000684或MIMAT0000724。

然而，根据本发明的特异性miRNA不限于人miRNA，并且包括来源于包括哺乳动物在内的动物的miRNA。

作为根据本发明的抑制被特异性miRNA识别的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，具有从特异性miRNA的5'末端起2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列的诱导RNA干扰的核酸具有6个或更多个碱基长度的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，但是本发明不限于此。诱导RNA干扰的核酸通常具有约21至24个碱基的长度。

当特异性miRNA是miR-124时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸。诱导RNA干扰的核酸具有在miR-124的5'末端起的2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与miR-124的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基，包括G：A和G：U摆动配对。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是诱导RNA干扰的核酸(miR-124BS)，其中从5’末端起的第2至7个碱基的序列是5’-AA GGC C-3’。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有碱基序列5'-UAA GGC CAC GCG GUG AAU GCC-3'的诱导RNA干扰的核酸(miR-124BS)。

当特异性miRNA是miR-122时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有在从miR-122的5'末端起2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与miR-122的第6个碱基配对的碱基互补，包括具有G：A和G：U摆动配对的所有互补碱基。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是其中从5’末端起的第2至7个碱基的序列是5'-GGAGU U-3'的诱导RNA干扰的核酸(miR-122BS)。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有碱基序列5'-UGG AGU UGU GAC AAU GGU GUU-3'的诱导RNA干扰的核酸(miR-122BS)。

当特异性miRNA是miR-155时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸可以是抑制miR-155的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有在从miR-155的5'末端起2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与miR-155的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是其中从5’末端起的2至7位的碱基序列是5’-UAAUG G-3’的诱导RNA干扰的核酸(miR-155BS)。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有碱基序列5'-UUA AUG GC UAA U CGU GAU AGG-3'的诱导RNA干扰的核酸(miR-155BS)。

当特异性miRNA是miR-1时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸可以是抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有在从miR-1的5'末端起2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与miR-1的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是其中从5’末端起的2至7位的碱基序列是5’-GGAAU U-3’的诱导RNA干扰的核酸(miR-1BS)。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有碱基序列5'-UGG AAU UGU AAA GAA GUA UGU-3'的诱导RNA干扰的核酸(miR-1BS)。

作为根据本发明的抑制被特异性miRNA识别的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，具有修改的碱基序列(其中在特异性miRNA的5'末端起的1至9位之间的碱基序列(优选在特异性miRNA的5'末端起的第2至7个碱基的序列)中至少一个鸟嘌呤被尿嘧啶或腺嘌呤替代)的诱导RNA干扰的核酸具有6个或更多个碱基长度的序列，但是本发明不限于此。诱导RNA干扰的核酸通常可具有约21至24个碱基的长度。

当特异性miRNA是miR-124时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有经修改的碱基序列，其中在miR-124的5’末端起的1至9位的碱基序列(优选5'末端起的第2至7个碱基的序列)中，至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)替代。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是其中从5’末端起的1至9位的碱基序列是5'-UAAUGC AC-3'(miR-124-G4U)、5'-UAA GUC AC-3'(miR-124-G5U)或5'-UAA UUC AC-3'(miR-124-G4,5U)的诱导RNA干扰的核酸。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有以下的碱基序列的诱导RNA干扰的核酸：5'-UAA UGC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G4U)、5'-UAAGUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G5U)或5'-UAA UUC ACG CGG UGA AUG CCA A-3'(miR-124-G4,5U)。

当特异性miRNA是miR-1时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有修改的碱基序列，其中在miR-1的5'末端起的1至9位的碱基序列中至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)替代。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是诱导RNA干扰的核酸，其中从5’末端起的1至9位的碱基序列是5'-UUG AAU GUA-3'(miR-1-G2U)，5'-UGU AAU GUA-3'(miR-1-G3U)，5'-UGGAAU UUA-3'(miR-1-G7U)，5'-UUU AAU GUA-3'(miR-1-G2,3U)，5'-UU AAU UUA-3'(miR-1-G3,7U)，5'-UUG AAU UUA-3'(miR-1-G2,7U)或5'-UUU AAU UUA-3'(miR-1-G2,3,7U)。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有以下碱基序列的诱导RNA干扰的核酸：5'-UUG AAU GUAAAG AAU UA GUA U-3'(miR-1-G2U)，5'-UGU AAU GUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G3U)，5'-UGG AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G7U)，5'-UUU AAU GUA AAG UAGUAU GUA U-3'(miR-1-G2,3U)，5'-UGU AAU UUA AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G3,7U)，5'-UUGAAU UUA AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G2,7U)或5'-UUU AAU UUA AAG AAG UAU GUA U-3'(miR-1-G2,3,7U)。

当特异性miRNA是miR-122时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有修改的碱基序列，其中在miR-122的5’末端起的1至9位的碱基序列(优选5’末端起的第2至7个碱基的序列)中，至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)替代。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是诱导RNA干扰的核酸，其中从5’末端起的1至9位的碱基序列是5'-UUG AGU GUG-3'(miR-122-G2U)，5'-UGG AGU GUG-3'(miR-122-G3U)，5'-UGG AUU GUG-3'(miR-122-G5U)，5'-UGG AGU UUG-3'(miR-122-G7U)，5'-UGG AGU GUU-3'(miR-122-G9U)，5'-UUU AGU GUG-3'(miR-122-G2,3U)，5'-UUG AGU GUG-3'(miR-122-G2,5U)，5'-UUG AGU UUG-3'(miR-122-G2,7U)，5'-UUG AGU GUU-3'(miR-122-G2,9U)，5'-UGUAUU GUG(miR-122-G3,5U)，5'-UGU AGU UUG-3'(miR-122-G3,7U)，5'-UGU AGU GUU-3'(miR-122-G3,9U)，5'-UGG AUU UUG-3'(miR-122-G5,7U)，5'-UGG AUU GUU-3'(miR-122-G5,9U)或5'-UGG AGU UUU-3(miR-122-G7,9U)。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有以下碱基序列的诱导RNA干扰的核酸：5'-UUG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G2U)，5'-UGU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G3U)，5'-UGG AUU GUG ACA AUG GUGUUU G-3'(miR-122-G5U)，5'-UGG AGU UUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G7U)，5'-UGGAGU GUA ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G9U)，5'-UUU AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G2,3U)，5'-UUG AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G2,5U)，5'-UUG AUUGUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G2,7U)，5'-UUG AGU GUA ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G2,9U)，5'-UGU AUU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G3,5U)，5'-UGU AGUUUG ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G3,7U)，5'-UGU AGU GUU ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G3,9U)，5'-UGG AUU UUG ACA AUG GUG UU U G-3'(miR-122-G5,7U)，5'-UGGAUU GUU ACA AUG GUG UUU G-3'(miR-122-G5,9U)或5'-UGG AGU UUU ACA AUG GUG UUUG-3'(miR-122-G7,9U)。

当特异性miRNA是miR-133时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-133的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有修改的碱基序列，其中在miR-133的5’末端起的1至9位的碱基序列(优选5’末端起的第2至7个碱基的序列)中，至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)替代。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是其中从5’末端起的1至9位的碱基序列是5'-UUUUGU CCC-3'(miR-133-G4U)、5'-UUU GUU CCC-3'(miR-133-G5U)或5'-UUU UUU CCC-3'(miR-133-G4,5U)的诱导RNA干扰的核酸。更优选地，诱导RNA干扰的核酸可以是具有以下碱基序列的诱导RNA干扰的核酸：5'-UUU UGU CCC CUU CAA CCA GCU G-3'(miR-133-G4U)，5'-UUU GUU CCC CUU CAA CCA GCU G-3'(miR-133-G5U)或5'-UUU UUU CCC CUU CAA CCAGCU G-3'(miR-133-G4,5U)。

当特异性miRNA为let-7时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制let-7的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有修改的碱基序列，其中在let-7的5’末端起的1至9位的碱基序列(优选5’末端起的第2至7个碱基的序列)中，至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)替代。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是诱导RNA干扰的核酸，其中从5’末端起的1至9位的碱基序列是5'-UUA GGU AGU-3'(let-7-G2U)，5'-UGA UGU AGU-3'(let-7-G4U)，5'-UGAGUU AGU-3'(let-7-G5U)，5'-UGA GGU AUU-3'(let-7-G8U)，5'-UUA UGU AGU-3'(let-7-G2,4U)，5'-UUA GUU AGU-3'(let-7-G2,5U)，5'-UUA GGU AUU-3'(let-7-G2,8U)，5'-UGAUUU AGU-3'(let-7-G4,5U)，5'-UGA UGU AUU-3'(let-7-G4,8U)或5'-UGA GUU AUU-3'(let-7-G5,8U)。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有以下碱基序列的诱导RNA干扰的核酸：5'-UUA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G2U)，5'-UGA UGU AGU AGG UUG UAUAGU U-3'(let-7-G4U)，5'-UGA GUU AGU UGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G5U)，5'-UGA GGUAUU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G8U)，5'-UUA UGU AGU UGU AGU U-3'(let-7-G2,4U)，5'-UUA GUU AGU UGU UGU AGU U-3'(let-7-G2,5U)，5'-UUA GGU AUU AGG UUG UAU AGUU-3'(let-7-G2,8U)，5'-UGA UUU AGU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G4,5U)，5'-UGA UGUAUU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G4,8U)或5'-UGA UGU AUU AGG UUG UAU AGU U-3'(let-7-G5,8U)。

当特异性miRNA是miR-302a时，本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-302a的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有修改的碱基序列，其中在miR-302a的5’末端起的1至9位的碱基序列(优选5’末端起的第2至7个碱基的序列)中，至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)替代。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是诱导RNA干扰的核酸，其中从5’末端起的1至9位的碱基序列是5'-UAA UUG CUU-3'(miR-302a-G4U)、5'-UAA GUU CUU-3'(miR-302a-G6U)或5'-UAA UUU CUU-3'(miR-302a-G4,6U)。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是具有以下碱基序列的诱导RNA干扰的核酸：5'-UAA UUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3'(miR-302a-G4U)，5'-UAA GUU CUU CCA UGU UUU GGU GA-3'(miR-302a-G6U)或5'-UAA UUU CUU CCA UGU UUUGGU GA-3'(miR-302a-G4,6U)。

当特异性miRNA是miR-372时，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-372的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有修改的碱基序列，其中在miR-372的5’末端起的1至9位的碱基序列(优选5’末端起的第2至7个碱基的序列)中，至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)替代。

例如，诱导RNA干扰的核酸可以是诱导RNA干扰的核酸，其中从5’末端起的1至9位的碱基序列是5'-AAA UUG CUG-3'(miR-372-G4U)，5'-AAA GUU CUG-3'(miR-372-G6U)，5'-AAA GUG CUU-3'(miR-372-G9U)，5'-AAA UUU CUG-3'(miR-372-G4,6U)，5'-AAA UUG CUU-3'(miR-372-G4,9U)或5'-AAA GUU CUU-3'(miR-372-G6,9U)。更优选地，诱导RNA干扰的核酸是抑制miR-372的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，其具有以下碱基序列：5'-AAAUUG CUG CGA CAU UUG AGC GU-3'(miR-372-G4U)，5'-AAA GUU CUG CGA CAU UUG AGC GU-3'(miR-372-G6U)，5'-AAA GUU CUG CGA CUG UUG AGC GU-3'(miR-372-G9U)，5'-AAA UUUCUG CGA CAU UUG AGC GU-3'(miR-372-G4,6U)，5'-AAA UUGU CUG CGA CAU CAU UUG AGCGU-3'(miR-372-G4,9U)或5'-AAA GUU CUU CGA CAU UUG AGC GU-3'(miR-372-G6,9U)。

此外，本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因，

诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5’末端起的2至5位的4个碱基以及在6位和7位的碱基的序列，所述在6位和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，以允许结合至在miRNA的5至6位之间靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过所述凸起的消失而成为连续的碱基对，并且

特异性miRNA的特征是，将甲基(2'OMe)添加至从5'末端起的第6个核苷酸的核糖基环的2'位置。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5'末端起的2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括包含G：A和G：U摆动配对的所有互补的碱基，并且当将甲基(2'OMe)添加到特异性miRNA的5’末端起的第6个核苷酸的核糖基环的2'位置时，除此以外，对碱基序列的其余部分没有限制，并且可以包括任何碱基序列。在此，诱导RNA干扰的核酸可以包括6至24个碱基，优选地6至15个碱基，并且更优选地6至8个碱基的序列，但是对核酸的长度没有特别限制。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸包括通过在特异性miRNA的5'末端的第6个核苷酸的核糖基环的2'位置添加甲基(2'OMe)而进行化学修改的碱基序列，其中发生2'OMe修改的诱导RNA干扰的核酸可以选择性地仅抑制其规范种子靶基因的表达，而不抑制非规范种子靶基因的表达。因此，其中发生2'OMe修改的诱导RNA干扰的核酸可以维持本发明的目的，即仅特异性地抑制特异性miRNA的非规范成核凸起位点，并且可以具有完全去除新生成的非规范成核凸起位点的作用。

在根据本发明的诱导RNA干扰的核酸中，对可以添加甲基(2'OMe)的miRNA的类型没有限制，只要能够将2'OMe添加到从5’末端起的第6个核苷酸的核糖基环的2'位置即可。然而，根据本发明的一示例性实施方案，可以添加2'OMe的miRNA可以是miR-124或miR-1。

此外，本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因，其中

诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5’末端起的2至5位的4个碱基以及在6位和7位的碱基的序列，所述在6位和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，以允许结合至在miRNA的5至6位之间靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过凸起的消失而成为连续的碱基对。

只要根据本发明的诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5'末端起的2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基具有相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补的碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，它可以具有任何碱基序列，而对除上述特征之外的剩余碱基序列没有限制。在此，诱导RNA干扰的核酸可以包含6至24个碱基，优选6至15个碱基，更优选6至8个碱基的序列，但是对核酸的长度没有特别限制。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5'末端起的2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并且与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括包含G：A和G：U摆动配对的所有互补的碱基，以结合至在miRNA的5至6位之间靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过凸起的消失而成为连续的碱基对，从而选择性地仅抑制非规范的成核凸起位点，而不抑制miRNA的规范靶基因。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸可以具有由SEQ ID NO：103至528中的任何一个或多个表示的碱基序列(参见表3)。

此外，本发明提供了诱导RNA干扰的核酸，其通过修改根据本发明的诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中的特异性miRNA的部分序列而仅抑制miRNA的非规范靶基因的表达，其中

诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中在特异性miRNA的5’末端起的第2至9个碱基之间的序列或者在从5’末端起的2至7位的序列中，至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶碱基替代，以允许在相应位点的G：A摆动配对成为规范碱基对U：A。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸在从特异性miRNA的5'末端起的第2至第9个碱基之间的序列或在从5'末端起第2至7个碱基之间的序列中可以具有至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶碱基替代，并且只要其具有修改的碱基序列，其中从特异性miRNA的5'末端起第2至9个碱基之间的至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶碱基替代，诱导RNA干扰的核酸可以具有任何碱基序列，而除了上述特征之外，对该序列的其余部分没有限制。在此，在根据本发明的诱导RNA干扰的核酸中，除了从特异性miRNA的5'末端起的第2至第9个碱基之间的序列或从5’末端起的第2至第7个碱基之间的序列中被尿嘧啶(U)碱基替代的碱基以外的所有碱基可以与特异性miRNA的碱基相同。

