用于鉴定处于AKI“风险”的受试者的生物标志物组合

摘要

本发明提供了一种用于确定受试者形成肾功能障碍(AKI)的素因的方法，以及用于进行这种确定的试剂盒。适当地，在该方法中使用存在于血液或尿液样品中的至少一种选自Midkine(MK)或H‑FABP的标志物。

说明书

本发明涉及一种用于确定受试者形成肾功能障碍(renal dysfunction)的素因(predisposition)的方法，以及用于进行这种确定的试剂盒。

急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)是公认的利用心肺转流(cardiopulmonary bypass,CPB)的心脏手术(CS)的并发症，并且其特征是估计的肾小球滤过率(eGFR)的急剧下降。AKI-CS与住院时间、发病率和死亡率增加相关联。AKI-CS的鉴定和诊断是基于血清肌酐浓度的变化。然而，这是有问题的，因为血清肌酐的升高可能会在损伤后延迟24-72小时。对处于“风险(at-risk)”的患者的早期预测和鉴定将允许实施适当的术前、术中和术后肾保护策略。与晚期肾脏替代疗法(Renal Replacement Therapy，RRT)相比，早期RRT的好处与患者生存期延长和ICU住院时长缩短(RRT<术后3天)相关联。

术前和术中肾脏保护策略，例如施用促红细胞生成素(erythropoietin)或最小化CPB的持续时间，可以提供给那些在手术前被鉴定有AKI风险的受试者。适当地在手术后24小时内，对那些有AKI风险的受试者进行手术后检测，将允许早期的术后干预，例如肾脏替代治疗。

此外，遭受身体创伤(可以包括骨折)的受试者，经常发展为急性肾功能障碍(AKI)。其他引起类似的急性肾功能障碍的原因包括延长的低血压状态(例如与粘膜肠缺血和内毒素从肠转移到循环有关)，败血症和败血性休克综合征。

进行强有力的身体创伤后测试，适当地在创伤后24小时内，可以允许对重症监护病房中被认为具有处于AKI“风险”的受试者采取预防措施。

发明内容

尽管已鉴定出几种标志物用于鉴定处于形成急性肾损伤(AKI)“风险”的受试者，但改进对此类受试者的检测将是有益的。

发明人已经确定，在创伤前后，对存在于受试者中的生物标志物的特定组合的测量可以提供用于处于形成AKI“风险”的受试者的改进的检测。

因此，本发明的第一方面提供了一种用于确定受试者形成AKI的素因的方法，该方法包括以下步骤：

在手术，身体创伤，低血压，败血症和/或败血性休克综合征，尤其是心脏手术或骨折创伤之前，确定从受试者采集的血液或尿液样品中存在的至少一种选自Midkine(MK)或H-FABP的标志物的水平；

其中，当该Midkine或H-FABP的水平高于来自对照的血液或尿液样品中的Midkine或H-FABP的正常水平时，表明该受试者在手术，身体创伤，低血压，败血症和/或败血性休克综合征，尤其是心脏手术或骨折创伤后具有高于正常的形成AKI的素因。

一方面，本公开提供了诊断或辅助诊断受试者中AKI的方法，包括：分析来自所述受试者的生物样品以确定样品中AKI的一种或多种生物标志物的水平，其中从表2、3、4、5、6或7中选择一种或多种生物标志物，并将样品中一种或多种生物标志物的水平与该一种或多种生物标志物的AKI阳性和/或AKI阴性参照水平进行比较，以诊断受试者是否患有AKI。

根据本发明的第二方面，提供了确定受试者形成AKI的素因的方法，该方法包括以下步骤：

确定在手术，身体创伤，低血压，败血症和/或败血性休克综合征，尤其是心脏手术或骨折创伤后48小时内从受试者采集的血液或尿液样品中存在的至少一种选自Midkine(MK)或H-FABP的标志物的水平；

其中，当该Midkine或H-FABP的水平高于来自对照的血液或尿液样品中的Midkine或H-FABP的正常水平时，表明该受试者在手术，身体创伤，低血压，败血症和/或败血性休克综合征，尤其是心脏手术或骨折创伤后具有高于正常的形成AKI的素因。

如本文所用，标志物和生物标志物可互换使用。

如将理解的，可以将来自被测试受试者的生物标志物的水平与来自患有AKI疾病状态的受试者的样品中的生物标志物的水平进行比较，并且当来自被测受试者的样品中生物标志物的水平与来自患有AKI疾病状态的受试者的样品中生物标志物的水平无差异时，表明被测试受试者患有AKI。

备选地，如将理解的，可以将来自被测试受试者的生物标志物的水平与来自非AKI疾病状态的受试者的样品中的生物标志物的水平进行比较，并且当来自被测试受试者的样品中生物标志物的水平与来自非AKI疾病状态受试者的样品中生物标志物的水平无差异时，表明被测受试者没有患AKI。

“生物标志物”是指与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异存在(即增加或减少)的生物化合物。生物标志物可以以任何水平差异存在，但适当地以统计学上显著的水平差异存在(即，如使用韦尔奇T检验或Wilcoxon秩和检验确定的，p值小于0.05和/或q值小于0.10)。适当地，生物标志物可以以具有0.7或更大，适当地0.75或更大，适当地0.8或更大的AUC(在接收操作特征曲线的曲线下的面积)的水平存在。一种或多种生物标志物的“水平”是指样品中生物标志物的绝对或相对量或浓度。

