一种桔梅奇酵母固体制剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种桔梅奇酵母固体制剂及其制备方法和应用，属于果蔬保护剂技术领域。桔梅奇酵母固体制剂包括冻干保护剂，固体载体，润湿剂，分散剂和桔梅奇酵母菌。其制备方法为：将桔梅奇酵母接种培养，得到酵母菌悬浮液，然后与冻干保护剂溶液混合，加入固体载体，冻干，粉碎，加入润湿剂和分散剂，混匀，即得。本发明的桔梅奇酵母固体制剂，以桔梅奇酵母菌为主要原料，并辅以安全无毒的冻干保护剂，以及具有良好悬浮性，湿润性和分散性的固体载体，润湿剂和分散剂，相比于现有的固体化学保鲜剂，具有安全环保，抑菌谱广泛，活性较高，方便使用，生防效力高等优点，在采后果蔬病原菌浸染的防治方面，具有实用价值，适宜推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及果蔬保护剂技术领域，具体涉及一种桔梅奇酵母固体制剂及其制备方法和应用。

背景技术

在柑橘果实采收、转运、贮藏以及销售过程中，极易受到各种病原真菌侵染导致果实腐烂。主要的侵染性病害包括：Penicillium digitatum引起的柑橘绿霉病，Penicilliumitalicum引起的柑橘青霉病，Geotrochum citri-aurantii引起的柑橘酸腐病，以及Colletotrichum gloeosporioides引起的柑橘炭疽病。目前对于柑橘果实采后病害的防控措施包括物理防治、化学防治、生物防治。与常用的化学杀菌剂相比，生物防治是一种更安全、健康和环境友好的防治措施，主要利用某些微生物对采后病原菌的拮抗效应，从而降低病原菌在果实表面的群落数量及致病力，达到对病害的防治作用，同时生物防治常表现出一定的广谱抑菌性使其作用范围更加广泛。因此，亟需开发安全有效、环境友好并可弥补化学杀菌剂缺陷的新型制剂。

桔梅奇酵母(Metschnikowia citriensis)作为可效防治柑橘果实采后青霉病、绿霉病、酸腐病和炭疽病的新种酵母，将其开发为新型生物制剂具有极大应用潜力。除液体制剂外，可湿性粉剂是微生物农药制剂的主要应用剂型之一。但可湿性粉剂成功应用的关键在于助剂的加入对微生物无不良影响，以及固体制剂具有较好的润湿性和分散性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桔梅奇酵母固体制剂及其制备方法。

经研究，本发明提供以下技术方案：

1、一种桔梅奇酵母固体制剂，所述桔梅奇酵母固体制剂按重量百分比计，包括10～25％冻干保护剂，60～80％固体载体，5～15％润湿剂，5～15％分散剂，其余为桔梅奇酵母菌冻干粉。

优选的，所述冻干保护剂按重量份计，由1～9份蔗糖，1～7份谷氨酸钠和1～9份脱脂奶粉组成，或由7.5～12.5份脱脂奶粉，0.5～1.5份抗坏血酸和7.5～12.5份海藻糖组成，或由26～30份脱脂奶粉，22～26份乳糖和4.6～5份抗坏血酸钠组成。

更优选的，所述冻干保护剂按重量百分比计，由1～9份蔗糖，1～7份谷氨酸钠和1～9份脱脂奶粉组成。

优选的，所述固体载体为惰性固体载体。

优选的，所述惰性固体载体为白炭黑、高岭土或硅藻土。

更优选的，所述惰性固体载体为硅藻土。

优选的，所述润湿剂为十二烷基硫酸钠，十二烷基苯磺酸钠或皂角粉。

更优选的，所述润湿剂为皂角粉。

优选的，所述分散剂为亚甲基二萘磺酸钠，聚乙二醇，木质素磺酸钠，羧甲基纤维素钠或多聚磷酸钠。

更优选的，所述分散剂为亚甲基二萘磺酸钠。

2、上述桔梅奇酵母固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

将桔梅奇酵母菌接种到酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基上，在28℃条件下活化培养48h；

用接种环挑取2环YPD培养基上的酵母单菌落至YPD液体培养基中，在28℃条件下，200r/min摇床培养20-24h，得发酵种子液；

将发酵种子液按5％的比例加入新的YPD培养基中，在28℃条件下，200r/min摇床培养48h，结束后将培养液在4℃条件下，离心，收集菌体，洗涤，重悬，得酵母菌悬浮液；