作为根据本发明的抑制被特异性miRNA识别的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸，具有修改的碱基序列(其中在特异性miRNA的5’末端起的第2至9个碱基之间的碱基序列中，或从5’末端起的2至7位的序列中，至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶碱基替代)的诱导RNA干扰的核酸可具有6至24个碱基，优选6至15个碱基，更优选6至8个碱基的序列，但是对核酸的长度没有特别限制，只要它是具有修改的碱基序列(其中从在特异性miRNA的5’末端起的第2个碱基开始的6至8个连续碱基的序列中，至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶碱基替代)的诱导RNA干扰的核酸即可。在此，只要诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中在从特异性miRNA的5’末端起的第2个碱基开始的6至8个连续碱基的序列中至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶碱基替代，除了上述特征之外，对碱基序列的剩余部分没有限制，并且可以包括任何碱基序列。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸具有修改的碱基序列，其中在从5’末端起的第2个碱基开始的6至8个连续碱基的序列中至少一个鸟嘌呤(G)碱基被尿嘧啶(U)碱基替代，以允许在相应位点的G：A摆动配对成为规范碱基对U：A，从而选择性地仅抑制作为G：A摆动配对结合的miRNA的非规范靶基因，并且不抑制miRNA的规范靶基因。

根据本发明的诱导RNA干扰的核酸可以包括由SEQ ID NO：529至863中的任何一个或多个表示的碱基序列(参见表4)。

当使用根据本发明的上述诱导RNA干扰的核酸时，可以特异性地抑制miRNA的非规范靶基因。

因此，本发明提供了用于抑制miRNA的非规范靶基因表达的组合物，其包括诱导RNA干扰的核酸，或提供了用于抑制miRNA的非规范靶基因表达的试剂盒，其包括诱导RNA干扰的核酸。

此外，当使用根据本发明的上述诱导RNA干扰的核酸时，通过特异性地抑制miRNA的非规范靶基因来抑制miRNA的非规范靶基因的表达而引起的作用可以被选择性地调节。

更具体地，当使用根据本发明的诱导RNA干扰的核酸时，miRNA的非规范靶基因被特异性抑制，因此由miRNA的非规范靶基因的表达引起的作用(例如细胞周期，分化，去分化，形态，迁移，分裂，增殖或死亡)可以通过使用上述根据本发明的诱导RNA干扰的核酸来特异性地调节。

因此，本发明提供了用于调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、分裂、增殖或死亡的组合物或试剂盒，其包括诱导RNA干扰的核酸。

本文所用的“细胞周期”是生长、分裂和再次生长细胞的连续过程，是指细胞反复经历M期(有丝分裂)、G1期(第一分裂准备期)、S期(DNA合成期)和G2期(第二分裂准备期)的四个期。G1期是在从紧接细胞分裂后到DNA合成开始之间的用于DNA合成的准备期，G2期是在从DNA合成终止到细胞分裂开始之间的用于细胞分裂的准备期。

在本文使用的“调节细胞周期”包括诱导四个期之间的细胞转变，或者促进或阻止该转变，例如，诱导处于G2/M期的细胞转变为G1/G2期。

本文所使用的“细胞分化”是细胞获得形态学和功能特异性的过程，其中细胞的大小或形状、膜电位、代谢活性以及通过分化对信号的响应发生变化。

本文所使用的“调节细胞分化”是指增殖或细胞分化速率的延迟，诱导开始分化或抑制不开始分化，并且例如包括诱导神经细胞分化以获得形态学特异性(例如，神经突分化)。此外，例如，作为调节细胞分化的实例，可以包括诱导肌细胞分化以获得形态学特异性(例如，肌细胞纤维化)。

本文所使用的“去分化”是指这样的现象，其中分化逆转或完全分化的细胞在分化前的未分化期中获得多能性并且然后像中间期中的细胞一样变化。

本文所使用的“调节去分化”包括诱导或促进细胞去分化，或抑制或延迟去分化进程，并且调节去分化的结果可以通过确认例如细胞生长的形成(例如，形成群体等)、去分化因子(Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4)的活性等来确定。

本文所使用的“细胞形态”是指包括细胞形状，结构，大小等的表型特征，并且根据生物体的类型以及甚至在同一生物体中的组织或器官的类型而变化。

本文所使用的“调节细胞形态”是指表型特征的变化，包括细胞的形状、结构和大小，并且包括促进、延迟、诱导或抑制细胞形态的自然变化以及促进或诱导细胞形态的非自然变化。例如，心肌细胞的心肌肥大的诱导可以被包括作为调节细胞形态的实例。

本文所使用的“细胞迁移”是指细胞的迁移，这是动物生长和生理活动的重要过程，细胞通常对给定的刺激做出快速反应，并且通常以非集体形状迁移，而其他类型的细胞只能在特异性的生长期或特殊情况下迁移。细胞迁移主要发生在神经和血管的发育或上皮组织的伤口愈合期间，并且细胞群体的迁移有助于各种类型肿瘤的转移。

本文所使用的“调节细胞迁移”是指细胞迁移的延迟，促进，诱导或抑制(阻止)。

本文所使用的“细胞分裂和增殖”是将亲本细胞分成两个子细胞以增加细胞数的过程。

本文所使用的“调节细胞分裂和增殖”包括细胞分裂和增殖的延迟，促进，抑制或诱导。当细胞在细胞周期中被诱导为M期(有丝分裂)时，可包括细胞分裂和增殖。例如，分布在G0/G1期中的细胞数量的增加和分布在G2/M期中的细胞数量的减少可以是调节细胞分裂和增殖的实例。

本文所使用的“凋亡”是指由于遗传特性导致死亡同时细胞维持其功能作用的阶段，并且包括早期凋亡和晚期凋亡。根据细胞凋亡，由于整个细胞的萎缩，新蛋白被合成，通过细胞的自杀基因导致死亡。

本文所使用的“调节凋亡”包括凋亡的诱导，延迟，促进或抑制。

更具体地，本发明提供了：用于诱导癌细胞死亡的组合物，其包括抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-124BS)；

用于诱导神经突分化的组合物，其包括抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-124BS)；

用于诱导肝癌细胞的细胞周期停滞的组合物，其包含抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-122BS)；

用于促进肌细胞分化或肌纤维化的组合物，其包含抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-1BS)；

用于诱导肌细胞死亡的组合物，其包含抑制miR-155的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-155BS)；

用于诱导神经母细胞瘤的细胞死亡的组合物，其包含抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-124-G5U)；

用于促进神经母细胞瘤的细胞分裂或增殖的组合物，其包含抑制miR-124的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-124-G4U)；

用于诱导心肌肥大的组合物，其包含抑制miR-1的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-1-G2U，miR-1-G3U或miR-1-G7U)；

用于诱导心肌肥大的组合物，其包含抑制miR-133的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-133-G4U)；

用于诱导癌细胞的细胞周期停滞的组合物，其包含抑制let-7的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选let-7-G2U，let-7-G2,4U)；

用于诱导肝细胞的细胞周期进展活性的组合物，其包含抑制let-7的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选let-7-G4U)；

用于促进去分化的组合物，其包含抑制miR-302a的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-302a-G4U)；

用于促进去分化的组合物，其包含抑制miR-372的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-372-G4U)；或

用于抑制肝癌细胞的细胞迁移的组合物，其包含抑制miR-122的非规范靶基因的诱导RNA干扰的核酸(优选miR-122-G2U或miR-122-G2,3U)。

此外，当使用根据本发明的诱导RNA干扰的核酸时，可以通过特异性地抑制miRNA的非规范靶基因来选择性地调节miRNA的非规范靶基因的作用，因此可以应用于各种领域(例如，药品，化妆品，细胞学等)。

此外，根据本发明的诱导RNA干扰的核酸可以用于筛选用于调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、分裂、增殖或凋亡的测试材料的方法。

更具体地，本发明提供了筛选用于调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、分裂、增殖或凋亡的测试材料的方法，包括：

将根据本发明的诱导RNA干扰的核酸转染到靶细胞中；

用测试材料处理靶细胞；和

检查在靶细胞中被诱导RNA干扰的核酸抑制的miRNA的非规范靶基因的表达水平或表达。

在本发明中，靶细胞来源于包括人在内的哺乳动物而不受限制，并且从中提取靶细胞的组织或细胞的类型不受限制。靶细胞可以包括例如神经细胞，心肌细胞，癌细胞和肌细胞。

在本发明中，可以根据本领域已知的各种方法适当地将诱导RNA干扰的核酸引入靶细胞，例如，可以通过本领域普通技术人员众所周知的方法进行诱导，例如，使用磷酸钙的转染(Graham,FL等人,Virology,52:456(1973))，通过DEAE糊精的转染，通过显微注射的转染(Capecchi,MR,Cell,22:479(1980))，通过阳离子脂质的转染(Wong,TK等人,Gene,10:87(1980))，电穿孔(Neumann E等人,EMBO J,1:841(1982))，转导或转染(如文献(Basicmethods in molecular biology,Davis等人,1986和Molecular cloning:A laboratorymanual,Davis等人,1986)所描述)进行诱导。引入优选通过转染进行。转染效率可能会根据细胞类型以及细胞培养条件或转染试剂而有很大差异。

在本发明中，测试材料是指用于筛选以检查细胞周期、分化、去分化、形态、分裂、增殖或凋亡是否通过调节miRNA的非规范靶基因的表达而受到影响的未知材料，并且包括化合物，提取物，蛋白质或核酸，但是本发明不限于此。

在本发明中，miRNA的非规范靶基因的表达水平或表达可以通过各种表达分析方法来证实，表达分析方法为例如RT-PCR，ELISA(参见Sambrook,J等人,Molecular CloningA Laboratory Manual,3rd ed Cold Spring Harbor Press(2001))，蛋白质印迹或FACS分析，但本发明不限于此。

证实了本发明中miRNA的非规范靶基因的表达水平或表达，并且与仅用诱导RNA干扰的核酸进行处理而不使用测试材料的情况进行比较的结果是，当存在差异时，可以确定该测试材料影响miRNA的非规范靶基因的表达。进一步地，可以确定测试材料具有调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、分裂、增殖或凋亡的功能。

此外，本发明提供了制备上述诱导RNA干扰的核酸的方法。

更具体地说，本发明提供了制备诱导RNA干扰的核酸的方法，该诱导RNA干扰的核酸通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因，该方法包括以下步骤：

构建诱导RNA干扰的核酸，使其具有在特异性miRNA的5’末端起的2至5位的4个碱基和在6位和7位的碱基的序列，在6位和7位的碱基相同并与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括包含G：A和G：U摆动配对的所有互补碱基，或

构建诱导RNA干扰的核酸，其具有修改的碱基序列，其中在特异性miRNA的5’末端起的第1至9个碱基之间的碱基序列中至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶或腺嘌呤替代。

此外，本发明提供了制备诱导RNA干扰的核酸的方法，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因的表达，该方法包括以下步骤：

构建诱导RNA干扰的核酸，诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5’末端起的2至5位的4个碱基和在6和7位的碱基的序列，在6和7位的碱基相同并与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，以允许结合至在miRNA的5至6位之间靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过所述凸起的消失而成为连续的碱基对；和

将甲基(2'OMe)添加至在特异性miRNA的5’末端起第6个核苷酸的核糖基环的2'位置。

此外，本发明提供了制备诱导RNA干扰的核酸的方法，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因的表达，该方法包括以下步骤：

构建诱导RNA干扰的核酸，诱导RNA干扰的核酸具有在特异性miRNA的5’末端起的2至5位的4个碱基和在6和7位的碱基的序列，在6和7位的碱基相同并与能够与特异性miRNA的第6个碱基配对的碱基互补，包括所有互补碱基(包括G：A和G：U摆动配对)，以允许结合至在miRNA的5至6位之间靶基因中产生的凸起的非规范靶碱基对通过所述凸起的消失而成为连续的碱基对。

此外，本发明提供了制备诱导RNA干扰的核酸的方法，其通过修改诱导RNA干扰的核酸双链的一条或多条单链中特异性miRNA的部分序列来抑制miRNA的非规范靶基因的表达，该方法包括以下步骤：

构建诱导RNA干扰的核酸，使其具有修改的碱基序列，其中在从特异性miRNA的5'末端的第二个碱基开始的6-8个连续碱基的序列中至少一个鸟嘌呤碱基被尿嘧啶碱基替代。

已经描述了诱导RNA干扰的核酸，因此为了避免重复，将省略描述。

诱导RNA干扰的核酸的构建根据本领域已知的各种方法进行，并且方法不限于特定方法。

此外，本发明提供了诱导干扰的核酸，其通过将甲基(2'OME)添加到从特异性miRNA的5'末端起的第6个核苷酸的核糖基的2'位而被修改。

修改的诱导干扰的核酸保持了本发明的目的，即仅特异性地抑制相应miRNA的非规范成核凸起位点，并且具有完全去除可能新出现的非规范成核凸起结合的作用。

[有益效果]

当使用根据本发明的诱导干扰的核酸时，可以有效地改善通过抑制常规miRNA的非规范靶基因而表现出的生物学功能，或者可以选择性地表现出常规miRNA的一部分功能，即仅通过抑制非规范靶基因而表现出的生物学功能。此外，可以通过诱导干扰的核酸来调节细胞周期、分化、去分化、形态、迁移、增殖或凋亡，因此有望用于各种领域，例如药物、化妆品等。

附图说明

图1示出了诱导干扰的核酸抑制miRNA的非规范靶标的作用机理。

图2A至2C通过使用荧光素酶报告基因酶测量miR-124的规范靶标(种子)和非规范成核凸起靶标的靶基因的抑制，示出了miR-124-BS的非规范靶标特异性表达抑制作用。

图3A和3B示出了对miR-124-BS进行荧光激活细胞分选(FACS)的结果，以证实在宫颈癌细胞(HeLa)中miR-124的常规靶标(种子)和非规范成核凸起靶标诱导的凋亡。

图4A和4B示出了通过在人神经肿瘤母细胞瘤(Sh-Sy-5y)中表达miR-124-BS来观察细胞形态和标志物表达模式的结果，证实了由miR-124的非规范成核凸起靶标诱导的神经突分化。

图5A和5B示出了观察细胞形态和分子生物学特征的结果，证实了由miR-124-BS(4753)诱导的神经突分支分化，miR-124-BS(4753)是调节miR-124与常规靶标(种子)的成核凸起的miR-124-BS和具有与miR-124相同的种子序列的miR-124-(3714)的自然形式。

图6A至图6C示出了观察细胞形态和分子生物学特征的结果，证实了由在小鼠神经母细胞瘤(N2a)中miR-124的非规范成核凸起靶标诱导的神经突分支分化是由MAPRE1基因的表达调节引起的机制。