“样品”或“生物样品”是指从受试者分离的生物材料。生物样品可以含有适合于检测期望的生物标志物的任何生物材料，并且可以包含来自受试者的细胞和/或非细胞材料。可以从任何合适的生物流体中分离样品，比如，所述生物流体例如是血液，血浆，血清或尿液。

生物标志物的“参照水平或正常水平”是指指示非AKI状态，表型或形成AKI疾病状态或表型的素因的生物标志物的水平。生物标志物的“水平”可以是生物标志物的绝对或相对量或浓度，生物标志物的存在或不存在，生物标志物的量或浓度的范围，生物标志物的最小和/或最大量或浓度，生物标志物的平均量或浓度和/或生物标志物的中值量或浓度；并且，此外，生物标志物组合的“参照水平”也可以是两种或更多种生物标志物相对于彼此的绝对或相对量或浓度的比率。可以通过测量一个或多个合适受试者中所需生物标志物的水平来确定用于AKI的生物标志物的适当正常参照水平，并且可以针对特定的受试者人群定制此类参照水平(例如，参照水平可以是年龄匹配或性别匹配的，以便可以使在来自特定年龄或性别的受试者的样品中的生物标志物水平与来自特定年龄或性别组中的AKI疾病状态，表型或缺乏AKI疾病状态的参照水平之间进行比较。

当本发明的方法用于辅助诊断AKI时，该方法的结果可以与可用于临床确定受试者是否患有AKI的其他方法(或其结果)一起使用。

为了确定样品中一种或多种生物标志物的水平，可以使用任何合适的方法来分析生物样品。合适的方法包括色谱法(例如HPLC，气相色谱法，液相色谱法)，质谱法(例如MS，MS-MS)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，抗体连接，其他免疫化学技术及其组合。此外，可例如通过使用测量与所需待测生物标记水平相关的一种或多种化合物的水平的测定法来间接测量一种或多种生物标记的水平。

将理解的是，可以使用任何合适的测定或装置，例如ELISA测定，BIOCHIP技术等来检测如本文讨论的标记。适当地，可以使用Cytokine Array IV(Randox)检测TNFRI和II生物标志物(可溶性肿瘤坏死因子受体I和II，Soluble Tumour Necrosis Factor ReceptorsI and II)。

适当地，确定生物标志物的组合的水平可以允许在诊断AKI和辅助AKI诊断中更高的敏感性和特异性。例如，生物样品中某些生物标志物(和非生物标志物化合物，例如代谢产物)的水平之比可以在诊断AKI和辅助AKI诊断中提供更高的敏感性和特异性。确定样品中一种或多种生物标志物的水平后，可以将该水平与AKI阳性和/或AKI阴性参照水平进行比较，以诊断或辅助诊断受试者是否患有AKI。样品中一种或多种生物标志物的水平与AKI阳性参照水平相匹配(例如，该水平与参照水平相同，与参照水平基本相同，高于和/或低于参照水平的最低值和/或最高值，和/或在参照水平的范围内)指示受试者中AKI的诊断。样品中一种或多种生物标志物的水平与AKI阴性参照水平相匹配(例如，该水平与参照水平相同，与参照水平基本相同，高于和/或低于参照水平的最低值和/或最高值，和/或在参照水平的范围内)指示受试者中没有AKI的诊断。另外，与AKI阴性参照水平相比，样品中差异存在的一种或多种生物标志物的水平(特别是在统计学上显著的水平)指示诊断受试者患有AKI。与AKI阳性参照水平相比，样品中差异存在的一种或多种生物标志物的水平(特别是在统计学上显著的水平)指示诊断受试者没有患AKI。

可以使用多种技术将一种或多种生物标志物的水平与AKI阳性和/或AKI阴性参照水平进行比较，包括简单比较(例如，手动比较)生物样品中的一种或多种生物标志物的水平与AKI阳性和/或AKI阴性参照水平。还可使用一种或多种统计分析(例如t检验，Welch T检验，Wilcoxon秩和检验，随机森林，T分数，Z分数)或使用数学模型(例如算法，统计模型，混合效应模型)将生物样品中一种或多种生物标志物的水平与AKI阳性和/或AKI阴性参照水平进行比较。

适当地，Midkine(MK或NEGF-2一种13kDa肝素结合的胚胎生长因子)，可使用获自Cellmid(Australia)的ELISA测定进行检测。Midkine是与癌症相关的已知标志物(参见例如：Muramatsu,T.,Midkine and pleiotrophin:two related proteins involved indevelopment,survival,inflammation and tumorigenesis.J Biochem,2002.132(3):p.359-71；.Ikematsu,S.,et al.,Serum midkine levels are increased in patientswith various types of carcinomas.Br J Cancer,2000.83(6):p.701-6；Ibusuki,M.,etal.,Midkine in plasma as a novel breast cancer marker.Cancer Sci,2009.100(9):p.1735-9；Ikematsu,S.,et al.,Correlation of elevated level of blood midkinewith poor prognostic factors of human neuroblastomas.Br J Cancer,2003.88(10):p.1522-6.)

