一种蜂蜜真伪检测方法

摘要

本发明公开了一种蜂蜜真伪检测方法，该方法包括以下步骤：S1：材料仪器准备，准备多份待检测的材料和需要使用的相关仪器；S2：预处理，对多份待检测的样品进行预处理；S3：取样检测，对每份待检测的样品均进行取样检测；S4：样品测试，对S3中的样品进行随机测试；S5：二次测试，对S4中的蜂蜜样品再次测试；S6：数据采集，对S5中的样品测试结果进行数据采集；S7：分析数据；该发明采用核磁共振技术对蜂蜜中多组分进行分析，从获得的多核磁信号中提取出鉴定蜂蜜真伪的标记物，同时结合还原糖含量、蔗糖含量和酸度等理化指标以期为蜂蜜真伪判别提供切实可行的方法。

说明书

技术领域

本发明具体涉及蜂蜜检测技术领域，尤其涉及一种蜂蜜真伪检测方法。

背景技术

天然蜂蜜的主要成分是葡萄糖(25.2％～35.3％)、果糖(33.3％～43.0％)、多种氨基酸、矿物质、维生素和多种活性酶。蜂蜜有“大自然中最完美的营养食品”的美誉，具有极高的营养价值和保健作用，深受广大消费者的青睐。由于蜂蜜价格相对较高，实际生产的蜂蜜远远满足不了市场的需求，在巨大的经济利益和市场需求驱动下给不法分子提供了蜂蜜掺假的可乘之机。

现有技术中，薄层色谱是测定高果淀粉糖浆的有效方法。高效液相色谱示差折光法测定蜂蜜中还原糖、蔗糖和麦芽糖的含量，该法可检测蜂蜜中掺杂的麦芽糖浆，对于掺杂果葡糖浆的蜂蜜，该方法无效。

已有的检测方法多针对已有的掺假造假技术而开发，必然落后于造假掺假技术的发展。现有检测手段自身的不足和缺陷给不法分子提供了蜂蜜掺假的可乘之机。综上所述，建立一套灵敏、高效、准确的鉴定蜂蜜真伪的方法已迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的蜂蜜掺假无法充分检测的缺点，而提出的一种蜂蜜真伪检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种蜂蜜真伪检测方法，该方法包括以下步骤：

S1：材料仪器准备，准备多份待检测的材料和需要使用的相关仪器；

S2：预处理，对多份待检测的样品进行预处理；

S3：取样检测，对每份待检测的样品均进行取样检测；

S4：样品测试，对S3中的样品进行随机测试；

S5：二次测试，对S4中的蜂蜜样品再次测试；

S6：数据采集，对S5中的样品测试结果进行数据采集；

S7：分析数据。

进一步的，所述S2过程中，蜂蜜样品的预处理过程包括：将每份待检测的样品蜂蜜分别称取多等份至离心管中，加重水配成等浓度溶液，对蜂蜜进行充分溶解处理，直至体系透明澄清，再对蜂蜜样品进行离心处理，保证无溶液挂壁，然后将离心管内溶液完全转移至核磁共振样品管中，静置，使溶液内糖类构型稳定。

在前述方案的基础上，所述S3过程中，蜂蜜样品的检测方式均为随机检测。

作为本发明再进一步的方案，所述S4过程中，对于S3中的所有蜂蜜样本，均采用重水定标的方式对蜂蜜样本的1H NMR进行分析。

进一步的，所述S5过程中，要对S4中采用过重水定标分析的蜂蜜样品再次测试。

在前述方案的基础上，所述S5中，采用noesypr1d脉冲序列抑制蜂蜜中水的共振信号，在600MHz核磁共振波谱仪上进行1H NMR测试，测试温度为290-310K，利用D2O进行锁场；且每次样品测定前都进行调谐、匀场；信号累加10-20次，空扫次数1-3次，采用noesypr1d脉冲序列抑制蜂蜜中水的共振信号扫描次数为30-50次。

本发明的有益效果为：

本发明采用核磁共振技术对蜂蜜中多组分进行分析，从获得的多核磁信号中提取出鉴定蜂蜜真伪的标记物，同时结合还原糖含量、蔗糖含量和酸度等理化指标以期为蜂蜜真伪判别提供切实可行的方法，避免了现有技术中无法对于掺杂果葡糖浆的蜂蜜进行检测的现象。