图7A至7C示出了RNA-Seq分析结果，该结果在转录组水平上证实了抑制在小鼠神经母细胞瘤(N2a)中miR-124-BS诱导的非规范成核凸起靶基因的表达。

图8A至8C示出了使用miR-122-BS和流式细胞术观察在人肝癌细胞系(HepG2)中由miR-122的非规范成核凸起靶标诱导的细胞周期停滞的结果。

图9A至9E示出了miR-1-BS和miR-155-BS的细胞形态和分子生物学特征以及流式细胞术检测结果，证实了由miR-1的非规范成核凸起靶标诱导的肌细胞厚度的增加，以及由肌细胞系中miR-155的非规范成核凸起靶标诱导的肌细胞分化的抑制和凋亡的诱导。

图10A至图10D示出了Ago HITS-CLIP的生物信息学分析结果，该结果是与Argonaute蛋白结合的miRNA和人脑组织中靶标的RNA数据，证实了自然存在规范的种子靶标和非规范的G：A摆动的种子靶标。

图11A至11D示出了观察miR-124-G4U和miR-124-G5U凋亡的细胞形态和流式细胞术检测结果，证实了在小鼠神经母细胞瘤(N2a)中非规范的4G：A摆动种子靶标和非规范的5G：A摆动种子靶标与miR-124在脑细胞分化中的功能完全不同。

图12A和12B示出了分析miR-124-G4U和miR-124-G5U的细胞增殖和细胞周期的流式细胞术(荧光激活细胞分选：FACS)检测结果，确认了抑制在人神经母细胞瘤(SH-sy-5y)中miR-124的非规范4G：A摆动种子靶标和非规范5G：A摆动种子靶标的生物学功能。

图13A至图13D示出了利用荧光蛋白报告基因的心肌细胞系(h9c2)的流式细胞术(荧光激活细胞分选；FACS)结果，证实了miR-1的非规范7G：A摆动种子靶标具有基因-抑制功能。

图14A至14C示出了在大鼠新生心肌细胞中表达miR-1-G2U、miR-1-G3U和miR-1-G7U后观察心肌肥大诱导作用的细胞形态和分子生物学特征的结果，证实了miR-1的非规范的2G：A，3G：A和7G：A摆动种子靶标的功能。

图15A和15B示出了在心肌细胞(h9c2)中表达miR-133-G4U后观察诱导心肌肥大作用的细胞形态特征的结果，确认了miR-133的非规范4G：A的摆动种子靶标的功能。

图16A至图16B示出了测量人肝癌细胞系(HepG2)中的荧光素酶报告基因的酶活性的结果，证实了基因表达被miR-122的非规范2G：A和3G：A摆动种子靶标抑制了。

图17A至图17D示出了观察miR-122-G2U和miR-122-G2,3,U的表达的细胞形态特征的结果，证实了以下功能：其中抑制非规范2G：A摆动种子靶标和非规范的2,3G：A摆动种子靶标的表达抑制了miR-122在人肝癌细胞系(HepG2)中的迁移。

图18A和18B示出了miR-122-G2,3U表达的流式细胞术检测结果，证实了miR-122对非规范2,3G：A摆动种子靶标表达的抑制诱导了人肝癌细胞系(HepG2)的细胞周期停滞。

图19A和19B示出了miR-122-G2,3U和miR-122-G2,7U表达的流式细胞术结果，证实了miR-122对非规范的2,3G：A摆动种子靶标和非规范2,7G：A摆动种子靶标表达的抑制诱导了人肝癌细胞系(HepG2)的细胞周期停滞。

图20A和20B示出了let-7a-G2U、let-7a-G2,4U和let-7-G4U表达的流式细胞术检测结果，证实了let-7对非规范2G：A和2,4G：A摆动种子靶标表达的抑制诱导了人肝癌细胞系(HepG2)的细胞周期停滞，而非规范4G：A摆动种子靶标表达的抑制则促进细胞周期。

图21A到21C示出了，利用Oct4基因表达报告基因证实了，miR-372-G4U或miR-302a-G4U诱导miR-372或miR-302a抑制非规范4G：A摆动种子靶标的表达，促进了利用miR-372或miR-302a的去分化。

图22A和22B示出了证实以下现象的结果：其中，从5’末端起的6位的2’OMe修改不会抑制相应的RNA干扰衍生物的非规范成核凸起靶标。

图23A和23B示出了证实从5’末端起的6位的2’OMe修改不会抑制转录组中总的非规范成核凸起靶mRNA的结果。

图24A和24B示出了通过Ago HITS CLIP实验分析与非规范成核凸起位点结合的miRNA的结果。

图25A至25F示出了通过分析癌症患者的miRNA测序数据库(TCGA)中的序列变异来鉴定识别非规范GA摆动种子靶标为肿瘤miRNA中的规范靶标的G到U修改的结果。

具体实施方案

[发明的方式]

在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。仅提供以下实施例以举例说明本发明，并且本发明不限于以下实施例。

[实施例1]诱导干扰的核酸抑制miRNA的非规范靶标的作用机理

通过Ago HITS CLIP分析，发明人从Argonaute蛋白结合RNA复合序列中证实，当miRNA与Argonaute蛋白中的靶位点碱基配对时，miRNA与靶信使RNA(mRNA)结合而不与miRNA种子进行完全互补配对，也不与具有与miRNA种子完全互补配对的规范种子靶标进行完全互补配对。此外，通过对具有上述特征的RNA进行测序的结果，证实了存在有通过miRNA的第6个碱基(miRNA的非规范成核凸起靶位点)诱导向靶标成核凸起的靶碱基配对和允许在miRNA种子区域中的G：A摆动配对的靶位点(miRNA的非规范G：A摆动种子靶位点)，这是自然发生的(图1)。

如图1所示，miR-124与靶位点的碱基序列具有至少6个连续的互补碱基配对，所述靶位点的碱基序列是5'-GUGCCUUA-3'，其通过Argonaute蛋白与种子碱基序列(5'-UAAGGCAC-3')配对，并且具有这种碱基配对的靶位点已被报道为miRNA的规范种子靶位点(canonical seed site)(Nature,2009,460(7254):479-86)。

此外，在与Argonaute结合的RNA复合物中，鉴定了靶标，其中miR-124种子碱基序列(5'-UAAGGCAC-3')与miRNA的非规范成核凸起靶位点(5'-GUGGCCUU-3')互补碱基配对，以允许miR-124的5’末端的5和6位的靶mRNA的G呈凸起排列，并且基于此，能够与miRNA的非规范成核凸起靶位点互补碱基配对的miR-124的种子碱基序列具有碱基序列(5-UAAGGCCA-3)，其中第6个碱基在miR-124种子的6至7位之间再次重复一次。相对于上述序列的连续且完全互补的序列用作抑制miR-124的非规范成核凸起靶标的miR-124BS(BS：凸起位点(bulge site))siRNA。

当分析了与Argonaute结合的RNA复合物中与miRNA结合的靶mRNA序列时，除了常规的互补碱基序列以外，已经证实在靶mRNA与miRNA的种子序列的结合中发生了G：A摆动碱基配对。因此，在miR-124的情况下，从种子碱基序列(5'-UAAGGCAC-3')5’末端起的第4个G碱基形成G：A摆动配对，从而识别出miRNA(5'-UGGCAUU-3')的非规范的G：A摆动种子靶位点。在此基础上，siRNA被设计成具有与miR-124的非规范G：A摆动种子靶位点连续且完全互补的序列，从而发明了miR-124-GU，并将siRNA用作抑制miR-124的非规范G：A摆动种子靶标RNA的表达的siRNA。

[实施例2]确认其中在种子区域中包含非规范成核凸起靶位点和连续且完全互补的碱基序列的miRNA-BS的抑制能力

在天然miR-124的规范种子靶位点中，与miR-124的5’末端第2至7个碱基互补的序列为5'-GUGCCUU-3'，规范的种子靶位点构建了至少6个连续碱基与miR-124的种子(5'-UAAGGCAC-3')的完全互补碱基配对(图2A)。

通过Ago HITS CLIP分析发现的miR-124的非规范成核凸起靶位点(Nuc位点；成核凸起位点)为5'-GUGGCCUU-3'，miR-124的第6个碱基(C)通过形成成核凸起来与靶标进行碱基配对，因此，从miR-124的5’末端起在5和6位之间配对的靶RNA的G形成了凸起。基于此，使用与非规范成核凸起靶位点(成核凸起位点)(5'-UAAGGCCA-3')具有连续且完全互补结合的碱基序列作为miRNA种子来设计siRNA，并将其命名为miR-124-BS siRNA(图2A)。认为miR-124-BS将miR-124的非规范靶标(即成核凸起的靶标位点(Nuc位点))识别为规范的种子靶标，并且尤其更强烈地抑制了非规范靶标的基因表达，其通过荧光素酶报告基因测定法得到证实(图2B和2C)。

首先，为了确认与常规的规范靶标(即种子靶标)相比多少miR-124可以抑制非规范靶标(即成核凸起的靶标位点)，将miR-124的相应位点插入荧光素酶报告基因中，还将各种浓度(0、0.01、0.1、0.5、2.5和15nM)的miR-124转染到细胞中，然后测量具有荧光素酶活性的半数抑制浓度(IC

通过将相应的miR-124靶位点的序列连续两次克隆到psi-check2载体(Promega)的海肾荧光素酶基因(3'非翻译区(3'UTR))位点中来进行荧光素酶报告基因检测。非规范凸起位点的序列使用MINK1的3'UTR位点中自然发生的非规范成核凸起靶位点。将作为人源序列的miR-124制备为引导链和过客链的双链体，由Bioneer根据miRBase数据库化学合成，并按照制造商提供的方法通过HPLC分离。按照制造商的实验规程，使用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)将miR-124和荧光素酶报告载体共转染到大约10000个宫颈癌细胞(HeLa：ATCC CCL-2)中。将HeLa细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen)中进行孵育，并在转染过程中将细胞在无抗生素的完全培养基中进行孵育。转染后24小时，根据制造商的实验规程，使用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)测量荧光素酶活性，此处，使用Glomax光度计(Promega)将海肾荧光素酶活性的测定重复至少三次，并通过萤火虫荧光素酶活性标准化计算。

为了确认仅特异性抑制miR-124的非规范成核凸起靶标的所发明的miR-124-BS的功能，以与上述相同的方式用荧光素酶报告基因进行了实验。结果，对于miR-124的规范种子靶标，miR-124-BS在任何浓度(0至10nM)下均不抑制荧光素酶报告基因酶活性，但是证实了对于miR-124的非规范成核凸起靶标报告基因，其在0.1nM或更高的浓度下抑制荧光素酶报告基因酶活性的效果(图2C)。在此，通过IC

在该实施例中，发明人发明了miRNA-BS，该miRNA-BS相对于相应的位点序列具有连续且完全互补的种子位点序列，以便仅抑制miRNA的非规范组织靶标，并且当使用miR-124进行荧光素酶报告基因测定以验证miRNA-BS的作用时，可以证明miR-124-BS不会抑制规范种子靶标的表达，并且能够有效地抑制非规范凸起靶标的表达。

[实施例3]观察通过抑制miR-124的非规范成核凸起靶标的表达来诱导宫颈癌细胞凋亡

在上述实施例中确认miR-124-BS仅抑制了被miR-124抑制的多个靶标中的非规范凸起靶标后，通过此方法，旨在确认是否仅miR-124的特异性功能可以展现出。由于仅在神经细胞中特异性表达，因此已知miR-124主要起与神经细胞有关的作用。但是，在肿瘤产生的神经胶质瘤中miR-124的表达降低，就此而言，在肿瘤细胞中人为诱导miR-124的表达时，观察到可能发生肿瘤细胞的凋亡。因此，为了确认miR-124的各种功能是否根据靶标的类型而变化，将miR-124-BS转染到宫颈癌细胞(HeLa)中，并通过流式细胞术观察细胞的凋亡(图3A)。

根据制造商的实验规程进行实验：使用RNAiMAX试剂(Invitrogen)将75nM的miR-124或miR-124-BS双链体转染到宫颈癌细胞(HeLa：ATCC CCL-2)中，并在转染后用胰蛋白酶处理细胞72小时，从培养皿中分离细胞，并根据制造商提供的方法使用Annexin V：FITC细胞凋亡检测试剂盒II(BD Pharmingen)处理细胞以检测膜联蛋白V凋亡，以及使用碘化丙啶(PI)处理细胞并通过BD Aria I(BD Biosciences)检测细胞坏死(necrosis)。在此，作为对照，合成了与cel-miR-67(其为秀丽隐杆线虫(C.elegans)miRNA)的序列相同的序列。

比较对照、miR-124表达和miR-124-BS表达的这些实验结果，当表达miR-124时，观察到在宫颈癌(HeLa)细胞中，与对照相比，凋亡引起的进展性细胞死亡的比率(用膜联蛋白V染色的细胞数)从约30％增加到约78％，并且证实miR-124-BS表达也增加到约73％，即是对照的2倍(图3A)。根据实施例2的结果，其中miR-124-BS不抑制miR-124的规范种子位点并且仅抑制非规范凸起位点，可以看出宫颈癌细胞的凋亡通过抑制非规范成核凸起靶标的表达而发生。

据报道，miR-124是脑组织特异性miRNA，在其他未显示组织细胞特异性转录组表达的细胞中不具有脑组织特异性功能(Farh K等人,2005,Science,310(5755)1817-21)。因此，为了观察由抑制神经细胞中的非规范性凸起靶标引起的miR-124的功能，将miR-124-BS转染到小脑神经干细胞系C17.2，然后在细胞形态中观察到了细胞分化(图3B，上图)。结果，当转染miR-124时，C17.2细胞的神经突分化得以延长和促进，但是当转染miR-124-BS时，观察到存在分化，并且分支短而不同。因此，可以看出，由miR-124诱导的一般神经突分化通过抑制规范的种子位点靶标而发生。在此，以与实施例2相同的方式通过合成50nM miRNA，用RNAiMax试剂进行miRNA转染。

此外，由于miR-124-BS先前诱导了HeLa细胞的凋亡，因此以与实施例2相同的方式通过流式细胞术观察了C17.2细胞是否在神经细胞中也显示了这种功能。结果，在miR-124表达的情况下，细胞凋亡率为22.4％，与对照组的21％几乎相似，在miR-124-BS表达的情况下，细胞凋亡率为33.4％，略有增加(图3B，中间图像)。这显示出与宫颈癌细胞相同的趋势，即通过抑制miR-124的非规范凸起靶标发生凋亡，但其增长速率远小于宫颈癌细胞。miR-124在神经干细胞中主要起分化相关作用，并且在此，细胞周期的调控可能起关键作用。因此，在将miR-124和miR-124-BS转染到C17.4细胞中之后，通过流式细胞术通过碘化丙啶(PI)染色观察细胞周期(图3B，下图)。在这里，可以看出miR-124诱导了G0/G1期的细胞周期停滞至83％，略高于对照的69％。相比之下，可观察到miR-124-BS表达不会显著诱导细胞周期停滞。通过以与上述实施例相同的方式转染相应的miRNA，将转染的细胞孵育48小时，分离细胞，用乙醇固定它们，并使细胞与1mg/ml PI(Sigma-Aldrich)和0.2mg/ml的RnaseA在37℃下放置30分钟，然后使用BD FACSCalibur(BD Biosciences)通过流式细胞术对其进行分析。