发明人已经确定在用于AKI的模型中检测来自受试者的术前血清样品中的标志物TNFRI，TNFRII和Midkine，经历心肺流转心脏手术的受试者术前样品的接收操作特性曲线的曲线下面积约为0.75。此外，发明人已经确定使用来自受试者的术后血清样品中标志物TNFRI，TNFRII和Midkine，经历心肺流转心脏手术的受试者术后样品的接收操作特性曲线的曲线下面积约为0.80。

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的术前血清样品中标志物TNFRI和TNFRII，经历心肺流转心脏手术的受试者术前样品的接收操作特性曲线的曲线下面积约为0.73。

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的术前血清样品中标志物TNFRI和Midkine，经历心肺流转心脏手术的受试者术前样品的接收操作特性曲线的曲线下面积约为0.74。

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的术前血清样品中标志物TNFRII和Midkine，经历心肺流转心脏手术的受试者术前样品的接收操作特性曲线的曲线下面积约为0.75。

此外，发明人已经确定使用来自受试者的

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的术前血清样品中标志物TNFRI和H-FABP，经历骨折创伤的受试者术前样品的接收操作特性曲线的曲线下面积约为0.74。

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的

适当地，发明人已经确定使用来自受试者的术前血清样品中标志物TNFRI和H-FABP和Midkine，经历骨折创伤的受试者术前样品的接收操作特性曲线的曲线下面积约为0.76。

适当地，发明人已经确定，在来自受试者的术后血清样品中使用标志物TNFRI和H-FABP以及Midkine，经历骨折创伤的受试者术后样品的接收操作特性曲线的曲线下面积约为0.88。

在确定一种或多种生物标志物的水平后，可以将该水平与AKI疾病或非AKI疾病参照水平或一种或多种生物标志物的参照曲线进行比较以确定样品中一种或多种生物标志物中每一种的等级。可以使用任何算法来聚合一个或多个等级，以创建受试者的得分，例如AKI得分。该算法可以考虑与AKI有关的任何因素，包括生物标志物的数量，生物标志物与AKI的相关性等。适当地，可以使用回归分析，例如多元线性回归建立含有一个或多个生物标志物作为变量的数学模型或公式。作为非限制性示例，开发的公式可以包括以下内容：

A+B(生物标志物1)+C(生物标志物2)+D(生物标志物3)+E(生物标志物4)＝患者得分

A+B*ln(生物标志物1)+C*ln(生物标志物2)+D*ln(生物标志物3)+E*ln(生物标志物4)＝In患者得分

其中A，B，C，D，E可以是常数；生物标志物1，生物标志物2，生物标志物3，生物标志物4是相应生物标志物的测量值，而患者得分是AKI存在或不存在或严重程度的度量。

适当地，可以提供术前患者得分，其指示受试者在利用心肺转流的心脏手术后具有高于正常的形成AKI的素因。

适当地，可以通过例如以下方式提供心脏病患者得分

7(log

在一个实施方案中，当患者得分大于或等于2.6时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于2.7且小于3.4时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于2.75且小于3.3时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于2.9且小于3.1时，表明该受试者处于AKI的风险中。

适当地，关于骨折修复，受试者经受两次伤害。最初的伤害和修复骨折手术。损伤发生与手术之间的时间延迟导致受试者适应，即炎症过程在手术之前已经开始。结果，受试者可能在手术前形成AKI。AKI的分类是基于RIFLE系统。假定患者具有至少为60ml/min/1.73m

适当地，可以通过例如以下方式提供骨折修复前患者得分：

1.579(log

在一个实施方案中，当患者得分大于或等于4时，表明该受试者处于AKI风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于4.1且小于5时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于4.2且小于4.5时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于4.3且小于4.5时，表明该受试者处于AKI的风险中。

适当地，用于分析的样品在手术前和手术后24小时之内采集。在任何时间MDRD<45ml/min/1.73m

在本发明的第二方面的实施方案中，可以在手术，身体创伤，低血压，败血症和/或败血性休克综合征，尤其是心脏手术或骨折创伤之后的24小时内从受试者采集样品，其中当TNFRI，TNFRII和Midkine的水平高于样品中的TNFRI，TNFRII和Midkine正常水平时，表明受试者在利用心肺转流的心脏手术后具有高于正常的形成AKI的素因。

发明人已经确定，在来自受试者的手术后样品中使用标志物TNFRI，TNFRII和Midkine，可以提供患者得分，其指示受试者在利用心肺转流的心脏手术后具有高于正常的形成AKI的素因。

适当地，可以通过例如以下方式提供手术后心脏患者得分

7.3(log

在一个实施方案中，当患者得分大于或等于6.8时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于6.9且小于7.6时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于6.9且小于7.5时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于7.0且小于7.4时，表明该受试者处于AKI的风险中。

发明人已经确定，在来自受试者的手术后样品中使用标志物TNFRI和H-FABP，可以提供患者得分，其指示受试者在利用心肺转流的心脏外科手术后具有高于正常的形成AKI的素因。

适当地，可以通过例如以下方式提供骨折后患者得分

4.81(log

在一个实施方案中，当患者得分大于或等于10.5时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于10.7且小于14时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于10.8且小于14时，表明该受试者处于AKI的风险中。在一个实施方案中，当患者得分大于或等于11且小于14时，表明该该受试者处于AKI的风险中。

在一个实施方案中，患者得分是由手术后24小时内从受试者获得的样品确定的。在一个实施方案中，患者得分是由手术后48小时内从受试者获得的样品确定的。在一个实施方案中，患者得分是由手术72小时内从受试者获得的样品确定的。在一个实施方案中，患者得分是由手术120小时内从受试者获得的样品确定的。适当地，可以在手术后24至48小时内，适当地在手术后48小时至72小时内，适当地在手术后72至120小时内获得来自受试者的样品。