附图说明

图1为本发明提出的葡萄糖、果糖和蔗糖在重水中的构型；

图2为本发明提出的样本1蜂蜜1H-NMR；

图3为本发明提出的蜂蜜样本2平行测试6次的1H-NMR指纹图谱；

图4为本发明提出的4类蜂蜜的1H-NMR指纹图谱；

图5为本发明提出的蜂蜜1H-NMR指纹图谱中常见糖类特征H归属；

图6为本发明提出的蜂蜜1H-NMR 4-6ppm指纹图谱

图7为本发明提出的流程示意结构图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利，而不能理解为对本专利的限制。

在本专利的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本专利中的具体含义。

参照图1-6，一种蜂蜜真伪检测方法，该方法包括以下步骤：

S1：材料仪器准备，准备多份待检测的材料和需要使用的相关仪器，本实施例中具体选取4中样本蜂蜜进行检测：

样本1：田园农业牌枣花蜂蜜，产地：湖北省襄阳市；生产日期：2017年03月01日；保质期：2年；

样本2：森蜂园牌椴树蜂蜜，产地：上海市奉贤区；生产日期：2016年04月29日；保质期：2年；

样本3：采购自超市的枇杷蜂蜜，产地：福建省福州市；生产日期：2016年12月01日；保质期：2年；

样本4：冠生园牌蜂蜜，产地：上海市奉贤区；生产日期：2016年01月21日；保质期：1.5年；

本实施例中需要使用的相关仪器具体如下：

Bruker Ultrashield Plus-600型核磁共振仪；

5mm双核z－梯度探头；

5mm核磁共振样品管；

Topspin 2.3试验控制及数据处理软件；

高速离心机；

离心管；

超声仪；

分析天平；

氘代试剂：ALDRICH重水(氘代度99.9％)，

邻苯二甲酸氢钾。

S2：预处理，对多份待检测的样品进行预处理；针对S1过程中的4个样品，在检测前需要对4个样品进行预处理，使其处于同一状态，这样做最基本的好处有两个，第一可以将各个样本都置于最方便检测的状态，第二也可以避免由于状态不同导致的检测结果出现偏差问题；4个检测样本中，对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀；对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，分出0.5kg作为试样；将制备好的试样置于离心管中，密封，并标明标记，于室温下保存；具体操作如下：

分别称取样本1蜂蜜三等份至1.5mL离心管，加重水配成等浓度溶液(20mg/mL)，利用超声仪使蜂蜜充分溶解，直至体系透明澄清，利用高速离心机使其转速达到5000rpm，离心5min，保证无溶液挂壁，然后用移液枪将离心管内溶液完全转移至5mm的核磁共振样品管中，静置15min使溶液内糖类构型稳定。

分别称取样本2蜂蜜三等份至1.5mL离心管，加重水配成等浓度溶液(20mg/mL)，利用超声仪使蜂蜜充分溶解，直至体系透明澄清，利用高速离心机使其转速达到5000rpm，离心5min，保证无溶液挂壁，然后用移液枪将离心管内溶液完全转移至5mm的核磁共振样品管中，静置15min使溶液内糖类构型稳定。

分别称取样本3蜂蜜三等份至1.5mL离心管，加重水配成等浓度溶液(20mg/mL)，利用超声仪使蜂蜜充分溶解，直至体系透明澄清，利用高速离心机使其转速达到5000rpm，离心5min，保证无溶液挂壁，然后用移液枪将离心管内溶液完全转移至5mm的核磁共振样品管中，静置15min使溶液内糖类构型稳定。

分别称取样本4蜂蜜三等份至1.5mL离心管，加重水配成等浓度溶液(20mg/mL)，利用超声仪使蜂蜜充分溶解，直至体系透明澄清，利用高速离心机使其转速达到5000rpm，离心5min，保证无溶液挂壁，然后用移液枪将离心管内溶液完全转移至5mm的核磁共振样品管中，静置15min使溶液内糖类构型稳定；