总结以上实施例中的结果，仅通过miR-124-BS抑制miR-124的非规范成核凸起靶标的表达，像miR-124一样诱导宫颈癌细胞(Hela)的死亡。因此，可以看出，miR-124的非规范凸起靶标的抑制功能是癌细胞的死亡。此外，在神经干细胞中，由于miR-124的表达而发生神经突分化，因此几乎不发生凋亡和细胞周期停滞，而在miR-124-BS中仅抑制miR-124的非规范性凸起靶标，这种功能的显示形式略有不同。因此，可以看出，miR-124的神经细胞分化功能通常是由抑制常规已知的或不同形式的规范种子靶基因引起的，可以认为miR-124的神经细胞分化功能可能是由非规范的凸起靶标引起的。

[实施例4]通过miR-124-BS抑制miR-124非规范成核凸起靶标的表达，证实具有许多分支和短神经突(分支神经突生长(outgrowth))的不同形式的神经元分化

在确认miR-124-BS诱导的神经突分化不同于先前实施例中的miR-124的事实后，为了进一步检查这一点，使用人神经母细胞瘤(sh-sy-5y)细胞系(CRL-2266)用于实验。在此，除miR-124-BS外，miR-124-BS(4753)设计为具有相同的miRNA序列，该序列具有相同的miR-124种子序列，能够识别和抑制miR-124的非规范的成核凸起位点，但其他部分不同，是通过先前实施例中描述的方法合成并用于实验。在此使用的miR-124-BS(4753)的序列是5'-CAAGGCCAAAGGAAGAGAACAG-3'，并且使用通过合成与秀丽隐杆线虫的miRNA cel-miR-67(NT；非靶向)相同的对照。通过与先前实施例中所述相同的方法转染相应的miRNA，将细胞培养60小时，然后使用光学显微镜观察细胞的形态变化(图4A)。

结果，可以通过形态变化观察到miR-124的表达，该形态变化使人神经母细胞瘤(Sh-sy-5y)细胞的神经突更长地分化，而在具有与miR-124-BS相同的仅抑制miR-124的非规范凸起靶标的种子序列的miR-124-BS(4753)中，在一个细胞中观察到高度分支的神经突生长(图4A)。基于此，还对含儿茶酚胺的神经细胞(CAD，CRL-11179)进行了相同的实验。在此，转染了相应的miRNA，将细胞孵育52小时，然后观察细胞(图4B)。结果，与从人神经母细胞瘤(Sh-sy-5y，CRL-2266)细胞显示的结果一样，miR-124数量少但形成了更长的神经突，而有可能观察到miR-124-BS(4753)显示出分化现象，其中许多短的神经突分支过度生长(图4B)。此外，将miR-124和miR-124-BS(4753)以相同的比例转移到细胞中，同时观察到具有长神经突的细胞和具有许多神经突分支的细胞。这表明，当表达本发明的miR-124-BS和常规miR-124时，可以人为地促进各种神经元分化，类似于在更复杂的神经网络中显示的脑细胞。

此外，通过对神经细胞特异性标记物Tuj1进行免疫染色，证实了由miRNA促进的CAD细胞系的神经元分化(图4B，下图)。本文中通过以下进行实验：转染相应的miRNA，在转染后用4％多聚甲醛固定CAD细胞52小时，用一抗Tuj1(MRB-435P，Covance AntibodyProducts)以1：1000的比例和Alexa 594荧光材料偶联的二抗(Abcam：ab150076)以1：1000的比例对细胞进行免疫染色，并用DAPI染色核。

从上述实施例的结果可以看出，miR-124具有形成许多短神经突分支的功能，这与常规miR-124的功能不同，常规miR-124仅抑制了非规范成核凸起靶标。特别是，使用只能抑制非规范成核凸起靶标的miR-124-BS(4753)，观察到与miR-124-BS序列不同且种子序列相同的现象，这阐明了包括能够识别非规范成核凸起靶标的种子序列的RNA干扰衍生物显示与miR-124-BS相同的作用。此外，可以证明由miR-124-BS产生的复杂的神经突分支可以用作促进各种类型的神经元分化的方法，类似于显示复杂的神经网络的人脑细胞。

[实施例5]使用siRNA和shRNA载体表达miR-124-BS后确认由此诱导的分支神经突生长的形态和分子生物学特征。

为了另外确认由小鼠神经母细胞瘤N2a(CCL-131)细胞中的miR-124-BS表达诱导的特异性分支神经突生长现象，如实施例4所述，转染了miR-124和miR-124-BS(4753)进入细胞，然后在将细胞温育72小时时观察到细胞的形态变化(图5A)。此外，同时合成了具有相同miR-124种子序列但序列其他部分不同的miR-124(3714)，作为5'-GAAGGCAGCAGUGCUCCCCUGU-3'的序列，从而形成siRNA-型双链体，然后转染到细胞中进行实验。在此，使用通过合成与cel-miR-67(NT；非靶向)(其是秀丽隐杆线虫的miRNA)相同的对照。

结果，在递送了miR-124的实验组中，能够观察到具有长神经突的神经细胞，该神经突类似于含儿茶酚胺的神经细胞(CAD)以及在转染了miR-124-BS(4753)的细胞中，可以确认具有在各个方向上分支的短神经突的细胞的形态特征(图5A，上部)。另外，与miR-124一样，在转染了miR-124(3714)的实验组中，可以观察到许多细胞具有相对较长的神经突(图5A，上部)。与四种类型的对照蛋白(ACT-B，TUB-A，GAPDH和H3B)的表达相比，通过免疫印迹法检测针对分化神经细胞中表达的相应蛋白的抗体Tuj1(Covance Antibody Products，MRB-435P)、vGLUT1(Synaptic Systems，135-303)和MAP2(Millipore,MAB3418)的表达水平的升高，可以证实细胞中的这种形态变化(图5A，下部)。因此，可以确认由miR-124-BS(4753)引起的与miR-124相似但不同的神经元分化在形态学方面略有不同，但是与由miR-124引起的情况相比，在基因表达标记物方面以相同方式诱导，并且可以看出，由于miR-124(3714)具有相同的种子序列，因此miR-124(3714)显示以与miR-124相同的方式主要抑制规范种子靶标，因此具有比预期更长的分化神经细胞分支的特性。此外，当同时表达miR-124-BS(4753)和miR-124(3714)时，分化的神经细胞中显示的蛋白质表达水平增加，证实这些具有分化形式的神经细胞的分子特征。

在上述所有实施例中，通过将合成的双链体转染到细胞中，或者也通过转染用于表达shRNA形式的载体来进行miRNA表达，shRNA是能够产生miRNA的发夹形RNA。因此，使用pCAG-miR30质粒(Addgene#14758)形成以shRNA形式表达miR-124、miR-124-BS(4753)或miR-124(3714)的载体，该质粒是用于表达前miRNA的载体。本文使用的使用CAG启动子来强烈表达miRNA的pCAG-miR30载体，被设计为表达miR NA-30的骨架，从而具有最大化miRNA表达的优势(Paddison P等人，Nature methods,2004,1(2):163-7)。

使用不表达任何东西的pCAG载体将形成以表达miR-124、miR-124-BS(4753)和miR-124(3714)中的每一个的pCAG载体转染到N2a细胞中，然后观察细胞形态(图5B)。在将发夹结构转染成神经母细胞瘤(N2a)细胞的实验组中，显示了与miR-124、miR-124-BS(4753)和miR-124(3714)双链体所显示的细胞形态变化相似的变化。转染后孵育72小时，在分别表达miR-124和miR-124(3714)的实验组中，可以观察到具有长神经突的神经母细胞瘤细胞。与此相反，在表达miR-124-BS(4753)的实验组中，能够观察到在各个方向上具有短的神经突分支的神经母细胞瘤细胞(图5B，上部)。从Tuj1表达的增加或者突触素(SYP)的表达的增加证实了这种细胞形态的变化(图5B，下部)(O.von Bohlen等人，2007Cell andTissue Research，329，3，409-20)，Tuj1是在分化的神经细胞中表达的蛋白。因此，可以确认导入了miR-124、miR-124-BS(4753)和miR-124(3714)发夹载体的细胞具有分化的神经细胞的特征。以与上述实施例相同的方式通过免疫印迹观察到TUJ1的增加，并使用先前文献(SE Kwon等人，2011Neuron 70，847-54)中公开的引物序列通过定量聚合酶链式反应(qPCR)检测突触素。通过以下进行检测：按照制造商的实验规程使用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen)将相应的载体转染到N2a细胞中，转染后24小时，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总RNA，按照相应的实验规程用Superscript III RT(Invitrogen)进行逆转录，使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)执行qPCR，以测量SYP的mRNA水平作为相应的引物，然后将其标准化为GAPDH mRNA水平。

从实施例的结果可以看出，即使当载体以shRNA的形式表达miRNA转染时，如果仅具有相同的miR-124种子序列(miR-124(3714))，与miR-124一样，通常通过抑制规范靶基因的表达来实现长的神经突分化。另外，当miR-124的非规范凸起靶标也以与miR-124-BS相同的方式通过种子区域以shRNA(miR-124-BS(4753))的形式表达时，分支神经突可能会长出。可以确认，miR-124对规范靶标抑制和非规范凸起靶标抑制均以神经细胞神经突分化的形式显示分子基因标志物表达，并且都表现出向神经细胞的分化。

[实施例6]通过调节MAPRE1表达，证实miR-124-BS诱导了小鼠神经母细胞瘤(N2a)细胞的神经突分化

此外，就细胞形态而言，观察到了miR-124、miR-124-BS(4753)和miR-124(3714)诱导的神经母细胞瘤(N2a)细胞中的神经突分化，并对其进行了定量分析(图6A)。在定量分析过程中，为了区分来源于每个神经细胞的神经突分支，以与上述实施例相同的方式共转染了表达绿色荧光蛋白(GFP)的pUltra(Addgene#24129)质粒和相应的miRNA表达载体，细胞培养进行了72小时，使用荧光显微镜(Leica)观察神经突以计数神经突分支的数目，并使用ImageJ程序分析每个细胞产生的神经突的长度。

结果，相对于100个细胞，在miR-124、miR-124-BS(4753)和miR-124(3714)实验组中每个细胞表达的神经突分支数与对照相比增加了约3至5倍(图6A，左下部分)。然而，当表达miR-124-BS(4753)时，与表达miR-124或miR-124(3714)相比，观察到的分支明显更多。此外，当在miR-124-BS(4753)和miR-124(3714)实验组中确认每个细胞生成的神经突长度比对照组增加了4到6倍时，并且更详细地观察到，当表达miR-124或miR-124(3714)时，与表达miR-124-BS(4753)时相比，产生了更长的神经突分支(图6A，右下部分)。这与在先前实施例中的细胞形态学中观察到的结果相同(图4、5和6)。

为了研究由miR-124-BS引起的特异性神经元分化现象是否由任何基因的非规范性凸起位点诱导，在与神经元分化有关的基因的3'UTR区域的序列中搜索了miR-124的非规范性凸起靶序列。结果，发现了据报道调节神经细胞分化的微管相关蛋白RP/EB家族成员1(MAPRE1：Elena Tortosa等人，2013EMBO32，1293-1306)基因。MAPRE1可以是在神经突的产生期间附着在构建神经突的微管末端的蛋白质，并且可以通过调节相应微管的形成来确定神经突的形状。因此，为了确认MAPRE1基因被识别为miR-124的非规范凸起靶标并抑制其表达，将miR-124-BS转染到N2a细胞后，根据实施例5中执行的方法通过qPCR测定法测量MAPRE1的mRNA水平(图6B)。当使用两种不同的引物进行qPCR时，有可能证实这两个结果均能够表明，与对照组相比，miR-124-BS转染的实验组中MAPRE1表达降低至约40％至70％。由此，可以确认MAPRE1的表达被miR-124的非规范凸起位点抑制。

MAPRE1是miR-124的非规范凸起靶标，如果它是非常重要的靶标，则通过抑制miR-124-BS的非规范凸起靶标引起的神经元分化类型将进一步被MAPRE-1表达的减少所促进。因此，为证实这一点，制备了两种能够抑制MAPRE1的siRNA，并用miR-124转染到N2a细胞中，随后进行了证实细胞形态变化的实验(图6C)。结果，与仅表达miR-124的对照相比，在表达具有针对MAPRE1的siRNA的miR-124的实验组中，可以观察到神经突分支的数量大大增加，观察到与使用具有不同序列的两种类型的MAPRE1siRNA的实验相同(图6C)。在该实验中，当以与先前实施例中使用的方法相同的方式将RNA转染到细胞中时，在将细胞孵育48小时后观察到形态。

因此，证实了由miR-124-BS诱导的短而分支的神经突生长是一种生物学功能，可以通过至少部分抑制miR-124的非规范性凸起靶位点MAPRE1基因的表达来显示。

[实施例7]当将miR-124-BS以转录组水平转染到细胞中时抑制miR-124的非规范凸起靶基因的趋势的分析

证实了在小鼠神经母细胞瘤(N2a)细胞中由miR-124-BS抑制的基因最终诱导神经细胞分化，其产生神经母细胞瘤的许多神经突分支(图5)。该现象被认为是通过识别和抑制miR-124的非规范凸起靶标而发生的，并且这种可能性已通过以MAPRE1为靶基因得到证实(图6)。但是，这实际上可能是由于抑制了数百个miR-124的非规范凸起靶基因而引起的。

将miR-124和miR-124-BS转染到N2a细胞中后，对发明人发明的miR-124-BS进行RNA-Seq分析，以在表达所有基因的转录组水平上仅确认miR-124的非规范凸起靶基因。在此，使用了具有与miR-124相同的碱基序列并且在从5’末端起的6位的无碱基替代(pi)的双链体(miR-124-6pi)作为对照，据报道这种替代根本不与靶mRNA配对，因为从miRNA的5’末端起的6位没有碱基(Lee HS等人.2015，Nat Commun.6：10154)。

通过以下进行RNA-Seq分析：使用作为实验对照的cel-miR-67序列(其为秀丽隐杆线虫(C.elegans)miRNA，其中5’末端的6位被无碱基间隔子(NT-6pi)替代)的修改，通过将miR-124、miR-124-BS和miR-124-6pi双链体分别以75nM递送到N2a细胞中，在孵育24小时后用RNAeasy(Qiagen)提取总RNA，在Otogenetics构建文库，并对其进行下一代测序。然后，使用TopHat2程序将通过测定获得的序列数据即FASTAQ文件映射到小鼠基因组序列(mm9)，使用Cufflink和Cuffdiff程序获得表达值(FPKM)，并将其标准化为转染了对照NT-6pi的小鼠神经母细胞瘤(N2a)细胞的结果，以倍数变化(log2比)进行分析。