在实施方案中，用于第一或第二方面的样品可以来自血液。适当地，样品可以是血浆或血清。在实施方案中，样品可以是尿液。

适当地，该方法可以允许确定肾功能障碍的素因，其中肾功能障碍是急性肾功能障碍。适当地，在手术，身体创伤，低血压，败血症和/或败血性休克综合征，尤其是心脏手术或骨折创伤后，可能存在5天或更长时间的肾功能障碍。

适当地，肾功能障碍可以定义为比正常肾小球滤过率降低25％或更多(eGFR小于75％)。

如果发生这些事件，本发明的方法预测受试者发展事件后(所述事件即手术后，身体创伤，低血压，败血症和/或败血性休克综合征，尤其是心脏手术或骨折创伤)的肾功能障碍的可能性。因此，该方法是一种预后方法。当受试者出现在血清样品中源自TNFRI，TNFRII和MK的组合的患者得分大于源自此类组合的正常患者得分时，可以确定受试者具有高于正常的形成肾功能障碍的机会。

“正常或对照水平”(非AKI)患者得分是由未形成AKI的对照个体组中呈现的水平。

要预后的肾功能障碍可能是早期肾功能障碍，晚期肾功能障碍或一般性肾功能障碍。早期肾功能障碍会在诱发肾功能障碍的事件的两天内发生。晚期肾功能障碍在此类事件发生后5天或更晚发生。确定个体是否患有肾功能障碍是技术人员能力范围内的临床问题。但是，为了清楚起见，肾功能障碍的特征是排泄代谢产物的能力降低，这些代谢产物是全身积累的，并且是通过肾功能试验在临床病理上可检测的(进展状态下，肾功能障碍可以是急性肾衰竭，尿毒症或慢性肾损伤)。例如，肾功能障碍可以定义为比正常肾小球滤过率降低25％或更多。正常肾小球滤过率是事前率。肾小球滤过率可根据MDRD研究组公式确定。这种急性形式的肾功能障碍可以与自身免疫介导的慢性肾功能障碍区分开，后者在很长一段时间内在临床上很明显地与自身免疫性疾病并存(即不需要生物学标记来预测肾功能障碍的发展，肾功能障碍会在几天后发生，因为肾功能障碍已经很明确建立)。

从受试者采集的样品可以是能够分析其中的抗炎细胞因子水平的任何样品。例如，样品可以是尿液样品，血液样品，例如血清或血浆样品。血清样品是特别优选的。

根据本发明的第一方面分析的样品可以在事件(即心脏手术)前48小时，24小时或12小时从受试者获得。最佳在事件前24小时获取样品。

在第一或第二方面的实施方案中，确定选自Midkine或H-FABP的至少一种标志物的水平的步骤可以在来自受试者的血清上进行。

在第一方面或第二方面的实施方案中，确定水平的步骤包括确定至少两种标志物的水平，其中第一标志物选自Midkine(MK)和H-FABP中的至少一种，并且至少第二标志物选自TNFRI和TNFRII中的至少一种，其中当检测到的TNFRI和/或TNFRII水平分别高于对照中的TNFRI和/或TNFRII的正常水平时，表明该受试者在心脏手术或骨折创伤后具有高于正常的形成AKI的素因。

在实施方案中，可以在尿液样品中检测TNFRI和/或TNFRII，并且可以在血清中检测Midkine和/或H-FABP。可以适当地确定TNFRI和/或TNFRII与Midkine和/或H-FABP的比率。

在实施方案中，确定步骤可以包括确定选自TNFRI，TNFRII和Midkine的至少三种标志物的水平。

在实施方案中，确定步骤可以包括确定选自TNFRI，TNFRII和H-FABP的至少三种标志物的水平。

在实施方案中，确定步骤可以包括确定选自TNFRI，H-FABP和Midkine的至少一种标志物的水平。适当地，该方法可以检测包括选自IL-1a，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-15，VEGF，INF-γ，TNF-α，MCP，MIP1-alpha，NGAL，IL12P40，IP10或IL1Ra的额外标志物。适当地，可以从来自所述受试者的血浆中检测IL-1a，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-15，VEGF，INF-γ，TNF-α，MCP，MIP1-α和NGAL中的至少一种。适当地，可以从受试者的血清或尿液中检测IL12P40。适当地，可以在血清或尿液中检测IP10或IL1Ra。适当地，可以在尿液中检测NGAL。

适当地，当考虑将要进行心脏手术的受试者时，可以在诊断模型中使用以下标记IL-6，IL-1a，VEGF，INF-γ，TNF-α，MCP，MIP1-α和NGAL。

适当地，当考虑将要或已经进行心脏手术的受试者时，手术后模型可以包括TNF-α，MCP，MIP1-α和NGAL。

在其中测量一个以上的标志物的实施方案中，可以在同时获得的样品中测量各个标志物，或者可以从在不同时间(例如，更早或更晚的时间)获得的样品中确定它们。各个标志物也可以在相同或不同的体液样品中测量。例如，可以在血清或血浆样品中测量一种标志物，并且可以在尿液样品中测量另一种标志物。除绝对水平外，在本发明的范围内，标志物的比率可用于鉴定处于AKI风险的受试者。例如，在相同或不同的时间点，血清中一种标志物与尿液中另一种标志物的比率可能为心脏或骨科手术后AKI的预后提供信息。合适的比率包括，例如，H-FABP与TNFRI，Midkine与TNFRI，H-FABP与Midkine，H-FABP与TNFRII，Midkine与TNFRII和TNFRI与TNFRII。