S3：取样检测，对每份待检测的样品均进行取样检测；蜂蜜样品的检测方式均为随机检测，以避免在分析过程中可能产生的仪器误差；

S4：样品测试，对S3中的样品进行测试；对于S3中的所有蜂蜜样本，均采用重水定标的方式对蜂蜜样本的1H NMR进行分析；

S5：二次测试，对S4中的蜂蜜样品再次测试；对S4中采用过重水定标分析的蜂蜜样品再次测试，采用noesypr1d脉冲序列抑制蜂蜜中水的共振信号，在600MHz核磁共振波谱仪上进行1H NMR测试，测试温度为290-310K，具体的为298K，利用D2O进行锁场；且每次样品测定前都进行调谐、匀场；信号累加10-20次，空扫次数1-3次，本实施例中信号累加16次，空扫次数为2次，采用noesypr1d脉冲序列抑制蜂蜜中水的共振信号扫描次数为30-50次，在本实施例中具体的为40次，其中在Topspin软件中各参数设置如下:PULPROG＝noesypr1 d，AQ_mod＝DQD，TD＝32K，NS＝16*N，DS＝2，信号累加40次；

S6：数据采集，对S5中的样品测试结果进行数据采集；

S7：分析数据；

根据已知文献阎政礼，蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖NMR定量分析研究。食品科学，2009，Vol.30,No14.可以知道蜂蜜中葡萄糖以α-D-吡喃葡萄糖和β-D-吡喃葡萄糖两种构型存在。天然的葡萄糖无论是游离或结合均数D型，在水溶液中链式葡萄糖的含量极少，主要以环氧吡喃式构型存在，α和β两种构型异构体通过链式葡萄糖实现动态平衡。同样，可以知道蜂蜜中果糖以β-D-呋喃果糖、β-D-吡喃果糖和α-D-呋喃果糖三种构型。其中含量最高的一种为β-D-吡喃果糖，其次为β-D-呋喃果糖，最低为α-D-呋喃果糖。蜂蜜中蔗糖在重水中只有一中构型，α-D-吡喃葡萄糖环上的1-C和β-D-呋喃果糖的8-C通过氧原子连接起来，葡萄糖、果糖和蔗糖在重水中的构型如图1所示。

以样品1蜂蜜的1H-NMR为例简要解析谱图中特征H的归属。

如图2所示，δ5.38归属为蔗糖1H，由于受到蔗糖2H的耦合而裂分为d峰，耦合常数约为3JH-H＝4Hz；δ5.21归属为α-D-吡喃葡萄糖的1-H；δ4.63归属为β-D-吡喃葡萄糖的1-H；δ4.1归属为β-D-吡喃果糖3-H和β-D-呋喃果糖的3-H和4-H；δ4.02归属为β-D-吡喃果糖6-H上一个质子两重峰中的一个峰；δ3.99归属为β-D-吡喃果糖6-H上一个质子两重峰中的另一个峰和α-D-呋喃果糖4-H两个峰中的一个峰；δ3.98归属为β-D-吡喃果糖5-H与α-D-呋喃果糖4-H两个峰中的另一个峰。

选取样品2蜂蜜中的一份进行6次平行测定，扫描16次，图谱编号依次为Desktop/1，12，13，14，15，16，1H-NMR，

如图3所示；可以看到同一个样品6次平行测定的谱图几乎完全一样，特征峰重合度完美，强度也近乎一致，表明所选用的样品浓度和核磁共振仪能可靠的反映样品的真实信息，可作为一种灵敏、高效、准确测试手段进行蜂蜜糖含量的定量分析。

同样，计算出蜂蜜2-1中葡萄糖、果糖和蔗糖的百分含量，并计算其平均值、标准偏差和相对标准偏差，结果如表1所示。从表1可以看出：葡萄糖、果糖和蔗糖测定结果的相对标准偏差分别为1.54％、1.28％、3.28％，多次测定结果接近，相对标准偏差也在允许范围内，说明利用核磁共振仪定量分析蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖的百分含量准确度高，重现性好。

