乙酰辅酶A羧化酶2反义寡核苷酸

摘要

本发明提供了靶向人ACC2前体mRNA“外显子12”的5’剪接位点的肽核酸衍生物。本发明的肽核酸衍生物在细胞中强烈诱导人ACC2 mRNA的剪接变体，并且对于治疗与人ACC2蛋白相关的皮肤衰老状况或病症非常有用。

说明书

技术领域

本发明涉及肽核酸衍生物，其互补地靶向人乙酰辅酶A羧化酶2前体mRNA(pre-mRNA)，以改善由乙酰辅酶A羧化酶2介导的皮肤衰老。

背景技术

由于衰老的迹象在皮肤中最明显，因此皮肤衰老受到了相当的关注。皮肤衰老始于20多岁中期或后期，皮肤中的胶原蛋白和弹性蛋白减少，导致皮肤干燥及弹性低以及甚至导致皱纹。肥胖是一种炎症反应，由体内脂肪过多沉积引起的血液循环下降所致。血管上的内部脂肪抑制血液循环和各种激素的分泌，从而促进包括皮肤在内的整个机体的衰老。从这个意义上讲，与肥胖有关的健康状况和疾病必须监控，以使皮肤健康美丽。

脂肪酸的生物合成和降解根据生理条件被很好调节，以满足机体需求。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是一种生物素依赖性酶，其催化乙酰辅酶A的羧化反应生成丙二酰辅酶A，这是脂肪酸生物合成第一阶段的限速步骤。

ACC具有以两种方式控制脂肪酸代谢的功能。ACC的最重要功能是提供丙二酰辅酶A底物，作为处于其活性状态的新组成部分用于脂肪酸生物合成。另一个功能是通过抑制脂肪酸的酰基转移来阻断线粒体中脂肪酸的氧化。

在人类中表达ACC的两种主要同工型，即乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1，ACACA，乙酰辅酶A羧化酶α)和乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2，ACACB，乙酰辅酶A羧化酶β)。两种ACC具有彼此不同功能，即ACC1维持脂肪酸合成调控，而ACC2主要调控脂肪酸氧化。

调控脂肪酸生物合成和氧化的ACC是许多疾病的潜在治疗靶，例如利用细菌和人ACC结构差异的新型抗生素，糖尿病和肥胖的代谢综合征，脂肪生成相关癌细胞生长抑制剂等[Recent Patents Cardiovasc.Drug Discov.Vol 2,162-80(2007)；PLoS One Vol 12,e0169566(2017)]。

其中，在ACC2

考虑到肥胖在皮肤衰老过程中的重要性，基于ACC2表达机制开发可改善和预防皮肤衰老状况的ACC2抑制剂或药物或化妆品是非常令人感兴趣和必要的。

[前体mRNA结构]

剪接是通过在前体mRNA和剪接适体因子之间形成“剪接体E复合体”(即早期剪接体复合体)而启始。在“剪接体E复合体”中，U1结合在外显子N和内含子N的连接处，U2AF

例如，如果ASO与细胞质中的mRNA紧密结合，则ASO可抑制沿着mRNA的核糖体蛋白质合成。ASO需要存在于细胞质中，以抑制其靶蛋白的核糖体蛋白质合成。

原则上，剪接可以通过抑制“剪接体E复合体”的形成而中断。如果ASO与(5’→3’)外显子-内含子的连接处即“5’剪接位点”紧密结合，则ASO阻断前体mRNA与因子U1之间的复合体形成，及因此阻断“剪接体E复合体”的形成。同样，如果ASO紧密结合(5’→3’)内含子-外显子的连接处，即“3’剪接位点”，则不能形成“剪接体E复合体”。

在下图中示意性地说明了3’剪接位点和5’剪接位点。

反映了PTO和DNA主链的结构相似性，其在大多数哺乳动物细胞类型中均难以渗透过细胞膜。但是，对于某些类型的大量表达DNA转运蛋白的细胞，DNA和PTO表现出良好的细胞通透性。已知全身施用的PTO易于分布到肝和肾[Nucleic Acids Res.vol25,3290-3296(1997)]。