在本发明的第三方面，提供了一种用于第一或第二方面的方法的试剂盒，其中该试剂盒包括：-

-一种或多种用于检测TNFI，TNFII，H-FABP和Midkine中至少一种或其组合的试剂

-说明书，用于确定TNFRI，TNFRII，H-FABP和Midkine中的至少一种是否高于正常水平，如根据第一方面或第二方面在受试者中观察到的。

试剂盒可进一步包含用于检测一种或多种抗炎介质，例如抗炎细胞因子的一种或多种试剂，以及用于使用一种或多种试剂检测一种或多种抗炎介质的说明书。

试剂盒可进一步包括用于检测一种或多种抗炎细胞因子以达到肾功能障碍的预后的说明书。说明书可以与本发明的第一或第二方面中提供的用于肾功能障碍的预后的步骤一致。试剂盒可进一步包括用于检测一种或多种抗炎介质以达到肾功能障碍预后的说明书。

在本发明的第四方面，提供了一种治疗由手术，身体创伤，低血压，败血症和/或败血性休克综合征，尤其是心脏手术或骨折创伤诱导的肾功能障碍的方法，其中该方法包括步骤：(i)根据本发明的第一方面或第二方面的任何方法预测肾功能障碍；并且(ii)当鉴定受试者处于增加的形成肾功能障碍的风险时，应用治疗措施来治疗或消除即将来临的肾功能障碍。

相对于当前的治疗干预，这种方法的优势在于可以在可以完全预防肾衰竭的阶段给予治疗。步骤(ii)中应用的治疗措施可以是：维持超常血压；确保足够的组织氧气输送；类固醇给药；肾脏替代疗法；透析或其任何组合，促红细胞生成素给药，使心肺转流的持续时间最小化，早期肾脏替代疗法。本发明的另一个优点将是允许重症监护管理者在患者的重症监护住院早期鉴定出那些个体，他们在重症监护室的时间可能比预期的要长，从而为工作人员部署提供更早规划。本文讨论的生物标志物和算法可以辅助医师确定治疗路径。

在实施方案中，身体创伤可以是施加到身体上的外力对身体的影响，例如：-由手术或身体的打击或割伤(例如在车祸中可能遭受的)引起的损伤；或与心肺分流术机(heart-lung bypass machine)外表面相互作用时对血液的影响。身体创伤引起的肾功能障碍可能是术后肾功能障碍。术后肾功能障碍可能发生在心脏，心血管，心肺或骨折手术之后。身体创伤不包括再灌注损伤。

个体是否患有低血压是临床问题，因此完全在本领域普通技术人员的能力范围内。然而，为避免疑问，成人低血压可定义为收缩压<80mmHg或平均动脉压(MAP)<50mmHg。低血压可能会延长，例如超过2小时。

个体是否患有败血症是临床问题，因此完全在本领域普通技术人员的技能范围内。然而，为避免疑问，如果高度怀疑或证明感染并且满足以下两个或更多个系统性炎症反应综合征(SIRS)标准，则可以考虑存在败血症：

1.心率>每分钟90次跳动(心动过速)；

2.体温<36℃(97°F)或>38℃(100°F)(体温过低或发烧)；

3.呼吸速率>每分钟20次呼吸，或在有血气的情况下，PaCO

4.白细胞计数<4,000细胞/mm

个人是否患有败血性休克是临床问题，因此完全在本领域普通技术人员的能力范围内。然而，为了避免产生疑问，败血症性休克可以通过以下两个标准来定义：

1.通过阳性血培养得到的感染证据；和

2.难治性低血压-尽管有足够的流体复苏和心输出量，但仍为低血压。在成人中，定义为收缩压<90mmHg，或MAP<60mmHg，在实施所需的复苏性正性肌力支持之前，或者收缩压比基线降低40mmHg。在儿童中，血压(BP)<正常血压的2SD。

个体是否患有SIRS是临床问题，因此完全在本领域普通技术人员的能力范围内。然而，为了避免疑问，当存在以下两种或更多种情况时，可以诊断为SIRS：

1.心率>每分钟90次

2.体温<36或>38℃

3.呼吸急促(高呼吸频率)>每分钟20次呼吸，或在血气中PaCO

4.白细胞计数<4000细胞/mm

除非上下文另外要求，否则本发明的每个方面的优选特征和实施方案在细节上作必要修改后均与其他方面相同。

如本文所用，“一”和“一个”是指文章语法对象的一个或多个(例如至少一个)。。

“约”通常是指在给定测量性质或精度的情况下，所测量数量的可接受误差程度。

在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则术语“包含”或“包括”或诸如“包含有”或“包含了”，“包括有”或“包括了”之类的变体应理解为暗示所述整数或整数组的包括，但不排除任何其他整数或整数组。