为了从RNA-Seq结果分析相应的miRNA的表达是否降低了具有miRNA靶位点的基因的mRNA水平，筛选了phastCons得分为0.9或更高的基因以选择其中miR-124的规范种子位点(与5’末端2至8位之间的碱基配对的7聚体(7mer))具有3'UTR并且相应位点的序列在各种物种中均是保守的那些基因，并根据相应miRNA的表达，以抑制顺序的累积分数比较和分析这些分析结果。此外，还以与上述相同的方式鉴定了miR-124的非规范凸起位点(nuc，7聚体(7mer))，并以与上述相同的方式用累积分数分析了相应基因的抑制性分数。在此，由于具有miR-124的非规范凸起位点的基因也具有规范种子位点，因此与总mRNA(仅nuc)中不存在miR-124的规范种子序列时相比，难以确定其抑制作用，还分析了只有规范种子位点而没有非规范的凸起位点(仅种子)的情况。

在表达miR-124的实验组的RNA-Seq测序中，当根据累积分数分析根据miR-124表达的倍数变化时，确认了一种现象，其中与证实总mRNA的分布相比，具有在3'UTR中的miR-124中保守的规范种子位点的基因(miR-124种子)被高度抑制(图7A，上部)，并且与之相比，可以观察到具有miR-124的非规范凸起位点的基因被显著抑制，然后被非常弱地抑制(图7A，下部)。然而，在作为对照的miR-124-6pi转染的细胞中未观察到这种抑制现象(图7B)。

当表达由本发明人开发的miR-124-BS时，在RNA-Seq测序中，当根据累积分数分析根据miR-124-BS表达的倍数变化时，证实了具有在3'UTR中的miR-124中保守的规范种子位点的基因(miR-124种子)中显示出弱的抑制作用，而在没有miR-124的非规范凸起位点的具有相应的规范种子位点的基因(仅miR-124种子)中没有变化(图7C，上部)。但是，可以看到，对具有miR-124的非规范凸起靶标的基因(miR-124nuc)和具有相应靶标的基因(仅miR-124nuc)的抑制作用都强烈而有效地发生了(图7C，下部)。在图7C中，当表达miR-124-BS时，仅具有miR-124的规范种子位点的基因(仅miR-124种子)未被抑制，证明了miR-124的规范种子位点根本没有被抑制，但是，据预测，miR-124-BS对miR-124的种子位点靶点的弱抑制可能是由于miR-124的规范位点和非规范性凸起位点的共存引起的。

从实施例的结果可以看出，miRNA非常强而有效地抑制了常规的规范种子靶基因，但是在转录组水平上非常弱地抑制了非规范凸起靶标，因此可以证实miRNA-BS抑制miRNA的非规范凸起靶标的表达，但是在转录组水平上不抑制常规规范性种子序列。

[实施例8]通过流式细胞术确认miR-122-BS在人肝癌细胞系(HepG2)中诱导的细胞周期停滞

基于观察到miR-124的非规范成核凸起靶标诱导miR-124的神经细胞分化的结果，进行了另一种miRNA的非规范成核凸起靶标的生物学功能实验。MiR-122具有5'-UGG AGUGU-3'作为种子碱基序列，而miR-122-BS是与其非规范成核凸起靶标位点配对的siRNA的碱基序列，可以在位置6上再有一个U，在这种情况下，因此在其5’末端具有19个碱基(由5'-UGG AGU U GUG ACA AUG GUG-3'表示)和在位置20和21上具有脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dt)作为碱基。特别是，在双链体结构中，相应的dt部分可以由引导链和过客链组成，以在3'端形成两个核苷酸的突出端。在此，过客链与引导链形成了完全互补的碱基配对，并且在从5’末端起的位置1和2处都包含两个2'OMe，在碱基序列的末端处包含了两个dt(图8A)。通过Bionia化学合成miR-122-BS的引导链和过客链，通过HPLC分离，并根据制造商提供的方法在双链体中制备。

将如上所述制备的miR-122-BS(图8A)转染到人肝癌细胞系(HepG2)中，然后通过流式细胞术观察细胞周期的变化。在该实验中，使用RNAiMAX(Invitrogen)试剂将NT-6pi作为对照以及miR-122和miR-122-BS双链体以50nM分别转染到HepG2细胞中，并将细胞孵育24小时，用100ng/ml的诺考达唑(nocodazole)处理16小时，并同步至G2/M期(分裂准备期/分裂期)，然后根据制造商提供的实验方法，使用MuseTM细胞周期试剂盒(目录号MCH100106，Millipore)和Muse细胞分析仪(Millipore)分析细胞周期。

结果，与NT-6pi转染对照的细胞周期分析相比，在miR-122-BS实验组中，G0/G1期细胞从10.7％增至24.3％，增幅约为2倍，确认了在肝癌(HepG2)细胞中的细胞周期停滞增加了(图8B和8C)。在miR-122转染的细胞中未观察到G0/G1期细胞的增加。随后，与对照组相比，miR-122-BS转染的人肝癌细胞系(HepG2)的G2/M期细胞分布从83.4％降低至67.3％，而在miR-122转染的细胞未观察到该结果(图8B和8C)。

因此，可以观察到miR-122-BS显示出通过调节miR-122的非规范成核凸起靶标的表达来诱导人肝癌细胞系中细胞周期停滞的生物学功能，其是与miR-122的生物学功能完全不同的功能。

[实施例9]确认由miR-1-BS诱导的骨骼肌细胞(C2C12)的肌肉纤维化功能以及由miR-155-BS介导的细胞凋亡

由于已经观察到与miRNA-BS介导的抑制miRNA规范种子靶标表达所显示的功能不同的新颖生物学功能，为了观察这种功能在肌细胞中如何发挥作用，将miRNA-BS应用于在肌细胞中表达并发挥关键作用的miR-1和miR-155。

首先，由于miR-1是肌肉组织特异性miRNA，并且据报道在肌细胞分化中起作用(Chen J等人，自然遗传学，2006，38(2)：228-233)，miR-1-BS在骨骼肌细胞系C2C12中表达，然后研究细胞形态变化(图9A)和在分化中表达的基因标志物的表达(图9B)。在此，以与先前实施例相同的方式合成miR-1-BS，并将其转染到细胞中，然后在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen)中孵育细胞持续48小时，然后在生长培养基(GM)条件(图9A，上部)下分裂后观察，并在FBS去除的剥夺培养基(deprivation media)(DM)条件下进一步孵育48小时(图9A，下部)。之后，将细胞用4％多聚甲醛(PFA)处理以固定细胞，使分化肌细胞中表达的肌球蛋白2重链蛋白与一抗(MF20：Developmental Studies Hybridoma Bank)反应，然后用附有Alexa 488荧光材料的小鼠二抗(ab150105)染色，以观察细胞形态和分化(图9A)。

结果，当miR-1-BS在生长培养基(GM)条件下在小鼠骨骼肌细胞(C2C12)中表达时，与NT(对照)或miR-1双链体转染的细胞相比，MF20染色可以确认有大量分化的肌细胞。在孵育期间降低血清的剥夺培养基(DM)条件下，观察到分化为肌肉纤维的进程，与作为对照的表达NT的骨骼肌细胞相比，可以观察到更粗的纤维(图9A)。这是由于GM条件下miR-1-BS更快诱导肌细胞分化所致。肌细胞的分化可以通过在分化过程中其表达增加的基因的表达水平作为分子水平的标志物来确认，因此，使用对相应mRNA具有特异性的引物通过逆转录(RT)-PCR检测sk-肌动蛋白和生肌蛋白的表达水平，与β-肌动蛋白的mRNA水平相比，其在分化中的表达水平没有差异(图9B)。结果，当miR-1(1)和miR-1-BS(1BS)都被表达时，可以确认sk-肌动蛋白和生肌蛋白的转录水平增加，且与miR-1相比，miR-1-BS可以增加生肌蛋白的转录水平。

miR-155是抑制肌细胞分化的miRNA(Seok H等人，JBC，286(41)：35339-46，2011)，通过以与上述miR-1相同的方式进行的骨骼肌细胞(C2C12)的分化观察了miR-155-BS的作用(图9C)。结果，在以NT作为对照之后，表达了miR-155和miR-155-BS，观察到在GM条件下未观察到明显的形态学差异，而在诱导肌细胞分化的DM条件下，对照分化，当表达miR-155时，分化被抑制，并且当表达miR-155-BS时，通过用肌球蛋白2重链蛋白免疫染色证实了，分化消失了(图9C)。特别是，当仔细检查表达miR-155-BS的C2C12细胞时，观察到miR-155-BS诱导凋亡。与此相反的是，在miR-155转染的肌细胞中，根本未观察到凋亡(图9C，下部分)。为了进一步研究，使表达相应miRNA的C2C12细胞在GM条件下生长48小时，然后以与实施例3相同的方式进行流式细胞术以检查细胞凋亡(图9D)。结果，证实了在miR-155-BS转染的实验组中，与对照相比，细胞凋亡增加了约1.5至2.5倍(图9D和9E)。

在这个实施例中，可以证实miR-1-BS促进骨骼肌细胞的分化并诱导粗肌纤维的分化，miR-155-BS诱导骨骼肌细胞的死亡，并且这些功能与常规miR-1收缩肌细胞的功能和miR-155抑制肌细胞分化的功能不同。

[实施例10]通过Ago HITS CLIP分析发现允许在miRNA的种子位置上存在摆动碱基配对的非规范靶位点

作为在转录组水平上分析miRNA靶标的方法，已经开发了一种被称为Ago HITSCLIP的实验方法并被广泛使用(Nature，2009，460(7254)：479-86)。Ago HITS CLIP测定法是一种方法，其通过以下实施：对细胞或组织样品进行紫外线照射，诱导细胞中RNA和Argonaute蛋白之间的共价键合，使用特异性识别Argonaute的抗体通过免疫沉淀法分离生成的RNA-Argonaute复合物并通过下一代测序分析分离的RNA。由此获得的碱基序列数据不仅可以通过生物信息学分析鉴定miRNA的靶mRNA，而且可以精确地分析其结合位点和序列(Nature，2009，460(7254)：479-86)。AGO HITS-CLIP首先应用于小鼠大脑皮层组织，以对大脑组织中的miRNA靶标进行定位。从那时起，该方法已应用于各种组织。通过许多Ago HITS-CLIP分析，鉴定了各种组织中的miRNA结合位点，发现有许多非规范的结合位点，特别是在上述靶序列中产生相似的miRNA种子结合，但在靶mRNA的序列中的结合不同(Nat StructMol Biol.2012Feb 12；19(3)：321-7)。

已经观察到，除了常规的已知碱基配对之外，一些已知的非规范结合规则以通过G：U碱基配对的摆动的形式存在。与常规的碱基配对不同，在特异性的RNA中发现了摆动碱基配对，这表明众所周知的G：U摆动配对也可以与miRNA的非规范靶标配对。然而，与此相比，具有弱结合并且不经常发现的G：A摆动配对可以在特异性RNA中形成碱基配对，但是除此之外，还没有进行任何研究。然而，在miRNA的种子序列的情况下，由于碱基配对的自由能通过Argonaute蛋白在结构上稳定，所以通常弱的G：A碱基配对可能是相对重要的，并且基于上述事实，发明人进行了如下分析。

首先，为了确认人脑组织的miRNA靶标中是否存在包含G：A对的摆动碱基配对，分析了死后脑组织灰质的Ago HITS-CLIP数据(Boudreau RL等人，Neuron，Vol.81(2)，2014，294-305)(图10A)。通过使用FASTQ文件通过Bowtie2将根据Ago HITS-CLIP开发中使用的方法(Nature，2009，460(7254)：479-86)已经与Argonaute-miRNA结合的RNA序列与人基因组序列配对来进行该分析。此外，分析了同时与人miRNA序列配对的相应测序结果，从而还分析了在相应脑组织中频繁结合Argonaute蛋白的20种类型的miRNA(排名前20位的miRNA；图10B)(图10B)。在此，观察到在miRNA结合位点发现大量的规范种子靶位点(图3B，中位数：1292.5个位点，误差范围：+/-706.62)。之后，从Ago HITS-CLIP数据中，检查在此类miRNA种子碱基序列中是否存在与G：U或G：A摆动配对结合的非规范靶位点。在此，为了进行分析，将由于与miRNA种子碱基序列相同的碱基序列而无法实现碱基的互补配对的靶序列用作对照。

分析的结果是，所有G：A摆动配对允许的靶位点(中位数：1119.5个位点，误差范围：+/-526.48)和G：U摆动配对允许的靶位点(中位数：995个位点，误差范围：+/-523.22)显示出比对照(中位数891个位点，误差范围：+/-410.71)更高的分布，这表明，特别是，具有G：A摆动配对的miRNA靶位是那些具有G：U摆动配对的靶位的大约1.1倍(图10B)。在脑组织中特异性表达的MiR-124在种子区域的5’末端起的4和5位具有两个G碱基，因此可以实现G：U和G：A摆动碱基配对(图10C)。因此，作为通过在特异性位点的G碱基区分和分析G：A和G：U摆动碱基配对的结果(图10D)，发现了最大数量(1992)的miR-124的规范种子靶位点(种子位点)。然而，与上述相比，发现了1542个在位置4的碱基处具有G：U摆动配对的位点，然后观察到了1542个具有G：A摆动配对的位点。此外，观察到1800个具有G：U摆动配对的靶位点和1196个具有G：A摆动配对的靶位点，并且可以确认所有被调查的位点的数量均大于对照的数量(647个位点)(图10D)。因此，当靶mRNA被种子区域的碱基序列识别时，允许非规范的G：U或G：A摆动碱基对以及相对于种子区域的规范碱基序列，并且可以看出，通过这些类型的配对，miRNA可以通过G：A摆动碱基配对与靶mRNA结合。通过G：A摆动碱基配对进行的此类miRNA靶标识别是尚未报道的新颖结果，如上面所观察的，可以确认在许多miRNA中都识别出非规范靶标。

在该实施例中，由于发现对miRNA的非规范靶标的识别使得G：A可以与种子序列发生摆动配对，因此认为许多miRNA可以与靶标基因的mRNA结合，从而抑制了基因的表达。

[实施例11]确认了作为miRNA的非规范靶标的识别G：A种子位点的miRNA-GU的发育，以及应用miR-124时增加miR-124-G5U的神经细胞死亡的作用

在实施例10中，发现对miRNA的非规范靶标识别可以允许在种子序列中有G：A摆动配对，这被称为非规范G：A种子位点，相比之下，本发明的miRNA-GU是一种能够互补配对的新颖诱导RNA干扰的材料的序列。当将此类测序技术应用于miR-124时，miR-124是其中种子序列为5'-AAGGCAC-3'且非规范G：A摆动种子靶标能够在第4个和第5个G碱基处具有G：A摆动碱基配对的碱基序列，因此，当将这样的G：A摆动配对更改为miRNA-GU序列时，miRNA-GU序列是将摆动配对改变为常规互补碱基对的格式，该序列可以更改为miR-124-G4U(5'-AAUGCAC-3')或miR-124-G5U(5'-AAGUCAC-3')。由于如上所述改变的miR-124-G4U和miR-124-G5U可以与以G：A摆动配对弱配对的非规范靶位点互补配对，并且可以被常规miR-124识别，可以显示miR-124中的非规范G：A种子靶标的功能。