为了促进PTO在体外的细胞渗透，脂质转染已被普遍实践。但是，脂质转染会物理性地改变细胞膜，引起细胞毒性，因此对于长期体内治疗应用而言不是理想的。

在过去的30年中，已经对反义PTO和PTO变体进行了临床评估，以治疗癌症、免疫系统疾病、代谢性疾病等[Biochemistry vol 41,4503-4510(2002)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]。部分由于PTO的不良细胞通透性，许多这种反义候选药物尚未成功开发。为了克服不良的细胞通透性，为了治疗活性需要以高剂量施用PTO。然而，已知PTO与剂量限制性毒性有关，包括增加的凝血时间、补体激活、肾小管肾病、Kupffer细胞激活以及免疫刺激，包括脾肿大、淋巴样增生、单个核细胞浸润[Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.vol 33,533-540(2006)]。

已发现许多反义PTO对于肝或肾主要所致疾病示出预期的临床活性。Mipomersen是一种PTO类似物，其抑制apoB-100(参与LDL胆固醇转运的蛋白质)的合成。Mipomersen在动脉粥样硬化患者中表现出预期的临床活性，这很可能是由于其优先分布在肝脏中所致[Circulation vol 118(7),743-753(2008)]。ISIS-113715是一种PTO反义类似物，其抑制蛋白质酪氨酸磷酸1B(PTP1B)的合成，且发现在II型糖尿病患者中示出治疗活性[Curr.Opin.Mol.Ther.vol 6,331-336(2004)]。

与PMO一样，PNA主链无电荷。因此，PNA和RNA之间的结合倾向于比DNA和RNA之间的结合更强。由于PNA在化学结构上与DNA明显不同，因此PNA不会被识别DNA的肝转运蛋白识别，且示出与DNA或PTO不同的组织分布特征。然而，PNA也很难穿透哺乳动物细胞膜[Adv.Drug Delivery Rev.vol 55,267-280(2003)]。

将这种修饰的核碱基掺入PNA类似于脂质转染的情况。通过脂质转染，具有磷酸酯主链的寡核苷酸分子被阳离子脂质分子如lipofectamine包裹，这种lipofectamine/寡核苷酸复合物与裸露的寡核苷酸分子相比倾向于容易透过细胞膜。

除了良好的膜通透性外，还发现这些PNA衍生物对互补核酸具有超强的亲和性。例如，在11-13碱基(13-mer)PNA衍生物上导入4-5个修饰的核碱基，在与互补DNA形成双链体时容易获得20℃或更高的T

发明内容

由于肥胖对皮肤衰老具有深远影响，因此必须监测与肥胖有关的健康状况和疾病以获得健康美丽的皮肤。

关于肥胖的ACC2-/-突变小鼠的研究引起很多关注。另外，尽管据报道ACC siRNA抑制癌细胞系中ACC mRNA和蛋白质的表达，但是siRNA太昂贵以至于不能制造和开发为皮肤的抗衰老剂，更不用说它们向皮肤内递送的挑战了。因此，有必要基于ACC2表达机制来开发可以改善和预防皮肤衰老状况的药物或化妆品。

本发明提供了式I代表的肽核酸(PNA)衍生物或其药学上可接受的盐：

[式I]

其中，

n是10和21之间的整数；

式I的化合物与人ACC2前体mRNA中的18-碱基(18-mer)前体mRNA序列[(5'→3')GGCCAUUUCGUCAGUAUC]具有至少10-碱基互补重叠；

式I的化合物与人ACC2前体mRNA完全互补，或者与人ACC2前体mRNA部分互补，具有一个或两个错配；

S

X和Y独立地代表氢基、氘基、甲酰基[H-C(＝O)-]、氨基羰基[NH

Z代表氢基、氘基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基、或取代或未取代的芳基；

B

B

式I的化合物诱导人ACC2前体mRNA中“外显子12”的跳过(skipping)，产生缺少“外显子12”的人ACC2 mRNA剪接变体，因此可用于抑制转录人ACC2前体mRNA的基因的功能活性。

“n是10和21之间的整数”的条件从字面上意味着n是可以选自整数组11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中的整数。

式I的PNA衍生物中天然或非天然核碱基的化学结构在图1a-1c中举例说明。本发明的天然(即天然存在的)或非天然(天然不存在的)核碱基包括但不限于图1a-1c中提供的核碱基。提供这种非天然核碱基是为了说明容许的核碱基的多样性，因此不应解释为限制本发明的范围。