现在将参照附图，通过示例的方式描述本发明的实施方案，其中：

图1示出了TNFRI，TNFRII和Midkine模型的手术前ROC；

图2示出了手术前TNFRI，TNFRII和Midkine模型；

图3示出了手术前TNFRI，TNFRII和Midkine模型；

图4示出了使用手术前血清TNFRI，TNFRII和Midkine模型的患者得分；

图5示出了手术后血清TNFRI，TNFRII和Midkine模型的ROC；

图6示出了手术后血清TNFRI，TNFRII和Midkine模型；

图7示出了手术后血清TNFRI，TNFRII和Midkine模型；

图8示出了手术后血清TNFRI，TNFRII和Midkine模型；

图9示出了手术后血清TNFRI，TNFRII和Midkine模型的患者得分；

图10示出了手术后血清TNFRI，TNFRII和Midkine模型的患者得分；

图11示出了手术后血清TNFRI，TNFRII和Midkine模型的患者得分；

图12示出了手术前血清TNFRI和TNFRII的ROC；

图13示出了手术前血清TNFRI和Midkine；

图14示出了手术前血清TNFRII和Midkine；

图15示出了手术后血清TNFRI和TNFRII；

图16示出了手术后血清TNFRI和Midkine；

图17示出了手术后血清TNFRII和Midkine；

图18示出了手术前血清TNFRI；

图19示出了手术前血清TNFRII；

图20示出了手术前血清Midkine；

图21示出了手术后血清TNFRI；

图22示出了手术后血清TNFRII；

图23示出了手术后血清Midkine；

图24A和B示出了骨折修复手术前的血清；

图25A和B示出了骨折修复手术后的血清；

图26绘示了手术前血清预测模型H-FABP和TNFRI；

图27绘示了手术前血清预测模型H-FABP，TNFRI和Midkine；

图28绘示了手术后血清模型H-FABP和TNFRI；

图29绘示了手术后血清H-FABP，TNFRI和Midkine生物标志物模型；

图30绘示了生物标志物的结果；

图31绘示了生物标志物的结果；

图32绘示出了生物标志物的结果；

图33绘示出了生物标志物的结果；

图34绘示了生物标志物的结果；

图35绘示出了生物标志物的结果；

图36绘示出了生物标志物的结果；

图37绘示了生物标志物的结果；

图38绘示了生物标志物的结果；

图39绘示了生物标志物的结果；

图40绘示出了生物标志物的结果；

图41绘示出了生物标志物的结果；

图42绘示了生物标志物的结果；

图43绘示出了生物标志物的结果；

图44绘示了生物标志物的结果；和

图45绘示出了生物标志物的结果。

发明详述

实验方法

在伦理上得到了研究伦理委员会和皇家研究办公室研究治理委员会(ResearchEthics Committee and the Royal Research Office research governance committee)的批准。

连续将心脏手术患者安排在贝尔法斯特皇家维多利亚医院的心脏外科内进行择期和紧急心脏手术，而将骨外科创伤患者连续安排在贝尔法斯特信托基金会的骨折部门内进行骨折的开放复位内固定。所有患者的排除标准为术前或创伤前透析依赖性肾衰竭或进入研究前已知的重大肾脏疾病(已知eGFR<30)。

采样方案

入院时(对于骨折患者)或心脏病患者在导管插入麻醉后进行尿液分析(样品A)(20ml)，并且术后第1天进行尿液分析(样品B)(20ml)。

入院时对骨折患者采集血液样品A(20ml)，并对其例行术前常规血样检查，以使本研究参与者不涉及额外的静脉穿刺。在术前行常规动脉导管插入术，之后对心脏病患者采集血液样品A。常规分析时，为骨折患者在手术后第1天取样B(20ml)，因此无需进一步静脉穿刺。如果对于骨折患者，在采集常规血液的过程中，意外错过了血液样品，这并不是为了避免静脉穿刺的不适超出了常规护理的要求，除所述患者在重症监护室或HDU中常规放置动脉导管以外。与许多没有常规放置动脉管的骨折患者不同，所有心脏手术患者均在手术前插入了动脉管，并在原位保留了48小时，因此在术后第1天获得血液样品B不会感到痛苦。

立即在临床区域对血液和尿液样品进行离心，并将所得的上清液保存在冰箱中。每周将这些样品运输到Randox Laboratories Ltd进行存储和分析。

实施例1心脏手术

急性肾损伤(AKI)定义为基线eGFR下降>25％。术后第1、2和5天记录到eGFR下降。为了增加人群中的患者数量，分析是基于“AKI任何一天”定义。如果在心脏手术后的任何一天，eGFR降至基线的75％以下，则将患者包括在该类别中。基于此标准，描述了人群。

表1：AKI定义为eGFR从基线下降>25％。示出了每个AKI时间点的每组患者数。

然后从AKI和非受试者的血浆、血清和尿液样品中确定生物标志物的水平。使用Mann-Whitney U检验，在AKI组和非AKI组之间，生物标志物在p<0.05标记为显著。通过ROC分析调查了被Mann-Whitney U检验鉴定为显著的单个生物标志物的预测能力。

血浆、血清和尿液生物标志物的结果分别示于表2、3和4中。

表2：血浆生物标志物被鉴定为在AKI和非AKI之间显示出显著差异。

表3：血清生物标志物被鉴定为在AKI和非AKI之间显示出显著差异。

表4：尿液生物标志物被鉴定为在AKI和非AKI之间显示出显著差异。

然后考虑生物标志物组合，其提供了从非AKI受试者组预测AKI的最大能力。

实施例2骨折手术

无法使用与心脏人群相同的定义来定义AKI，也即，eGFR从基线下降＞25％，因为患者在手术前可能因骨折受伤而患有AKI。骨折人群中AKI的分类是基于RIFLE系统。假定患者具有至少为60ml/min/1.73m