因此，通过将非规范的G：A摆动种子靶标应用于miR-124来进行实验，以检查由miRNA的非规范的G：A摆动种子靶标介导的生物学功能。为此，按照与先前实施例相同的方式，将NT(被称为图11B的N2a)作为对照，将miR-124、miR-124-G4U或miR-124-G5U转染入神经母细胞瘤N2a细胞，将其孵育72小时以观察细胞形态(图11B)。结果，当表达miR-124时，会发生形成神经突的分化现象，但在miR-124-G4U或miR-124-G5U转染的实验组中，观察到未发生分化的现象(图11B)。由于miRNA-GU改变了属于传统的miR-124功能的神经元分化能力，因此在人神经母细胞瘤(Sh-sy-5y)细胞系中观察到凋亡的变化。在此，类似于实施例9中使用的方法，使用Muse

基于此，可以确认miR-124-GU介导抑制非规范G：A摆动种子靶标的作用消除了miR-124诱导的神经元分化能力，并具有凋亡调节功能，这是另一个生物学功能，而不是神经元分化能力。

[实施例12]促进miR-124-G4U诱导的神经母细胞瘤的细胞分裂

在先前实施例中，由于miR-124-G4U失去了神经分化能力，并且在凋亡中没有特异性功能，因此检查了细胞分裂。也就是说，将对照NT、miR-124、miR-124-G4U和miR-124-G5U中的每一个都以与先前实施例中所述相同的方式转染到神经母细胞瘤(N2a)细胞中，并用流式细胞仪检测细胞分裂和增殖现象(图12A)。根据制造商提供的实验方法通过使用MuseKi67增殖试剂盒(Millipore)处理细胞，并使用Muse细胞分析仪(Millipore)分析细胞分裂，进行本文所用的实验。该方法用于通过测量Ki67染色的细胞数量来定量分析因细胞分裂和增殖而增加的细胞数量。当miR-124在N2a细胞中表达时，与对照NT相比，随着细胞的分化，Ki67染色强度降低的细胞数量增加。但是，在miR-124-G4U转染实验组中，与对照(NT)相比，Ki67染色细胞的增殖细胞数从61％略增至65％。与此相反的是，可以观察到miR-14-G5U与对照没有差异。

另外，为了研究miR-124-G4U对细胞周期的作用，使用人神经母细胞瘤细胞系(sh-sy-5y)进行了流式细胞术(图12B)。使用Muse

根据上述实施例，可以看出抑制miR-124的非规范G：A摆动种子靶标的诱导RNA干扰的修改序列的miR-124-G4U具有增加成神经细胞的分裂和增殖的功能。

[实施例13]使用荧光蛋白报告基因证实miR-1可以抑制心肌细胞系中非规范G：A摆动种子靶基因的表达

在上述实施例中，通过允许在种子序列中有G：A摆动配对，miRNA能够非规范地与靶mRNA结合，并且发现所得复合物能够具有新颖的功能，然后在细胞水平上进行了报告基因测定(reporter assay)，以证实这种结合是否确实可以诱导靶基因的抑制。在此，此测定是针对已知在肌肉样细胞(如心肌细胞h9c2)中高表达的miR-1进行的，特别是在G：A摆动碱基对上进行的，主要是在miR-1的5’末端起的7位的G(图13)。为了在各个细胞水平上更精确地测量由miRNA介导的基因抑制，构建并使用了荧光蛋白表达报告系统(图13)。形成荧光蛋白表达报告系统以在一种载体中表达具有两种颜色的荧光蛋白。在此，绿色荧光蛋白(GFP)在SV40启动子中表达，若干个miRNA靶位点连续排列在3'非翻译区(3'UTR)，通过GFP的强度测量了miRNA介导的基因抑制作用，并且红色荧光蛋白(RFP)在TK启动子中表达，从而将GF信号标准化为RFP强度并使用(图13A，上部)。

通过将与在miR-1的5’末端起的2至8位碱基互补的并在第7个碱基(G)处具有G：A摆动的非规范靶位点(7G：A位点)插入荧光蛋白表达报告载体中，形成报告基因，然后通过实验确认该报告基因是否被miR-1抑制。在此实验中，根据制造商的实验规程，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)试剂将500ng GFP-7G：A位点报告载体和25μM的miR-1共转染到心肌细胞系(H9c2)中，转染后24小时，使用Attune NxT(Life Technology)通过流式细胞仪测量每个荧光信号。结果，证实了与其中转染有对照核酸(cont；NT)的细胞(图13A，左部)相比，miR-1的表达非常有效地抑制了miR-1的7G：A位点(图13A，中间)。也就是说，通过分析心肌细胞系(h9c2)中四个部分(Q5-1，Q5-2，Q5-3和Q5-4)的两种荧光蛋白表达程度，与对照NT转染的细胞相比，在miR-1转染的细胞中，RFP强度为103且GFP强度为103的细胞分布从59.51％(对照：Q5-3)降低到41.80％(miR-1：Q5-3)。

在对照中，观察到即使在没有miR-1转染的h9c2细胞中，GFP-7G：A位点报告载体也被一定程度抑制。可以预见，抑制作用是由先前在h9c2细胞中表达的miR-1通过G：A摆动碱基与报告基因靶mRNA配对而介导的。为了证实这一点，从Dharmacon购买了可以抑制h9c2细胞中miR-1表达的miRIDIAN微小RNA发夹抑制剂(miR-1抑制剂，图13A，右部)，并以50μM转染到细胞中。结果，与对照(图13A，左部)相比，当转染miR-1抑制剂时(图13A，右部)，显示RFP强度为103和GFP强度为103的细胞的分布增加至81.56％(miR-1抑制剂：Q5-3)，证实存在于细胞中的miR-1可以通过miR-1的7G：A位点抑制基因表达(图13A)。

这一点通过以下证实：通过另外分别转染其中miRNA靶位点未添加到荧光蛋白表达报告基因的对照(GFP-无位点)和miR-1 7G：A位点插入的报告基因(即GFP-7G：A位点)到H9c2细胞中并比较它们的活性，并将结果与用miR-1作为阳性对照共转染的情况进行定量比较(图13B)。为了进行比较分析，将流式细胞仪测得的RFP值除以截面积，然后将GFP值取平均值并转换为对数比，然后相对地将对数比计算为对照的GFP水平，即GFP-无位点设为1(相对log GFP)。在此，当存在有通过G：A摆动配对与miR-1的第7个G碱基互补配对的位点(GFP-7G：A位点)时，特别是在显示从1.5到3的RFP表达(log RFP)的截面中，已确认由G：A摆动引起的GFP表达(相对log GFP)从1降低了约10％。观察到这种抑制的方式与其中在阳性对照中GFP表达(相对log GFP)被抑制约40％至10％的模式相同，特别是在从1.5至4的RFP表达(log RFP)的截面中。

为了确认在上述实施例中观察到的结果不受相应的荧光蛋白报告基因中使用的不同启动子的强度以及两种不同的荧光蛋白之间的荧光活性的差异的影响，从Addgene(质粒#82447)购买了荧光蛋白报告基因，即p.UTA.3.0(Lemus-Diaz N等人，ScientificReports，(7)，2017)，其中两个荧光蛋白互换了。在此，通过将miR-1-7G：A序列重复5次插入由p·UTA.3.0载体中的SV40启动子调控的RFP的3'UTR中，构建了报告载体(RFP-7G：A位点)之后，进行报告基因测定，并通过修改标准化到转染到细胞中程度的GFP值来使用RFP表达水平(图13C，上部)。结果，与前面的实施例一样，通过将没有miRNA靶位点的报告基因的对照(RFP-无位点)和插入有miR-17G：A位点的报告基因(RFP-7G：A位点)的结果进行比较，确认了在h9c2细胞中表达的miR-1对miR-1 7G：A的抑制作用。并且通过阳性对照和miR-1的共转染也观察到了与先前实施例相同的现象(图13C和13D)。

由上可知，通过Ago HITS-CLIP分析发现的miRNA的非规范靶标不仅可以通过G：A摆动配对实际结合到miRNA的种子序列，而且可以抑制相应靶基因的表达。据此，认为miRNA的非规范靶标能够通过G：A摆动配对轻易地与miRNA的靶位点结合，并且如果这可以由miRNA-GU类似地诱导，则仅使用由非规范靶标抑制介导的miRNA的生物学功能。

[实施例14]确认通过调节在miR-1的G2、G3和G7处的非规范G：A摆动种子靶基因来诱导心肌细胞肥大的功能

为通过使用miRNA-GU来证实通过充当miRNA的非规范靶标的G：A摆动碱基对来调节通过上述非规范基因抑制的生物学功能的可能性，对心肌细胞的miR-1进行了实验，该实验已在前面的实施例中进行了描述。

为了研究非规范G：A摆动靶标是否具有特异性的生物学功能，miR-1应该仅识别非规范G：A摆动配对靶位点，而不是规范靶标，因此在实验中使用了通过用miR-1的种子区域中的U替代相应的G以与A配对而不是C配对从而制备得到的miRNA-GU。在该实验中对于与心脏更相似的生理条件，使用了来源于大鼠心脏组织的原代大鼠新生心肌细胞。在此，对于心肌细胞培养，通过酶反应(Neomyt试剂盒，Cellutron)从新生大鼠的心脏组织(出生后1天)分离心肌细胞，并在补充有10％FBS(胎牛血清)、5％HS(马血清)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen)和M199(WellGene)的4：1混合物中培养心肌细胞。通过在制备的培养基中添加brdU，细胞可以在心脏组织中以与其他细胞不同的细胞周期进行培养。

首先确认在如上所述获得的原代培养的心肌细胞中是否诱导了心肌肥大(图14A)。心肌细胞具有在细胞周期停滞后能够增加其大小的特征，这被称为心肌肥大。心肌肥大是一种心脏病模型系统，其细胞形态和基因表达谱变化是众所周知的，它在补偿心肌细胞功能的恶化中起作用，并且被称为心脏病的中间生理阶段。在心肌肥大细胞模型中，当用肾上腺素能受体激动剂如去氧肾上腺素(PE)处理心肌细胞时，可诱发心肌肥大(Molkentin，JD等人，1998，Cell 93(2)，215-228)。因此，通过用100μM去氧肾上腺素处理培养的心肌细胞来诱导心肌肥大，然后与根本不进行处理的对照进行比较(图14A，rCMC)，从而在形态上证实了心肌细胞的大小增加(图14A，+PE)。另外，当将miR-1转染到原代心肌细胞中时，观察到了心肌细胞尺寸的减小(图14A，右上部分)。这与众所周知的心肌肥大和心肌细胞中的miR-1功能同时发生(Molkentin，JD等人，1998，Cell 93(2)，215-228，Ikeda S等人，Mol cell boil，2009，vol29，2193-2204)。

MiR-1在种子区域包含三个G，因此，为了仅识别非规范的G：A摆动配对靶位点，而不是规范的靶标，设计了其中G被替换为U的miR-1并根据G的位置应用于从5’末端起的第2位(miR-1-G2U)，第3位(miR-1-G3U)和第7位(miR-1-G7U)。在此，图14中使用的miR-1的替代碱基序列为如下所示(miR-1-G2U：5'p-UUGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'；miR-1-G3U：5'p-UGUAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'；和miR-1-G7U：5'p-UGGAAUUUAAAGAAGUAUGUAU-3')。这些序列被合成为引导链，并且通过参考常规miR-1来设计制备过客链，其由Bioneer化学合成并通过HPLC分离。根据制造商提供的方法，在引导链和过客链的双链体中制备序列。使用50μM的RNAiMAX试剂(Invitrogen)将相应的miRNA转染到原代心肌细胞系中。

结果，可以观察到，当将miR-1-G2U、miR-1-G3U或miR-1-G7U转染到原代心肌细胞培养物中时，心肌细胞的大小增加，类似于心肌肥大诱导的细胞(图14A，+PE)。在此，为了定量分析每个细胞大小，使用ImageJ程序(NIH)定量了100个或更多细胞，并分析了合成以仅识别miR-1的G：A摆动配对位点的所有miR-1替代物(miR-1-G2U，miR-1-G3U和miR-1-G7U)是转染对照(NT)的情况的1.5至1.8倍。这与去氧肾上腺素(PE)诱导的心肌肥大模型中的心肌细胞大小相似，并且miR-1本身在心肌细胞的形态方面表现出减小细胞大小的作用，表明了规范的靶标抑制作用在细胞形态上表现出不同于G：A摆动介导的靶标抑制的功能(图14B)。另外，为了进一步确认在该实施例中在分子水平上观察到的心肌肥大，通过定量聚合酶链反应(qPCR)，测量已知作为标志物的表达增加的心钠素(ANP)基因的表达作为与GAPDH相比的相对值(图14C)。结果，将合成以仅识别miR-1的G：A摆动配对位点的miR-1替代物(miR-1-G2U，miR-1-G3U和miR-1-G7U)转染到心肌细胞中时，通过四个重复的实验可以确认，与对照(NT)相比，所有这些miR-1替代物均显著提高了ANP表达水平约1.2至1.5倍。ANP表达的增加小于去氧肾上腺素(PE)处理的心肌细胞实验组的大小的增加，去氧肾上腺素(PE)处理的心肌细胞实验组的大小是对照组的约2倍，但是，与原始miR-1转染时ANP表达显著降低的现象相反。这表明由于G：A摆动配对位点，miR-1具有完全不同的生物学功能。

从以上内容，最终可以看出，miRNA种子区域中被G：A摆动配对抑制的非规范靶标可表现出与常规规范靶标识别不同的生物学功能。该发现表明，由miRNA的规范靶标引起的功能不同于由其非规范靶标引起的功能，并且据此，如果仅miRNA的G：A摆动靶标可以被抑制，则只有由于G：A摆动靶标而发生的生物学功能才会受到选择性控制。

[实施例15]观察通过miR-133-G4U在心肌细胞系(H9c2)中的表达诱导心肌肥大

关于由作用于miRNA种子区域的G：A摆动碱基配对识别的非规范靶标现象，为了进一步确认其在心肌细胞中的生物学功能，除了先前实施例中所述的miR-1以外，miRNA-GU应用于已知在心肌细胞中起作用的miR-133。已知miR-133具有调节心肌细胞发育和疾病病理以及抑制心肌肥大的功能(Nat Med.2007,13(5):613-618；Ikeda S等人,Mol cell boil,2009,vol29,2193-2204)。因此，本发明人将用miR-133-G4U(5'-UUUUGUCCCCUUCAACCAGCUG-3')制备的50nM双链体(其是诱导干扰的核酸，可特异性抑制通过miR-133的非规范GA摆动靶位点的5’末端的G4识别的靶标，如上所述由Bionia合成)转染到心肌细胞系(h9c2)，并观察到细胞形态的变化(图15A)。结果，与对照(NT)相比，miR-133-G4U表达增加了H9c2细胞的大小(图15A)，并且通过使用ImageJ(NIH)程序定量分析100个或更多细胞的大小的结果，可以确认细胞大小显著增加约2倍(图15B)。