用于描述式I的PNA衍生物的取代基在图2a-2e中举例说明。图2a提供了取代或未取代的烷基的实例。取代或未取代的烷基酰基和取代或未取代的芳基酰基在图2b中举例说明。图2c示出了取代或未取代的烷基氨基、取代或未取代的芳基氨基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷基磺酰基或芳基磺酰基以及取代或未取代的烷基膦酰基或芳基膦酰基的实例。图2d提供了取代或未取代的烷氧基羰基或芳氧基羰基、取代或未取代的烷基氨基羰基或芳基氨基羰基的实例。在图2e中提供了取代或未取代的烷基氨基硫代羰基、取代或未取代的芳基氨基硫代羰基、取代或未取代的烷氧基硫代羰基以及取代或未取代的芳氧基硫代羰基的实例。提供这样的示例性取代基是为了说明允许的取代基的多样性，因此不应解释为限制本发明的范围。本领域技术人员可以容易理解寡核苷酸序列是寡核苷酸与靶前体mRNA序列在N端或C端的取代基上序列特异性结合的主要因素。

如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所示，式I的化合物与互补DNA紧密结合。式I的PNA衍生物与其全长互补DNA或RNA之间的双链体具有太高的Tm值，以致于不能在水性缓冲液中可靠地确定。式I的PNA化合物与更短长度的互补DNA具有高T

式I的化合物与人ACC2前体mRNA的“外显子12”的5'剪接位点互补结合。[NCBI参考序列：NG_046907]。16-碱基序列[(5'→3')GCCAUUUCGUCAGUAU]跨越人ACC2前体mRNA中“外显子12”和“内含子12”的连接处，由来自“外显子12”的8-碱基和来自“内含子12”的8-碱基组成。因此，16-碱基前体mRNA序列通常可表示为[(5'→3')GCCAUUUC┃gucaguau]，其中外显子和内含子序列分别以“大写”和“小写”字母表示，外显子-内含子连接处用“┃”表示。前体mRNA的常规表示形式由30-碱基序列[(5'→3')GGAAGAGGCCAUUUC┃gucaguaucuccuuc]进一步说明，该序列跨越人ACC2前体mRNA中的“外显子12”和“内含子12”的连接处。

式I的化合物与从人ACC2基因转录的人ACC2前体mRNA的靶5'剪接位点紧密结合，并干扰“剪接体早期复合体”的形成，产生缺少“外显子12”(外显子12跳过)的ACC2mRNA剪接变体。

即使当PNA衍生物与ACC2前体mRNA中的靶5'剪接位点具有一或两个错配时，强RNA亲和性也允许式I的化合物诱导ACC2“外显子12”跳过。类似地，式I的PNA衍生物仍可在在靶剪接位点具有一个或两个SNP(单核苷酸多态性)的ACC2突变体前体mRNA中诱导ACC2“外显子12”跳过。

式I的化合物具有良好的细胞通透性，及可以作为“裸”寡核苷酸容易地递送到细胞中，如现有技术[PCT/KR2009/001256]所示。因此，本发明的化合物在ACC2前体mRNA中诱导“外显子12”跳过，及在用式I的化合物作为“裸”寡核苷酸处理的细胞中产生缺少ACC2“外显子12”的ACC2 mRNA剪接变体。式I的化合物不需要任何手段或配制即可递送到细胞中以在细胞中有效诱导靶外显子跳过。在用本发明化合物作为“裸”寡核苷酸以亚飞摩尔浓度处理的细胞中，式I的化合物容易诱导ACC2“外显子12”跳过。

由于良好的细胞或膜通透性，式I的PNA衍生物可以作为“裸”寡核苷酸表面施用，以诱导皮肤中ACC2“外显子12”的跳过。式I的化合物不需要为指定的治疗或生物学活性而配制以增加透皮输送至靶组织中。通常，将式I的化合物溶于水和共溶剂中，以亚皮摩尔浓度表面或透皮施用，以在靶皮肤中引起所需的治疗或生物学活性。本发明的化合物不需要重度或侵入性配制以引起表面治疗活性。然而，式I的PNA衍生物可以与化妆品成分或佐剂一起配制成表面用乳膏或洗剂。这种表面用化妆乳膏或洗剂可用于处理皮肤衰老。

本发明的化合物可以以1aM至高于1nM的治疗或生物学有效浓度表面施用给对象，所述浓度可根据给药方案、对象的状况或状态等而变化。

式I的PNA衍生物可以被不同地配制，包括但不限于注射剂、鼻喷雾剂、透皮贴剂等。另外，式I的PNA衍生物可以以治疗有效剂量施用给对象，所述施用剂量可以根据适应症、施用途径、给药方案、对象的状况或状态等而变化。

式I的化合物可以与药学上可接受的酸或碱组合使用，所述酸或碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、盐酸、甲磺酸、柠檬酸、三氟乙酸等。