然后从AKI和非受试者的血浆、血清和尿液样品中确定生物标志物的水平。使用Mann-Whitney U检验，在AKI组和非AKI组之间，生物标志物在p<0.05标记为显著。通过ROC分析调查了被Mann-Whitney U检验确定为显著的单个生物标志物的预测能力。

血浆、血清和尿液生物标志物的结果分别示于表5、6和7中。

表5：血浆生物标志物(生物标记物，biomarker)被鉴定为在AKI组和非AKI组之间显示出显著差异。

表6：血清生物标志物被鉴定为在AKI组和非AKI组之间显示出统计学显著差异。

表7：尿液生物标志物在AKI组和非AKI组之间鉴定为显著。

然后考虑生物标志物组合，其提供了从非AKI受试者组预测AKI的最大能力。

此外，进行了生物标志物的分析，其中考虑了生物标志物之间的比率。确定了尿液抗炎和促炎介质的比率。还考虑了血液(尤其是血清)中抗炎和促炎性介质的进一步比率。另外，还考虑了尿液和血液中抗炎介质和促炎介质的比率。

根据这项研究，认为在术后形成肾功能障碍的受试者中，血液和尿液中抗炎和促炎介质的比例或平衡将低于术后保持正常肾功能的受试者。不希望受到理论的约束，认为在形成肾功能障碍(AKI)的受试者的血液和尿液中，抗炎和促炎介质之间或者不相关，或者呈负相关。此外，还认为灌注不足与失衡的炎症反应的进一步损伤相结合，对肾脏的损害可以比单独发生的任何一种损伤都要大。由于低灌注是围手术期AKI的一个重要因素，适当的标志物如HFABP和VEGF可以被测量并用于评估AKI的风险。

根据图30至45所示的结果(其中无阴影指示SPSS和PRISM结果之间的受试者数(n)没有差异/SPSS和PRISM结果之间的比率和p值无差异或小差异，并且阴影指示SPSS和PRISM结果之间的受试者数(n)有差异/SPSS和PRISM结果之间的比率和p值差异较大)，发现特定比率具有预测性。

已确定，AKI患者术后尿TNFsr2/血清HFABP的比率下降，表明器官灌注不足(通过血清HFABP升高指示)对没有形成足够的抗炎尿液TNFsr2反应的患者尤其有害。不希望受理论的束缚，认为在那些忍受了促炎(如通过尿促炎性介质所证明的)以及灌注不足(如通过血清HFABP升高所证明的)双重伤害的患者中，保护性尿液抗炎反应不足变得很重要。进一步认为，对于那些忍受了促炎(如血液和尿促炎介质所证明)和血流灌注不足(如血清HFABP和VEGF增加所证明)双重伤害的患者，保护性尿液抗炎反应不足变得很重要。

在AKI组中，对于包括D5肾功能障碍在内的所有终点，术前VEGF均被确定较高(P<0.001)。VEGF被认为是直接的低灌注/缺氧标志物。

不希望受到理论的束缚，认为在心脏手术后，心脏固定后，通常改善了整体灌注和充氧。手术后HFABP通常不指示手术后总体充氧和灌注。可以认为术后HFABP更能指示术中损伤的程度，进而可以预测AKI。

在大多数直接的低风险病例中，手术后血流灌注不足/缺氧通常不是问题，因为在进行心脏手术后，心脏会重新血管化，并且受试者通常会通过氧气的补充进行机械通气，从而获得超生理性的pO2。在测量时，VEGF作为血流灌注不足和缺氧的标志物，可以指示人工补充了氧。但是，术后的VEGF升高可能特别显著。

因此，术前VEGF被认为是CPB围手术期灌注不足倾向的预测指标(predictive ofvulnerability)，其标记的AKI风险扩大至第五天(D5)。

在骨折受试者中，已确定在所测量的几乎所有血液促炎症介质和抗炎介质中均观察到围手术期增加，其中与正常肾功能受试者比较，肾功能障碍组的一些促炎介质(术前和术后)和一些抗炎介质显示显著增加。

认为在创伤后骨科手术患者中，观察到的与心脏手术相关的术前和术后有关血细胞因子和尿细胞因子及抗炎/促炎细胞因子比率的测定结果相似，不同之处在于，响应骨折创伤，创伤后术前样品的基线值会有所增加。

对于骨折的受试者，认为是如下比率尤其重要：

TNFsr1(UA)/HFABP(SA)(D0 AKI)(AKI较低)

TNFsr1(UB)/HFABP(SB)(D0，D1，D5)(AKI较低)

TNFsr2(UA)/HFABP(SA)(D0 AKI)(AKI较低)

TNFsr2(UB)/HFABP(SB)(D0，D1，D2，D5)(AKI较低)

UA指“前”尿样，UB指“后”尿样。这同样适用血清。

对于骨折患者-D0＝手术前(这也可以是在初次创伤后3-4天)

D1＝手术后24小时

D5＝手术后5天

和

TNFsr2UB/TNFSR2(SB)(D5AKI)(AKI中较低)

在心脏病患者中也考虑到了这一点，其中AKI患者的术后尿液TNFsr2/血清HFABP的比率下降，这表明器官灌注不足(由如增加的血清HFABP所指示)对那些未产生足够的抗炎尿液TNFs2反应的患者尤其有害。

肾功能障碍患者的术后尿液抗炎介质/血液促炎介质的比率通常低于正常肾病患者。

此外认为在非AKI患者中，血液中增加的TNFα与尿液中TNFsr2的相关性较弱，但显著。这可能表明在AKI患者中，术后尿液TNFsr2的代偿性升高受到损害：并且即使肾功能正常，术前也可能存在这种缺陷的趋势。