表1：精密度实验

对得到的一维1H NMR谱图进行基线校正和相位校正。利用Topspin软件对样品的核磁共振信号进行傅立叶变换，得出蜂蜜样品、掺假蜂蜜和糖浆样品典型的1H NMR指纹图谱(如图4)。由图4可见，通过典型的指纹图谱很难直观地看出4种蜂蜜之间的显著性差异谱峰。因此，必须对得到的所有数据进行化学计量学分析，以从细微的差别中提取出判断蜂蜜真伪的生物标志物。

所以，首先在1H-NMR指纹图谱中对蔗糖，α-D-吡喃葡萄糖和β-D-吡喃葡萄糖，β-D-呋喃果糖、β-D-吡喃果糖和α-D-呋喃果糖三种构型特征H进行归属(详见2.2葡萄糖、果糖和蔗糖在重水中1H-NMR特征峰的确认)，如图5所示。

同时利用辅助材料中的方法对图谱进行处理，定量分析了蜂蜜样本中蔗糖、还原糖和水的比例，取平均值，如表2所示。

目前针对蜂蜜的国家标准中明确指出蔗糖含量不超过5％，还原糖(葡萄糖+果糖)含量不低于60％，水含量不超过23％。从表2中蜂蜜组分分析结果看，4个品牌的蜂蜜无论是蔗糖、还原糖，还是水含量均基本符合国家标准，表明以国家标准作为衡量蜂蜜真伪的指标，4个品牌的蜂蜜均有可能是真的。

表2：蜂蜜中蔗糖、还原糖和水含量

天然蜂蜜中含有微量的低聚糖，这些低聚糖是蜂蜜采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质，人为掺假得到的商品化蜂蜜中是不存在这些低聚糖的，因此可作为辨别蜂蜜真伪的根本性标准。在1H-NMR中这些低聚糖的特征峰主要集中在4-6ppm，所以接下来着重分析四种蜂蜜1H-NMR中4-6ppm的指纹图谱，如图6所示，箭头标记(黑、红、蓝)的位置即为天然蜂蜜特有低聚糖的特征峰。

由图可知，样本1和样本2蜂蜜的低聚糖特征峰明显，样本4蜂蜜的低聚糖特征峰信号不完整，样本3蜂蜜完全没有低聚糖特征峰信号。因此，判断采购自超市的枇杷蜂蜜(样本3蜂蜜)为假蜂蜜，由于它的糖含量和水含量基本符合国家标准，猜测样本3蜂蜜极有可能为果葡糖浆掺假而来的劣质品，也进一步证明利用核磁共振技术辨别蜂蜜真伪可信度高。

核磁共振技术能够无损地检测含量在检出限内的所有小分子化合物，在特定的条件下对样品中所含各化合物的检测灵敏度相同，是一种无偏向性分析手段，运用核磁共振这种无偏向性分析手段对4种蜂蜜中的多组分进行分析，明确了蜂蜜1H-NMR中各种糖组分关键H的的归属，并运用化学计量学分析方法定量计算得到每种蜂蜜中不同糖组分含量及水含量的百分比例，对比发现与国家标准吻合度很高，其中样本3蜂蜜也基本满足国家标准，无法通过简单分析不同糖组分含量及水含量的百分比例判断其真伪。

综上所述，通过核磁共振技术简单定量分析还原糖、蔗糖和水分的含量。着重分析了1H-NMR中4-6ppm的信号，发现样本3蜂蜜(采购自超市的枇杷蜂蜜)在这段指纹图谱中没有关键低聚糖特征H的信号，而这些低聚糖是蜂蜜采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质，是辨别蜂蜜真伪的根本性标准。因此，可以判定样本3蜂蜜为果葡糖浆掺假而来的劣质品。而样本1、样本2为真蜂蜜，样本4蜂蜜低聚糖特征H信号不完整，强度较弱，且由于长期储存导致淀粉值含量过低，不建议继续食用。

研究表明：样本1、样本2、样本4为真蜂蜜，但样本4蜂蜜低聚糖特征H信号不完整，强度较弱，且由于长期储存导致淀粉值含量过低，不建议继续食用。样本3为假蜂蜜。因此，可证明核磁共振无偏向性分析手段与各种理化指标测定手段联用可作为辨别蜂蜜真伪的方法，灵敏、高效、可信度高。

在本专利的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利的限制。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。