式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐可以与药学上可接受的佐剂组合施用给对象，所述佐剂包括但不限于柠檬酸、盐酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、异丙醇、碳酸氢钠、蒸馏水、防腐剂等。

感兴趣的是式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐：

其中，

n是10-21之间的整数；

式I的化合物与人ACC2前体mRNA中的18-碱基前体mRNA序列[(5'→3')GGCCAUUUCGUCAGUAUC]具有至少10-碱基互补重叠；

式I的化合物与人ACC2前体mRNA完全互补，或者与人ACC2前体mRNA部分互补，具有一个或两个错配；

S

X和Y独立地表示氢基、氘基、甲酰基[HC(＝O)-]、氨基羰基[NH

Z代表氢基、羟基、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、或者取代或未取代的氨基；

B

B

其中，

R

L

[式V]

其中，

Q

Q

m是1和15之间的整数。

高度感兴趣的是式I的PNA寡聚物，或者其药学上可接受的盐：

其中，

n是11和16之间的整数；

式I的化合物与人ACC2前体mRNA中的18-碱基前体mRNA序列[(5'→3')GGCCAUUUCGUCAGUAUC]具有至少10-碱基互补重叠；

式I的化合物与人ACC2前体mRNA完全互补；

S

X和Y独立地代表氢基、取代或未取代的烷酰基或者取代或未取代的烷氧基羰基；

Z代表取代或未取代的氨基；

B

B

R

Q

Q

m是1和9之间的整数。

更高度感兴趣的是式I的PNA衍生物，或者其药学上可接受的盐：

其中，

n是11和16之间的整数；

式I的化合物与人ACC2前体mRNA中的18-碱基前体mRNA序列[(5'→3')GGCCAUUUCGUCAGUAUC]具有至少10-碱基互补重叠；

式I的化合物与人ACC2前体mRNA完全互补；

S

X是氢基；

Y代表取代或未取代的烷氧基羰基；

Z代表取代或未取代的氨基；

B

B

R

L

L

特别感兴趣的是式I的PNA衍生物，其选自以下提供的化合物组(以下分别称为ASO1、2、3、4、5和6)或其药学上可接受的盐：

(N→C)Fethoc-CTG(6)-ACG(6)-AA(5)A-TG(6)G-C(1O2)C-NH

(N→C)Fethoc-TA(5)C(1O2)-TGA(5)-CGA(5)-AA(5)T-G(6)GC(1O2)-C-NH

(N→C)Fethoc-TA(5)C-TG(5)A-C(1O2)GA(5)-AA(5)T-G(5)G-NH

(N→C)Fethoc-AC(1O2)T-GA(5)C-GA(5)A-A(5)TG(5)-GC(1O2)-NH

(N→C)Fethoc-CTG(6)-AC(1O2)G-A(5)AA(5)-TG(6)G-NH

(N→C)Fethoc-CTG(6)-AC(1O2)G-A(5)AA(5)-TG(6)G-C(1O2)C-NH

其中，

A、G、T和C是分别具有天然核碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶的PNA单体；

C(pOq)、A(p)和G(p)是具有分别由式VI、式VII和式VIII代表的非天然核碱基的PNA单体；

其中，

p和q是整数，例如在ASO 4情况中p是1或5且q是2；以及

“Fethoc-”是"[2-(9-芴基)乙基-1-氧基]羰基"的缩写，“-NH

图3总体明确地提供了缩写为A、G、T、C、C(pOq)、A(p)和G(p)的PNA单体的化学结构。如现有技术[PCT/KR2009/001256]中所讨论的，由于C(pOq)与“鸟嘌呤”杂交而被认为是“修饰的胞嘧啶”PNA单体。由于A(p)与“胸腺嘧啶”杂交而被认为是“修饰的腺嘌呤”PNA单体，以及由于G(p)与“胞嘧啶”杂交而被认为是“修饰的鸟嘌呤”PNA单体。另外，为了示例说明用于这种PNA衍生物的缩写，在图4中提供了ASO 1"(N→C)CTG(6)-ACG(6)-AA(5)A-TG(6)G-C(1O2)C-NH

ASO 1等价于DNA序列“(5'→3')CTG-ACG-AAA-TGG-CC”，与前体mRNA互补结合。14-碱基PNA与跨越人ACC2前体mRNA中“外显子12”与“内含子12”连接处的30-碱基RNA序列