表8

血浆TNFαvs尿液TNFsr2–心脏TNFSR2 UB/HFABP SB

---------------------------------------------------

血浆TNFα与尿液TNFsr2的相关性

表10

TNFSR2 UA/HFABP SA

表11

TNFSR2 UB/HFABP SB

表12

在心脏研究中，已确定几乎所有测量的血液促炎介质和抗炎介质均在围手术期增加，与正常肾功能患者相比，在任何时候的肾功能障碍组中两种促炎介质(术前和术后TNFα，IP10，IL12p40，MIP1alpha，MCP1和NGAL；术后IL 8和Midkine；术前IL 6)和抗炎介质(术前和术后TNFsr1，TNFsr2和IL1ra；术后IL 10)显示出显著更大的增加。这项研究表明，与那些保留正常肾功能的患者相比，那些术后形成肾功能障碍的患者具有一系列促炎性标志物(例如TNFa，IP10，IL12p40，MIP1alpha，MCP1，NGAL和IL6)的更高的基线术前血液浓度以及血液中更大的术后促炎反应(例如TNFa，IP10，IL12p40，MIP1alpha，MCP1，NGAL，IL8和Midkine)。

确定血液抗炎介质/血液促炎介质的比率在肾功能障碍组中始终显示出较高的抗炎/促炎比率(这些差异在术前和术后sTNFsr1/血浆TNF，sTNFsr1/血浆MCP1，sTNFsr2/血浆TNFalpha，sTNFsr2/血浆IL8，sTNFsr2/sIP10，sTNFsr2/血浆MCP1；术前sTNFsr1/血浆IL8，sTNFsr1/sIP10，sTNFsr1/血浆MIP1alpha，sTNFsr2/血浆NGAL，sTNFsr2/血浆/血浆NGAL；后sTNFsr1/血浆IL6，sTNFsr2/血浆IL6，sIL1ra/血浆TNFalpha，sIL1ra/血浆IL8，sIL1ra/血浆IL6，sIL1ra/sIP10，sIL1ra/血浆MCP1，sIL1ra/血浆NGAL中显著)。

在心脏和骨折研究中，与血液相反，尿液中的抗炎/促炎比率始终低于正常肾功能患者。在心脏研究中，对于任何时候的肾功能障碍，在以下比率上的这些差异均显著：术后uTNFsr1/uIP10；术后uTNFsr1/uNGAL；术后uTNFsr2/uIP10；术后uTNFsr2/uNGAL；术后uIL1ra/uIP10；术后uIL1ra/uIL12p40；术后uIL1ra/uNGAL。对于D5型肾功能障碍患者，在以下比率上这些差异也很显著：术后uTNFsr2/uIL12p40；术后uIL1ra/uIP10；术后uIL1ra/uIL12p40；术后uIL1ra/uNGAL。

肾功能障碍患者的术后尿液抗炎介质/血液促炎介质的比率通常低于正常肾功能患者。对于任何时候的肾功能障碍，在以下术后比率上的这些差异均显著：uTNFsr1/sIL12p40，uTNFsr1/sMidkine，uTNFsr2/sIL12p40，uTNFsr2/pMIP1alpha，uTNFsr2/sMidkine，uTNFsr2/pNGAL，uIL1ra/pTNF pIL8，uIL1ra/pIL6，uIL1ra/sIP10，uIL1ra/sIL12p40，uIL1ra/pMIP1alpha，uIL1ra/pMCP1，uIL1ra/sMidkine，uIL1ra/pNGAL。

尽管在正常肾功能组和肾功能障碍组之间的术前uTNFSR1/血液促炎或uTNFsr2/血液促炎比率没有差异，但在一些术前uIL1ra/血液促炎比率，即术前uIL1ra/pIL6，uIL1ra/sIL12p40，uIL1ra/pMIP1alpha，uIL1ra/pNGAL也明显低于后来形成这些疾病的人群。对于临床医生特别感兴趣的是，对于第五天(D5)肾功能障碍患者，在以下术后比率中，这些差异也是显著的：术后uTNFsr2/pIL8，uTNFsr2/sIL12p40，uTNFsr2/pMIP1alpha，uTNFsr2/pNGAL，uIL1ra/pTNFalpha，uIL1ra/pIL8，uIL1ra/sIL12p40，uIL1ra/pMIP1alpha，uIL1ra/pMCP1，uIL1ra/sMidkine，uIL1ra/pNGAL，并且要注意术前uIL1ra/pIL6，uIL1ra/sIL12p40，uIL1ra/pMIP1的术前比率。

如果肾功能障碍组的尿液抗炎/血液促炎比率(与血液抗炎/血液促炎比率相比)低于正常肾功能受试者，可以推断，相比于正常肾功能患者，在肾功能障碍患者中，滤过的血液促炎介质未被肾内代偿性抗炎反应很好地平衡。。在肾功能障碍组中，血液促炎介质和尿液抗炎介质之间存在负相关性，这进一步证实了这一点。

尿液TNFsr2/血清HFABP的比率

最后，在心脏病患者中，AKI患者术后尿液TNFsr2/血清HFABP的比率下降，这表明如由升高的血清HFABP所表示的器官灌注不足对那些未产生足够的抗炎尿液TNFs2反应的患者尤其有害。

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