三角褐指藻叶绿体表达乙酰辅酶A羧化酶促进脂质累积

摘要

生物能源生产的最大瓶颈是原料问题，三角褐指藻由于光合效率高、脂质含量高被视为新一代生物柴油的原料.乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成途径的第一个关键步骤，是脂肪酸合成的限速酶。为了研究三角褐指藻ACCase在脂肪酸合成代谢的作用，本研究构建三角褐指藻叶绿体表达载体,克隆三角褐指藻同质型ACCase基因的ACC-1亚基(PtACC-1)，并实现其在叶绿体的过表达。叶绿体表达载体采用了三角褐指藻的高效启动子PrbcL和终止子TrbeS，构建获得叶绿体高效表达载体pPtc-T。通过限制性内切酶XcmI酶切和TA克隆的连接方法，将报告基因。GFP及目的基因PtACC-1分别导入载体，构建得到重组载体pPtc-eGFP和pPtc-PtACC-1。采用改良的电穿孔技术将载体pPtc-eGFP和pPtc-RACC-1导入三角褐指藻细胞的叶绿体中;通过氯霉素筛选获得阳性转化藻株，挑取阳性单克隆藻株并进行连续继代培养。采用PCR扩增外源基因法以及Southern blot证明了外源基因被成功导入藻细胞内。qPCR和Western blot分析显示转基因三角褐指藻细胞内eGFP得到了高水平表达，PtACC-1的表达水平也显著提高，乙酸辅酶A羧化酶的活性提高了2.3倍。尼罗红染色中性脂分析显示转化pPtc-RACC-1的大肠杆菌的中性脂含量提高了1.36倍，转化pPtc-PtACC-1的三角褐指藻的中性脂含量提高了74.2%。激光扫描共聚焦荧光显微镜和傅里叶红外吸收光谱仪分析结果亦表明脂质含量显著增加。同时，脂肪酸组分比率也发生了显著的变化，其中单不饱和脂肪酸的含量提高了56%，多不饱和脂肪酸的含量降低了25.4%。结果表明PtACC-1在叶绿体内的超表达显著促进了三角褐指藻细胞内脂肪酸的生物合成与积累，为三角褐指藻脂质含量研究及获得适宜生物能源的高油工程藻株提供了实验支撑。