在一些实施方案中，本发明提供了在对象中治疗与人ACC2基因转录相关的状况或病症的方法，包括给对象施用本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗对象皮肤衰老的方法，包括给对象施用本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗与人ACC2基因转录有关的状况或病症的药物组合物，其包含本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗与人ACC2基因转录相关的状况或病症的化妆品组合物，其包含本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗皮肤衰老的药物组合物，其包含本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗皮肤衰老的化妆品组合物，其包含本发明的肽核酸衍生物或其药学上可接受的盐。

发明效果

可以通过施用式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐治疗与人ACC2基因转录有关的状况或病症。

可以通过施用式I的PNA衍生物或其药学上可接受的盐治疗皮肤衰老。

附图简述

图1a-1c：式I的肽核酸衍生物可选择的天然或非天然(修饰的)核碱基实例。

图2a-2e：式I的肽核酸衍生物可选择的取代基实例。

图3：具有天然或修饰的核碱基的PNA单体的化学结构。

图4：“ASO 1”的化学结构。

图5：用于合成本发明的PNA衍生物的Fmoc-PNA单体的化学结构。

图6a-6b：分别在HPLC纯化之前和之后的“ASO 1”的C

图7：通过C

图8：C2C12中“ASO 1”所致ACC2 mRNA的外显子跳过。

图9：C2C12中“ASO 1”对ACC2 mRNA水平的抑制。

图10：C2C12中“ASO 6”对ACC2 mRNA水平的抑制。

图11：C2C12中“ASO 5”对ACC2 mRNA水平的抑制。

实施本发明的最佳方式

制备PNA寡聚物的一般程序

根据现有技术[US6,133,444；WO96/40685]公开的方法略加修改，基于Fmoc-化学通过固相肽合成(SPPS)合成PNA寡聚物。Fmoc是{(9-芴基)甲氧基}羰基。本研究中使用的固体支持物是购自PCAS BioMatrix Inc.(Quebec,Canada)的H-Rink Amide-ChemMatrix。如现有技术[PCT/KR 2009/001256]中所述或稍作修改，合成具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体。具有修饰的核碱基的这种Fmoc-PNA单体和具有天然存在的核碱基的Fmoc-PNA单体被用于合成本发明的PNA衍生物。通过C

方案1示例了这项研究的SPPS中采用的典型单体延伸循环，其合成细节如下提供。然而，对于本领域技术人员而言，在自动肽合成仪或手动肽合成仪上有效地进行这种SPPS反应显然有许多小变化。方案1中的每个反应步骤简述如下。

[方案1]

[H-Rink-ChemMatrix树脂的活化]当树脂上的胺未用Fmoc保护时，将在1.5mL的20％哌啶/DMF中的0.01mmol(接近于20mg树脂)ChemMatrix树脂在Libra管中涡旋20分钟，滤出DeFmoc溶液。将树脂用1.5mL二氯甲烷(MC)、1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)、1.5mL MC、1.5mL DMF和1.5mL MC相继各洗涤30秒。将在固体支持物上的所得游离胺与Fmoc-PNA单体进行偶联。

[DeFmoc]当树脂上的胺用Fmoc保护时，将在1.5mL的20％哌啶/DMF中的0.01mmol(接近于20mg)树脂的悬浮液涡旋7分钟，然后滤出DeFmoc溶液。将树脂用1.5mL MC、1.5mLDMF、1.5mL MC、1.5mL DMF和1.5mL MC相继各洗涤30秒。将在固体支持物上的所得游离胺立即与Fmoc-PNA单体偶联。

[与Fmoc-PNA单体偶联]如下所述将固体支持物上的游离胺与Fmoc-PNA单体偶联。将0.04mmol的PNA单体、0.05mmol的HBTU和0.1mmol的DIEA在1mL无水DMF中温育2分钟，与游离胺一起加入树脂中。将该树脂溶液涡旋1小时，并滤去反应介质。然后将树脂相继用1.5mLMC、1.5mL DMF和1.5mL MC各洗涤30秒。图5提供了本发明中使用的具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体的化学结构。图5提供了具有修饰的核碱基的Fmoc-PNA单体作为例子，因此不应视为限制本发明的范围。本领域技术人员可容易地理解Fmoc-PNA单体的多种变化形式以合成式I的PNA衍生物。

[加帽]在偶联反应后，通过在1.5mL加帽溶液(在DMF中5％乙酸酐和6％的2,6-leutidine)中振摇5分钟将未反应的游离胺加帽。然后滤去加帽溶液，相继用1.5mL MC、1.5mL DMF和1.5mL MC各洗涤30秒。