因此，可以预测由miR-133-G4U引起的miR-133的非规范G：A摆动种子靶标的表达的降低诱导心肌肥大，这是与miR-133抑制心肌肥大的规范种子靶标抑制功能不同的新功能。

[实施例16]使用荧光素酶报告基因，确认miR-122对肝癌细胞中的非规范GA摆动种子位点基因表达的抑制作用

在上述实施例10中，根据miRNA与G：A摆动配对种子位点非规范结合的发现，发明了仅特异性识别非规范靶标结合的miRNA-GU，并且在实施例11、12、13或14中观察到，当将其应用于miR-124、miR-1或miR-133时，表现出与常规功能不同的作用。另外，为了确认在miRNA中具有非规范G：A摆动配对种子位点的靶基因的表达是否能够被实际抑制，在实施例13中针对miR-1确认了心肌组织细胞系中的功能。此外，尝试使用荧光素酶报告系统来确认在肝组织和肝癌细胞中特异性表达的miR-122中能否抑制非规范G：A摆动种子靶基因的表达(图16)。

miR-122在肝癌或肝组织中特异性表达并因此具有功能，其具有的G能够在种子序列(从5’末端起第1至第8个碱基：5'-UGG AGU GU-3')5’末端的2、3、5和7位形成G：A摆动配对。因此，首先，为了测定能够通过在G2上的G：A摆动配对而被非规范地识别的相应靶位点的抑制效率，通过与实施例2中所述相同的方法测定半数抑制浓度(IC

为检测对能够与miR-122的G2形成G：A碱基配对的非规范G：A摆动种子靶标的表达的抑制作用，通过将针对miRNA-122的G2的非规范G：A摆动种子位点(2G：A)序列(从5’末端起的第1至9个碱基：5'-CAC ACU CAA-3')的五个顺序排列的拷贝引入在psi-check2(Promega)载体中的海肾荧光素酶基因的3'非翻译区(3'UTR)，来生产用于实验的荧光素酶报告载体。此外，用于规范种子位点(5’末端第1至9个碱基：5'-CAC ACU CCA-3')的荧光素酶报告载体以与上述相同的方式同时生产。

通过使用各种浓度的如上所述产生的荧光素酶报告载体在相应的荧光素酶报告基因的活性中的变化来测量对具有规范种子位点和miR-122的5’末端的G2处的非规范G：A摆动种子位点(2G：A位点)的靶基因表达的抑制作用，并检查IC

通过以与本实施例相同的方式合成miR-122的双链体，并按照制造商的实验规程使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)将其与相应的psi-check2载体(50ng)以各种浓度(0、1、5、10和25nM)共转染入大约10,000个肝癌细胞(Huh7，KCLB：60104)中，然后在96孔板中孵育细胞，然后以与实施例2相同的方式测量荧光素酶活性。

在确认miR-122抑制非规范G：A摆动种子位点基因的表达后，使用Huh7细胞系(包含miR-122的肝癌细胞)确认其是否受存在于细胞中的miR-122均等地调节，对由5'末端的G2和G3引起的非规范G：A摆动种子位点(2G：A)进行荧光素酶报告基因测定(图16B)。为了进行该测定，另外，以与上述相同的方式生产由5’末端的G3引起的非规范G：A摆动种子位点(3G：A)的荧光素酶报告载体(luc-3G：A位点)、由5’末端的G2和G3引起的非规范G：A摆动种子位点的荧光素酶报告载体(luc-2G：A，3G：A位点)和可测量与miR-122的完整序列完全互补的序列的荧光素酶报告载体(luc-PM位点)，并与由5’末端的G2引起的非规范G：A摆动种子位点(2G：A)的荧光素酶报告载体(luc-2G：A位点)共转染入肝癌细胞系以测量荧光素酶活性(图16B)。

结果，当将luc-PM位点载体转染到已知具有miR-122的Huh7细胞中时，观察到与仅转染荧光素酶载体的对照相比，活性降低了约50％，证实了Huh7细胞中存在miR-122，同时，miR-122抑制在G3上非规范G：A摆动种子靶报告基因(Luc-3G：A)以及在G2和G3上非规范G：A摆动种子靶报告基因(Luc-2G：A，3G：A)的活性。此外，为了查看抑制作用是否由miR-122诱导，从Damacon购买了miR-122表达抑制剂(hsa-miR-122-5p抑制剂，IH-300591-06-0010)并以50nM处理，确认所有抑制现象均已消失。

根据该实施例，证实了miR-122比规范的种子位点弱，并且可以抑制由5’末端的G2引起的非规范G：A摆动种子靶标的表达，以及天然存在于肝癌细胞(Huh7)中的miR-122抑制基于5’末端的非规范3G：A摆动种子靶基因和非规范2,3G：A摆动种子靶基因的表达。特别是，由于miR-122表达抑制剂的处理，肝癌细胞(Huh7)中显示的受miR-122调节的抑制作用消失(图16B)。因此，可以看出miR-122具有调节对非规范G：A摆动种子靶基因表达的抑制的功能。

[实施例17]通过抑制miR-122的特异性非规范G：A摆动种子靶基因的表达，证实了抑制肝癌细胞系中细胞迁移的现象

为了检测miR-122的非规范G：A摆动种子靶标在肝癌细胞中的功能，应用miRNA-GU互补识别和抑制相应的非规范G：A摆动种子靶位点转染到肝癌细胞(hepG2)中，然后进行伤口愈合测定，以检查肝癌细胞特性之间的对癌症转移很重要的细胞迁移能力如何变化。

肝细胞系(hepG2)的伤口愈合测定是通过以下进行的：首先合成互补识别基于miR-122 5’末端的非规范2G：A摆动种子靶标、非规范3G：A摆动种子靶标或非规范2,3G：A摆动种子靶标的带有相应序列的miRNA-GU，以与上述实施例相同的方式将所得序列转染到hepG2细胞中，在培养24小时后使用1,000μl吸头在细胞层中产生划痕，将细胞孵育至48小时，然后观察实验组中的细胞迁移情况，并与对照NT-6pi转染的细胞进行比较。测定中使用的诱导干扰的核酸的序列如下：(miR-122：5'-UG GAG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3'；miR-122-G2U：5'-UU GAG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3'；miR-122-G3U：5'-UG UAG UGU GAC AAUGGU GUU UG-3'；miR-122-G2,3U：5'-UU UAG UGU GAC AAU GGU GUU UG-3')。

结果，在对照NT-6pi和miR-122转染的情况下，在48小时的细胞培养中，可以观察到几乎完全填满划痕的细胞迁移。但是，在转染了miR-122-G2U和miR-122-G2,3U siRNA的实验组中，可以看到细胞迁移受到抑制，而这种抑制现象在miR-122-G2,3U siRNA转染的实验组中表现得最为明显(图17A)。如定量测量的，在miR-122-G2U和miR-122-G2,3U siRNA的情况下，与对照相比，证实了细胞迁移被抑制了2-3倍(图17B)。进行定量分析以在细胞形态方面观察miR-122介导的细胞迁移，并使用ImageJ程序(NIH)分析观察结果。另外，作为miR-122-G3U siRNA诱导的细胞迁移的实验结果，未观察到miR-122-G3U的细胞迁移抑制功能(图17C和17D)。

基于此，可以看出，miR-122介导的非规范G：A摆动种子靶标的抑制作用抑制了肝癌细胞的迁移，表明在第二个碱基处的G：A摆动优先发挥了抑制作用，当在第3个碱基处添加G：A摆动时，诱导了细胞迁移抑制功能的增强。

[实施例18]通过调节miR-122-G2,3U介导的非规范G：A摆动种子靶标来确认细胞周期停滞

细胞迁移与细胞分裂密切相关，并且被广泛观察到，尤其在癌细胞中被广泛观察到(Cancer research，2004，64(22)：8420-8427)。因此，为了确认miR-122-G2,3U诱导的肝癌细胞迁移的抑制是否与细胞周期的调节有关，以与实施例12相同的方式进行流式细胞术。在此，在将NT-6pi，miR-122，miR-122-G2U，miR-122-3U和miR-122-G2,3U递送至肝癌细胞系(HepG2)后，测量每种细胞的细胞周期，结果发现，在miR-122-G2,3U转染的实验组中，已证实与对照组(NP-6pi)相比，G0/G1期细胞的比例平均提高了52％至68％，G2/M期细胞分布非常低(图18)。但是，与对照组相比，在miR-122，miR-122-G2U和miR-122-G3U的情况下，未观察到显著差异。在此，通过将合成的相应的siRNA双链体以50nM递送到HepG中并孵育24小时来进行细胞周期分析。根据制造商的实验规程，使用Muse细胞周期试剂盒(目录号MCH100106，Millipore)和Muse细胞分析仪(Millipore)进行分析。

因此，证实了由miR-122-G2,3U调节的癌细胞功能减少了细胞分裂(G2/M)，并诱导了细胞周期停滞(G0/G1)，并且该实施例的结果可以解释为miR-122通过基于5'末端在G2和G3上的G：A摆动配对识别非规范GA摆动种子位点，并具有防止肝癌细胞周期进展的功能。

[实施例19]观察通过调节miR-122-G2,3U、miR-122-G2,7U诱导的非规范G：A摆动种子靶标而诱导的细胞周期停滞

在实施例17中在非规范G：A摆动种子靶标上的miR-122功能已确定为miR-122-G2,3U具有抑制肝细胞迁移的功能，尤其是，观察到当将G3的调节作用被添加到第2个碱基的生物学功能上以调节非规范G：A摆动种子靶标时，由miR-122-G2,3U的表达诱导的细胞迁移的抑制作用达到最大(图17)。因此，为了检查通过miR-122中G2、G3和G7的额外组合是否改变了抑制非规范G：A摆动种子靶标的生物学功能，进行用于进一步确认miR-122-G7U、miR-122-G3,7U或miR-122-G2,7U siRNA的细胞周期调控功能的实验。

在此，为了进行实验，以与上述相同的方式使用肝癌细胞系(HepG2)，并以与上述实施例18相同的方式制备相应的miRNA-GU双链体，并以50nM转染到细胞中。然而，在该细胞周期观察中，在24小时培养后，将细胞用100mg/mL的诺考达唑处理16小时，使处于G2/M期(分裂准备期/分裂期)的HepG2细胞同步，并且使用Muse细胞分析仪(Millipore)根据在G2/M期被捕获的细胞数来测量处于G0/G1期处于细胞周期停滞状态的细胞的数量(图19)。

结果，可以确认在miR-122-G2U的情况下，与对照NT-6pi相比，在细胞周期停滞状态即G0/G1，细胞数没有差异，但是对于miR-122-G2,3U siRNA和miR-122-G2,7U siRNA，除了G2以外，还调节了非规范的G：A摆动种子靶位点时，细胞周期停滞状态(G0/G1)的细胞的比例增加(图19A)。然而，miR-122-G3,7U没有显示出显著的增加(图19A)。根据定量分析，在miR-122-G2,3U siRNA转染的实验组中，与对照组相比，处于细胞周期停滞状态(G0/G1)的细胞比例增加了约2倍或更多，并且在miR-122-G2,7U实验组的情况下，观察到处于细胞周期停滞状态(G0/G1)的细胞比例增加了约1.5倍(图19B)。

基于以上，证实了通过调节由miR-122-G2,3U siRNA和miR-122-G2,7U siRNA介导的非规范G：A摆动种子靶标可以增加细胞周期停滞。

[实施例20]观察由let-7a-G2U和let-7a-G2,4U介导的非规范G：A摆动种子靶标的调控诱导的细胞周期停滞诱导

作为具有肿瘤抑制功能的代表性miRNA，有let-7家族。由于已经报道了调节秀丽隐杆线虫的发育过程的功能(Nature，2000，403(6772)：901-906)，并且其在各种癌细胞中的表达被抑制(Cancer Res.,2004,64(11):3753-3756)和通过调节肿瘤发生的抗癌功能(Cell,2005,120(5):635-647；Genes Dev.2007,21(9):1025-1030)，据此let-7家族已被研究为具有潜在的癌症诊断和抗癌药开发潜力的重要基因。因此，本发明人进行了实验以检查由抑制let-7的非规范G：A摆动种子靶诱导的生物学功能。

let-7a的5’末端第1至9个碱基的种子序列为5'-UGA GGU AGU-3'，能够进行G：A摆动碱基配对的G存在于位置2、4、5和8。本发明人着眼于G2和G4，从而以与实施例19相同的方式进行了实验，将它们修改为miRNA-GU以合成序列，并将该序列转染到肝癌细胞系HepG2细胞中，然后检查细胞周期如何受到影响。合成并在实验中使用的let-7的碱基序列如下：(let-7a：5'-U GAG GUA GUA GGU UGU AUA G UU-3'；let-7a-G2U：5'-U UAG GUA GUA GGUUGU AUA G UU-3'；let-7a-G4U：5'-U GAU GUA GUA GGU UGU AUA G UU-3'；let-7a-G2,4U：5'-U UAU GUA GUA GGU UGU AUA G UU-3')。

结果，观察到，在let-7a的情况下，与对照NT-6pi相比，没有显著差异，但是let-7a-G2U和let-7a-G2,4U增加了在G0/G1的细胞周期停滞，let-7-G4U甚至增加了在G2/M的细胞数量，以使细胞周期更快(图20A)。通过对四次重复实验的结果进行量化，可以发现在let-7a-G2U实验组中，与对照组(Nt-6pi)相比，G1/G0期细胞的分布增加了约1.5倍，并且G2/M期细胞的分布减少(图20B)。因此，可以确认对let-7a的非规范2G：A摆动种子靶标的表达的抑制诱导了HepG2细胞的细胞周期停滞。随后，在let-7a种子中存在G4的情况下，通过单个GA摆动(let-7a-G4U)，减少了HepG2细胞的细胞周期停滞诱导，但细胞周期迅速发展到G2/M期，通过诺考达唑药物处理导致大量细胞残留。另外，当在G2和G4(let-7a-G2,4U)都发生G：A摆动时，可观察到HepG2细胞的细胞周期停滞的诱导。在let-7a转染的HepG2细胞中未观察到这种细胞周期停滞(图20B)。因此，抑制在let-7a的G2、以及G2和G4处的非规范G：A摆动种子靶标的表达诱导了HepG2细胞的细胞周期停滞，从而证实let-7a具有与发明人完成的HepG2细胞调控所显示的功能完全不同的功能。

根据该实施例，let-7通过抑制基于5'末端的G2处的非规范GA种子位点的基因来促进癌细胞周期停滞，并且可以看出，更优选地，当G2和G4都参与G：A摆动配对时，其作用最大。另外，由于通过基于let-7的5’末端的G4的非规范GA种子位点促进了癌细胞的细胞周期的发展，因此认为将诱导癌细胞的增殖。