[在N末端导入Fethoc基团]通过如下方法使树脂上的游离胺与“Fethoc-OSu”反应，将“Fethoc-”基团导入N末端。将所述树脂在于1mL无水MDF中的0.1mmol的Fethoc-OSu和0.1mmol DIEA溶液的悬浮液涡旋1小时，并将溶液滤出。将树脂用1.5mL MC、1.5mL DMF和1.5mL MC相继各洗涤30秒。本发明中使用的“Fethoc-OSu”[CAS No.179337-69-0，C

[从树脂裂解]通过在1.5mL裂解溶液(在三氟乙酸中2.5％三异丙基硅烷和2.5％水)中摇动3小时，将与树脂结合的PNA寡聚物从树脂上裂解。滤去树脂，并将滤液减压浓缩。将所得残余物用乙醚研磨，通过过滤收集所得沉淀物，以通过反相HPLC纯化。

[HPLC分析和纯化]从树脂上裂解后，通过C

为了互补靶向人ACC2前体mRNA中“外显子12”的5’剪接位点，根据以上提供的合成方法或稍加修改制备本发明的PNA衍生物。提供靶向人ACC2前体mRNA的这种PNA衍生物是为了例证式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。

[表1]互补靶向人ACC2前体mRNA中“外显子12”的5'剪接位点的PNA衍生物以及通过质谱分析的结构鉴定数据。

表1提供了互补靶向从人ACC2基因[NCBI参考序列：NG_046907]中读出的人ACC2前体mRNA中“外显子12”的5′剪接位点的PNA衍生物，以及通过质谱分析的结构鉴定数据。提供表1中的本发明的肽核酸衍生物是为了举例说明式I的PNA衍生物，不应解释为限制本发明的范围。

“ASO 1”具有与跨越人ACC2前体mRNA中“外显子12”与“内含子12”连接处的30-碱基RNA序列

评估式I的PNA衍生物与互补靶向N-末端或C-末端的10-碱基DNA的结合亲和性。通过PNA与10-碱基互补DNA之间的双链体的T

如下所述在UV/Vis光谱仪上确定T

如表2所示，观测的式I的PNA衍生物对于与10-碱基DNA的互补结合的T

[表2]PNA与靶向PNA的N末端或C末端的10-碱基互补DNA的T

例如，“ASO 1”示出与靶向在

通过使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)等，评估本发明中的PNA衍生物在C2C12骨骼肌细胞中的体外ACC2反义活性。提供生物学实施例只是举例说明式I的PNA衍生物的生物学概况，因此不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：在C2C12中“ASO 1”诱导的外显子跳过

如下文所述评估“ASO 1”在C2C12细胞中诱导ACC2“外显子12”跳过的能力。

[细胞培养与ASO处理]在含有补加了10％FBS(胎牛血清)(目录号10099-41，GIBCO)和1％链霉素/青霉素(目录号15140-122，GIBCO)的DMEM培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基：DMEM)(目录号12-604F，Lonza)的60mm培养皿中在5％CO

[RNA提取与巢式PCR]使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，目录号714106)根据制造商说明从“ASO 1”处理的细胞中提取总RNA并通过使用SuperScript

[外显子跳过产物电泳鉴别]将PCR产物(10微升)在2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。收集来自“ASO 1”处理的靶条带并通过Sanger测序分析以评估外显子跳过序列。

[通过“ASO 1”诱导的外显子跳过]如图8所示，用0.1aM至1fM的“ASO 1”处理的细胞浓度依赖性地产生缺乏外显子11的剪接变体ACC2 mRNA。

实施例2：在C2C12中“ASO 1”对ACC2 mRNA形成的抑制

如下所述通过实时qPCR评估“ASO 1”在C2C12中下调ACC2 mRNA形成的能力。

[细胞培养&ASO处理]将C2C12细胞(目录号CRL-1772，ATCC)保存在补充有10％胎牛血清(目录号10099-41，GIBCO)和1％链霉素/青霉素(目录号15140-122，GIBCO)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，目录号12-604F，Lonza)中，在37℃和5％CO

[RNA提取&cDNA合成]使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，目录号714106)根据制造商说明，从“ASO 1”处理的细胞中提取总RNA，并使用PrimeScript

[定量实时PCR]为评估人ACC2 mRNA的表达水平，使用Taqman探针对合成的cDNA进行实时qPCR。在PCR管中cDNA、Taqman探针(Thermo，Mm01204651)、IQ supermix(BioRad，目录号170-8862)和无核酸酶水的混合物使用CFX96 Touch实时系统(BioRad)根据如下指定的循环条件反应：在95℃进行3分钟(初次变性)，然后进行如下所示50个循环：在95℃进行10秒(变性)和在60℃进行30秒(退火和聚合)。在每个循环结束时测量荧光强度并通过解链曲线评估PCR的结果。用GAPDH将每个基因的阈值循环(Ct)标准化后，比较和分析Ct的变化。

[“ASO 1”降低ACC2 mRNA]从图9中可以看出，与对照实验相比，ACC2 mRNA的量在100zM至1fM的“ASO 1”处理时浓度依赖性地降低，在用1fM的“ASO 1”处理时观测到具有统计学显著性的30％降低。(进行了Student T检验以检测所述发现结果的统计学显著性)。

实施例3：在C2C12中“ASO 6”对ACC2 mRNA形成的抑制

如下所述通过实时qPCR评估“ASO 6”在C2C12中下调ACC2 mRNA形成的能力。

[细胞培养&ASO处理]将C2C12细胞(目录号CRL-1772，ATCC)保存在补充有10％胎牛血清(目录号10099-41，GIBCO)和1％链霉素/青霉素(目录号15140-122，GIBCO)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，目录号12-604F，Lonza)中，在37℃和5％CO

[RNA提取&cDNA合成]使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，目录号714106)根据制造商说明，从“ASO 6”处理的细胞中提取总RNA并使用PrimeScript

[定量实时PCR]为评估人ACC2 mRNA的表达水平，使用Taqman探针对合成的cDNA进行实时qPCR。在PCR管中cDNA、Taqman探针(Thermo，Mm01204651)、IQ supermix(BioRad，目录号170-8862)和无核酸酶水的混合物使用CFX96 Touch实时系统(BioRad)根据如下指定的循环条件反应：在95℃进行3分钟(初次变性)，然后进行如下所示50个循环：在95℃进行10秒钟(变性)和在60℃进行30秒钟(退火和聚合)。在每个循环结束时测量荧光强度并通过解链曲线评估PCR的结果。用GAPDH将每个基因的阈值循环(Ct)标准化后，比较和分析Ct的变化。

[“ASO 6”降低ACC2 mRNA]从图10中可以看出，ACC2 mRNA的量在经100zM至1fM的“ASO 6”处理时浓度依赖性地降低。与对照实验相比，在用1aM和1fM的“ASO6”处理时观测到分别具有统计学显著性的30％和50％的降低。(进行了Student T检验以检测所述发现结果的统计学显著性)。

实施例4：在C2C12中“ASO 5”对ACC2 mRNA形成的抑制

如下所述通过相同方法评估“ASO 5”。

[细胞培养&ASO处理]将C2C12细胞(目录号CRL-1772，ATCC)保存在补充有10％胎牛血清(目录号10099-41，GIBCO)和1％链霉素/青霉素(目录号15140-122，GIBCO)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，目录号12-604F，Lonza)中，在37℃和5％CO

[RNA提取&cDNA合成]使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，目录号714106)根据制造商说明，从“ASO 5”处理的细胞中提取总RNA并使用PrimeScript

[定量实时PCR]为评估人ACC2 mRNA的表达水平，使用Taqman探针对合成的cDNA进行实时qPCR。在PCR管中的cDNA、Taqman探针(Thermo，Mm01204651)、IQ supermix(BioRad，目录号170-8862)和无核酸酶水的混合物使用CFX96 Touch实时系统(BioRad)根据如下指定的循环条件反应：在95℃进行3分钟(初次变性)，然后进行如下所示50个循环：在95℃进行10秒钟(变性)和在60℃进行30秒钟(退火和聚合)。在每个循环结束时测量荧光强度并通过解链曲线评估PCR的结果。用GAPDH将每个基因的阈值循环(Ct)标准化后，比较和分析Ct的变化。

[“ASO 5”降低ACC2 mRNA]从图11中可以看出，ACC2 mRNA的量在100zM至1fM的“ASO 5”处理时浓度依赖性地降低。与对照实验相比，在用1aM和1fM的“ASO 5”处理时观测到分别具有统计学显著性的30％和42％的降低。(进行了Student T检验以检测所述发现结果的统计学显著性)。

实施例5：含有式I的化合物的润肤露的制备(w/w％)

将式I的化合物例如“ASO 1”配制为润肤露以给对象表面施用。如下所述制备润肤露。鉴于润肤露可能会有很多变化，因此这个制备应作为实例而不应解释为限制本发明的范围。