[实施例21]使用OCT4启动子报告基因观察到，miR-302-4GU和miR-372-4GU促进了非规范G：A摆动种子靶标介导的抑制诱导的去分化

分化的细胞可以通过若干种转录因子的人工表达再次获得分化能力，并且最终再次获得多能分化能力的细胞，例如胚胎细胞，被称为诱导的多能干细胞。据报道，该技术可以通过将四种因子(Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4)转染到小鼠胚胎纤维母细胞(MEM)中来产生具有分化多样性的诱导型多能干细胞(iPS)，例如干细胞(Cell,2006,126(4):663-676)。类似地，已经报道了可以通过将四种因子(OCT4，SOX2，NANOG和LIN28)递送到人体细胞中来制备iPS(Science，2007，318(5858)：1917-11920)。这个领域具有很高的适用性，因为通过去分化，包括人细胞在内的任何细胞都可以产生允许多能分化的再生可能性，并且在首次发现之后，一直在不断努力提高iPS的生产效率。作为其一部分，据报道，作为用MiRNA诱导的多能干细胞(mirPS)高效诱导多能性的方法之一，已经报道了可以单独使用诸如miR-302a或miR-372等miRNA或与四种因子(Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4)组合使细胞去分化的功能(RNA,2008 14(10):2115-2124；Nat Biotechnol.2011,29(5):443-448)。因此，发明人进行了实验以检验对miR-302a和miR-372的非规范G：A摆动种子靶标的表达的抑制是否可以促进细胞去分化的过程。

首先，为了监测多能性诱导，购买了据报道在干细胞中被激活的Oct4启动子和依赖于该启动子表达的含GFP的质粒(Addgene#21319)(图21A)。当将这种Oct4表达报告载体(pOct4：GFP)转染到分化的宫颈癌细胞(HeLa)中时，GFP不表达，而当相应细胞去分化以获得分化能力时，GFP在Oct4表达报告基因中表达。使用Oct4表达报告载体对已知引起去分化的miRNA(例如miR-302a和miR-372)进行了实验。在miR-302a和miR-372的种子序列中，从5’末端起的第2至第8个碱基的序列为“AA GUG CU”，因此可以在5’末端的G4和G6处产生非规范G:A摆动种子。但是，发明人着眼于G4，通过合成miR-302-G4U或miR-372-G4U进行了实验。

首先，根据制造商的规程，使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)将Oct4表达报告载体(pOct4：GFP)递送到HeLa细胞中，并如以上实施例所述根据Bionia中的人miR-302和miR-372序列的每一个合成引导链和过客链以制备双链体，并使用RNAiMAX试剂(Invitrogen)以50nM顺序递送双链体。另外，以与上述实施例相同的方式，通过用种子中的U替换G碱基来制备对miR-302和miR-372的非规范G：A摆动种子靶标具有特异性的siRNA，然后将其以50nM递送至细胞。本文使用的核酸的碱基序列如下：(miR-302：5'-UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA-3'；miR-302-4GU：5'-UAAUUGCUU CCAUGUUUUGGUGA-3'；miR-302过客链：5'-ACUUAAACGUGGAUGUACUUGCU-3'；miR-372：5'-AAAGUGCUGCG ACAUUUGAGCGU-3'；miR-372-G4U：5'-AAAUUGC UGCGACA UUUGAGCGU-3'和miR-372过客链：5'-CCUCAAAUGUGGAGCACUAUUCU-3')。将转染了报告载体和RNA的HeLa细胞在补充有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen)中孵育14天，并在转染过程中在无抗生素的完全培养基中孵育。

结果，在独立递送miR-302或miR-372的实验组中，与对照组相比，显示了集落形成细胞的生长，但是直到培养14天才观察到显示Oct4启动子活性的GFP表达。但是，在转染了其中miR-302和miR-372的非规范G：A摆动种子靶标被抑制的siRNA的实验组中，观察到GFP表达表现出集落形成细胞的生长以及Oct4启动子的活性(图21B和21C，红色箭头)，并且当抑制miR-302及其非规范G：A摆动种子靶标的siRNA以及miR-372及其非规范G：A摆动种子靶标的siRNA同时递送到细胞中时，能够观察到更密集和更大的表达GFP的细胞集落(图21B和21C)。基于此，可以看出，抑制miR-302和miR-372的非规范G：A摆动种子靶标可以促进细胞去分化并通过Oct4表达获得分化能力。

根据此实施例，可以观察到，与通过单独表达常规miR-372和miR-302引起细胞去分化的诱导相比，miR-372-G4U和miR-302a-G4U可以更有效地促进细胞去分化，因此可以看出，miR-372-G4U和miR-302a-G4U可用作促进细胞去分化的材料。

[实施例22]确认其中基于5’末端的第6个碱基处的2’OMe修改不抑制相应RNA干扰衍生物的非规范成核凸起靶标的现象

在上述实施例中，非规范成核凸起靶标具有与规范种子靶标完全不同的新颖生物学功能，因此，发明了诱导RNA干扰的核酸miRNA-BS，其仅调节对非规范成核凸起靶标的表达的抑制，然后证实了其功能。但是，在miRNA-BS的情况下，可以确认，为了互补地排列常规miRNA的非规范成核凸起位点，应对其种子序列进行修改，但可能会通过修改后的种子序列再次产生新颖的成核凸起位点。因此，已知需要一种技术，其中诱导RNA干扰的核酸例如miRNA-BS仅识别规范的种子序列，而不识别非规范的成核凸起位点。因此，发明人进行了实验以降低在6位配对强度，着眼于基于5’末端的6位碱基对非规范成核凸起配对的种子序列很重要，并且非规范成核凸起配对的程度可根据6位碱基的配对强度而变化。也就是说，在miR-124第6个核苷酸的核糖基环的2'位添加了甲基(2'OMe)，并通过荧光素酶报告基因分析观察到修改的诱导干扰的核酸(miR-124-6me)是否具有抑制miR-124的非规范成核凸起靶标的功能。通过合成(Bionia)制备2’OMe修改的miR-124，并以与实施例2相同的方式进行荧光素酶报告基因测定，以通过IC

结果，观察到对实施例2中所示的miR-124的非规范凸起靶基因的抑制作用消失，而通过规范种子位点的基因表达抑制仍然表现出优异的抑制作用，其IC

[实施例23]通过RNA-Seq分析确认，基于5’末端在6位的2’OMe修改不会抑制转录组中总的非规范成核凸起靶mRNA

在实施例22中，证实了当将2'OM修改应用于miR-1的第6个核苷酸时，维持了(miR-1-6me)规范种子靶基因的表达的抑制作用，并且非规范成核凸起靶基因表达的抑制作用降低。因此，为了确认发明人所发明的miR-1-6me是否实际上降低了其中所有与miR-1功能相关的基因都被表达的心肌细胞系(h9c2)的转录组中抑制miR-1的非规范性凸起靶基因的功能，将miR-1和miR-1-6me转染到h9c2细胞中，然后进行RNA-Seq分析。以与实施例7相同的方式，使用基于cel-miR-67序列(其是秀丽隐杆线虫的miRNA)中通过无碱基替代(NT-6pi)修改的5’末端的第6个碱基作为实验对照，进行RNA-Seq分析。在此，使用SENSE Total RNA-Seq文库试剂盒(Lexogen)制备了RNA-Seq文库，并使用MiniSeq(Illumina)进行了测序。

然后，将通过分析获得的序列数据FASTAQ文件通过TopHat2程序映射到小鼠基因组序列(m6)，通过Cufflink和Cuffdiff程序计算表达值(FPKM)，将其标准化到转染了对照NT-6pi的h9c2细胞中的结果，然后以log2比率(倍数变化)表达以进行分析。在此，为了分析RNA-Seq结果以确认具有miRNA靶位点的基因的mRNA的数量是否被相应的miRNA的表达抑制，选择具有在3'UTR中的miR-1的规范种子位点的基因(7mer碱基与5’末端第2至第8个碱基的序列配对)，并按相应的miRNA表达依赖性抑制顺序用累积分数相对比分析了分析谱结果(图23A)。结果，证实了与总基因(mRNA)分布相比，miR-1和miR-1-6me都可以很好地抑制在3'UTR中具有miR-1的规范种子位点的基因(种子)。此后，由于也以与上述相同的方式用累积分数分析了在3'UTR中具有miR-1的非规范性凸起位点(nuc，7mer)的基因，通过比较miR-1转染细胞和miR-1-6me转染细胞中相应的靶mRNA的数量，分析miR-1的非典型核膨出靶基因的表达抑制是否降低(图23B)。结果，在miR-1中，当与在miR-1-6me中的表达相比时，观察到与总mRNA相比，非规范成核凸起靶基因仍然被显著抑制，证实了在miR-1-6me中相应的非规范成核凸起靶基因表达的抑制作用降低了。

根据上述实施例的结果，可以看出，在转录组水平上的常规miRNA有效地抑制了具有常规的规范种子靶基因的非规范的凸起靶基因，而其中2'OMe修改应用于第6个核苷酸的miRNA(miRNA-6me)仍抑制了规范的种子靶基因，而不是非规范的凸起靶基因。因此，在通过将应用于5'末端第6个碱基的2'OMe修改施加到miRNA-BS而保留仅特异性抑制相应miRNA的非规范成核凸起位点的最初意图时，可以通过完全消除了可能新出现的非规范成核凸起配对将其副作用最小化。

[实施例24]通过Ago HITS CLIP测定法鉴定miRNA与非规范成核凸起位点的结合

为了鉴定可应用本发明的用于特异性识别并抑制miRNA的非规范成核凸起位点的miRNA，通过在转录组水平上分析miRNA靶标的方法(即Ago HITS CLIP测定法)分析结果，鉴定了与非规范成核凸起位点结合的miRNA。首先，以与实施例10中相同的方式对从出生后13天(p13)的小鼠的大脑皮层获得的Ago HITS-CLIP数据进行测序，确认与Argonaute结合的前20个表达的miRNA与靶mRNA的非规范成核凸起位点结合(图24A)。因此，当相应的miRNA(图24B)通过种子区域中的碱基序列识别靶mRNA时，可以看出miRNA可以通过种子部分进行的规范碱基配对以及非规范成核凸起位点而与靶mRNA结合。

扩展该实施例的小鼠Ago HITS-CLIP数据分析，以与上述实施例相同的方式分析了从人脑和心脏组织获得的其他Ago HITS-CLIP结果(Boudreau RL等人,2014,Neuron,81(2)294-305,Spengler RM等人,2016,Nucleic Acids Res,44(15)7120-7131)，并计算了Ago和相应的miRNA相互作用的规范种子位点和非规范成核凸起位点的频率(人脑miRNA，表1；人心脏miRNA，表2)。

[表1]

[表2]

结果，可以确认表(表1和表2)中列出的miRNA与相应组织中的非规范成核凸起位点结合。因此，当总结通过实施例中的Ago HITS-CLIP测定获得的所有数据，从而鉴定miRNA，然后将用于修改非规范成核凸起位点以识别为规范种子位点的本发明应用于miRNA时，如下面的表3所示，总共426个序列(BS序列)中的每一个由基于RNA干扰核酸的5'末端的第2至第7个核苷酸组成，并且修改的RNA干扰核酸将特异性结合到相应的miRNA的非规范性凸起靶标，并仅展示相应的功能。

[表3]

通过以上实施例中的Ago HITS-CLIP测定，鉴定了在若干个组织细胞中与非规范凸起靶标结合的miRNA，并且当应用用于修改miRNA以将非规范成核凸起位点识别为规范种子位点的本发明时，总共制备了426个序列(BS序列)，因此，完成了仅表现出抑制miRNA的非规范靶标功能的技术。

[实施例25]分析癌症患者的miRNA序列数据库(TCGA)中的序列变异，从而鉴定miRNA与非规范G：A摆动种子位点的结合

根据以上实施例，证实了miRNA结合非规范G：A摆动位点，从而抑制了靶基因的表达，因此，在本发明中，开发了修改序列以识别非规范G：A摆动位点作为规范种子位点的miRNA序列修改方法(miRNA-BS)。如果通过常规miRNA种子序列中的G与靶mRNA的A之间的摆动配对来改变miRNA功能，则基于这样的想法：通过miRNA的序列变异，这种机制可以显示在诸如肿瘤等疾病中，分析了癌症患者组织的miRNA测序结果(miRNA-Seq)。在此，从癌症患者的与miRNA测序相关的TCGA数据库中获得了8105个序列，另外，从Gene ExpressionOmnibus(GEO)数据库中通过与癌症相关的miRNA测序获得了468个序列，由此获得的总共8573个肿瘤miRNA测序结果使用bowtie2程序以与实施例10相同的方式进行定位，然后分析具有变异的位点。此时，用于每种癌症类型的分析中使用的miRNA测序数据如图25A所示。

通过基于miRNA的5'末端的位置对变异分数进行分类来检查频率最高的变异(前10,000个)和最低变异(后10,000个)的分布的结果(图25B)，可以观察到频率最高的变异(前10,000个)主要发生在miRNA的种子区域(第2至第8个碱基之间)。另外，检查热图(图25C)上频率最高的变异(前100个)和最低变异(倒数(bottom)100个)，可以看出，如以上实施例中那样，变异集中在种子区域中。通过用A，T，C和G分析miRNA的逆转录来检查DNA测序结果，在种子序列中仅在G处检测到了倾向于在种子区域显示的肿瘤miRNA序列变异(图25D)。除了前100个变异以外，所有变异主要发生在G处，由此也证实了这种趋势(图25E)。

这可能是一种现象，其中识别发明人注意的非规范G：A摆动的miRNA的G变为U，以更紧密地与另一侧的靶mRNA的A结合，并且作为分析显示出较高变异率的碱基G被改变的结果(图25F)，在通过逆转录用DNA测序miRNA的大多数相应结果中，观察到G改变为T。该结果表明针对种子区域中存在的G通过将其G更改为U，miRNA与靶标中的A配对，以很好地识别非规范G：A摆动种子靶标作为实际癌症组织中的规范种子，因此，这种类型的变异表明如何将本发明中开发的允许将非规范G：A摆动种子序列识别为规范种子序列的测序方法应用到在哪个miRNA的哪个位置的哪个G。因此，将所有结果放在一起，选择了每名癌症患者的标准化变异频率为2或更高的miRNA(请参阅表4)。如表4所示，设计了总共335个序列(序列(G>U))以在基于RNA干扰核酸的5'末端的第2个核苷酸具有变异，并且修改的RNA干扰核酸将仅与相应miRNA的非规范G：A凸起靶标相互作用，并仅表现出相应功能。

[表4]

通过实施例中的miRNA测序变异分析，鉴定了在各种癌症患者中识别非规范G：A摆动种子靶标为规范靶标的变体miRNA，因此，当应用本发明(miRNA-GU)用于修改miRNA序列以识别非规范G：A摆动种子位点为规范种子位点时，总共制备了335个序列(序列(G>U))(表4)，从而完成了仅展示抑制miRNA的非规范靶标的功能的技术。

[工业实用性]

当使用根据本发明的诱导干扰的核酸时，通过抑制常规miRNA的非规范靶基因所表现出的生物学功能可以被有效地改善，或者可以选择性地表现出常规miRNA的功能的一部分，即仅通过抑制非规范靶基因表现出的生物学功能。另外，细胞周期，分化，去分化，形态，迁移，增殖或凋亡可通过诱导干扰的核酸来调节，因此有望用于各种领域，例如药物，化妆品等领域。