在单独的烧杯中，将组分A和组分B的混合物质分别在80℃溶解。混合组分A和组分B，使用3,600rpm均化器在80℃乳化5分钟。将乳化的组分C通过50目滤网过滤并将滤过物加入组分A和组分B的混合物中。将所得混合物通过使用3,600rpm均化器在80℃乳化5分钟。在35℃将组分D加入组分A、B和C的混合物中后，将所得混合物用2,500rpm均化器在25℃乳化3分钟。最后确保均匀分散并完全消泡。

[表3]含有式I的化合物的润肤露的组成成分实例(w/w％)

实施例6：含有式I的化合物的面霜的制备(w/w％)

将式I的化合物例如“ASO 1”配制成面霜，用于给对象表面施用。如下所述制备面霜。鉴于表面用乳霜可能有许多变化，这个制备应作为实例而不应解释为限制本发明的范围。

[表4]含有式I的化合物的面霜的组成成分实例(w/w％)

在一个单独的烧杯中，分别在80℃溶解部分A和部分B的混合物质。将部分A和部分B混合并使用3,600rpm均化器在80℃乳化5分钟。在将部分C加入部分A和B的混合物中之后，通过使用3,600rpm均化器在80℃将所得混合物乳化5分钟。将部分D在35℃加入部分A、B和C的混合物中后，将所得混合物在35℃用3,600rpm均化器乳化5分钟。最后确保在25℃均匀分散及完全消泡。

序列表

<110> 奥利通公司

韩璿瑛

成基浩

洪铭涍

姜多映

许情奭

张降愿

<120> 乙酰辅酶A羧化酶2反义寡核苷酸

<130> 2018dp102

<150> KR10-2018-0095124

<151> 2018-08-14

<160> 6

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PNA修饰的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(14)

<223> PNA修饰的寡核苷酸, 人乙酰辅酶A羧化酶2靶向人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 氨基甲酸化N-末端

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (3)..(3)

<223> n是a, g, c或t

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (6)..(6)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (8)..(8)

<223> n是a, g, c或t

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (11)..(11)

<223> n是a, g, c或t

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (13)..(13)

<223> n是a, g, c或t

<400> 1

ctnacnanat ngnc 14

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PNA修饰的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<223> PNA修饰的寡核苷酸, 人乙酰辅酶A羧化酶2靶向人工序列

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (1)..(1)

<223> 氨基甲酸化N-末端

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (2)..(3)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (6)..(6)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

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<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

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<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (13)..(13)

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<221> 修饰的_碱基

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<400> 2

tnntgncgna ntngnc 16

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工

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<223> PNA修饰的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(14)

<223> PNA修饰的寡核苷酸, 人乙酰辅酶A羧化酶2靶向人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 氨基甲酸化N-末端

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (2)..(2)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (5)..(5)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (7)..(7)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (9)..(9)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (11)..(11)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (13)..(13)

<223> n是a, g, c或t

<400> 3

tnctnangna ntng 14

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工

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<223> PNA修饰的寡核苷酸

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<221> misc_feature

<222> (1)..(14)

<223> PNA修饰的寡核苷酸, 人乙酰辅酶A羧化酶2靶向人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 氨基甲酸化N-末端

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (2)..(2)

<223> n是a, g, c或t

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (5)..(5)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (8)..(8)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (10)..(10)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (12)..(12)

<223> n是a, g, c或t

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (14)..(14)

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<400> 4

antgncgnan tngn 14

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工

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<223> PNA修饰的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> PNA修饰的寡核苷酸, 人乙酰辅酶A羧化酶2靶向人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 氨基甲酸化N-末端

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (3)..(3)

<223> n是a, g, c或t

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (5)..(5)

<223> n是a, g, c或t

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (7)..(7)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (9)..(9)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (11)..(11)

<223> n是a, g, c或t

<400> 5

ctnangnant ng 12

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<211> 14

<212> DNA

<213> 人工

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<223> PNA修饰的寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(14)

<223> PNA修饰的寡核苷酸, 人乙酰辅酶A羧化酶2靶向人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 氨基甲酸化 N-末端

<220>

<221> 修饰的_碱基

<222> (3)..(3)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (5)..(5)

<223> n是a, g, c或t

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<222> (7)..(7)

<223> n是a, g, c或t

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<221> 修饰的_碱基

<222> (9)..(9)

<223> n是a, g, c或t

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<223> n是a, g, c或t

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