将保护剂按配方比例溶解至水中，制成冻干保护剂溶液；

将酵母菌悬浮液与冻干保护剂溶液混合后，加入固体载体吸附，冷冻干燥，粉碎后得到混合酵母菌粉，然后再加入润湿剂和分散剂，混合均匀，即得桔梅奇酵母固体制剂。

优选的，所述冻干保护剂溶液中，每升水中加入物质的质量百分含量为：蔗糖6.06％，谷氨酸钠3.4％和脱脂奶粉5.43％。

优选的，所述冻干保护剂溶液中，每升水中加入物质的质量百分含量为：脱脂奶粉10％，抗坏血酸1％和海藻糖10％。

优选的，所述冻干保护剂溶液中，每升水中加入物质的质量百分含量为：脱脂奶粉28％，乳糖24％和抗坏血酸钠4.8％。

优选的，所述润湿剂和分散剂添加的重量百分比例为酵母菌粉的5％。

优选的，所述培养液在4℃条件下，以转速为4000r/min进行离心10min。

优选的，所述洗涤采用无菌水洗涤两次。

优选的，所述重悬采用无菌水重悬菌体。

优选的，所述酵母菌悬浮液中细胞浓度为2×10

3、上述桔梅奇酵母固体制剂在采后果蔬中作为保护剂的应用。

桔梅奇酵母(Metschnikowia citriensis)由西南大学食品贮藏与物流研究中心提供，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC NO.33213。该菌种接种于NYDA斜面，4℃条件下保藏，每两个月活化一次。

本发明的有益效果在于：

1)本发明的桔梅奇酵母固体制剂，通过在桔梅奇酵母菌悬浮液中加入保护剂以提高酵母均的生物活性；加入固体载体，以提高桔梅奇酵母菌的悬浮率；加入润湿剂以缩短桔梅奇酵母菌的润湿时间；加入分散剂，以进一步提高桔梅奇酵母菌的悬浮率和分散性；同时，通过优化配比及其相互之间的协同作用，以增强酵母菌的胁迫耐受性，从而提高桔梅奇酵母菌在保存过程中的存活率，以及润湿性和分散性；

2)本发明的桔梅奇酵母固体制剂的制备方法，通过将桔梅奇酵母接种到YPD培养基上活化培养后，在接种环上挑取2环YPD培养基上的酵母单菌落至YPD液体培养基中进行培养，得发酵液，以发酵液为种子液，加入YPD培养基中进行培养，处理后得酵母菌悬浮液，具有操作简单、条件温和、安全环保等优点；

3)本发明的桔梅奇酵母固体制剂，以桔梅奇酵母菌为主要原料，并辅以安全无毒，且能提高桔梅奇酵母菌的活菌量的冻干保护剂，以及具有良好悬浮性，湿润性和分散性的固体载体，润湿剂和分散剂，相比于现有的固体化学保鲜剂，具有安全环保，抑菌谱广泛、活性较高，方便使用，生防效力高等优点，在采后果蔬病原菌浸染的防治方面，具有实用价值，适宜推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例2中不同保护剂加入桔梅奇酵母菌冻干后酵母菌的存活率；

图2为本发明实施例7中活菌数，润湿时间和悬浮率交互影响等值线图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种桔梅奇酵母固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

将桔梅奇酵母菌接种到酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基上，在28℃条件下活化培养48h；

用接种环挑取2环YPD培养基上的酵母单菌落至YPD液体培养基中，在28℃条件下，200r/min摇床培养22h，得发酵种子液；

将发酵种子液按5％的比例加入新的YPD培养基中，在28℃条件下，200r/min摇床培养48h，结束后将培养液在4℃条件下，4000r/min离心10min，收集菌体，无菌水洗涤两次后，用无菌水重悬菌体，得酵母菌悬浮液，并调整细胞浓度为2×10

取蔗糖6.06g，谷氨酸钠3.4g和脱脂奶粉5.43g溶解至1L无菌水中，制成冻干保护剂溶液；

将酵母菌悬浮液与冻干保护剂溶液等体积混合后，加入硅藻土吸附，根据硅藻土的最大吸附容量确定酵母菌悬液体积，硅藻土的最大吸附容量为2.3±0.3L/kg，冷冻干燥，粉碎后得到混合酵母菌粉，然后再加入按混合酵母菌粉的总量比例5％的皂角粉和5％的亚甲基二萘磺酸钠，混合均匀，即得桔梅奇酵母固体制剂。

实施例2

本实施例研究了不同冻干保护剂的配方对桔梅奇酵母菌体存活率的影响。具体操作为：所有保护剂按如下配方比例溶解至无菌水中以制备冻干保护剂溶液，具体配方如下：

配方A：每1L无菌水中，加入的质量百分含量为：蔗糖6.06％，谷氨酸钠3.4％和脱脂奶粉5.43％；(该配方来源于参考文献，Niu X,Deng L,Zhou Y,et al.Optimization ofa protective medium for freeze-dried Pichia membranifaciens and applicationof this biocontrol agent on citrus fruit[J].Journal of applied microbiology,2016,121(1):234-243.)

配方B：每1L无菌水中，加入的质量百分含量为：脱脂奶粉10％，抗坏血酸钠1％和海藻糖10％；(该配方来源于参考文献，李侨飞.拟粉红锁掷孢酵母Y16控制葡萄采后病害及其机制和制剂化研究[D].江苏:江苏大学，2017.)

配方C：每1L无菌水中，加入的质量百分含量为：脱脂奶粉28％，乳糖24％和抗坏血酸钠4.8％；(该配方来源于参考文献，Chen H,Chen S,Li C,et al.Response surfaceoptimization of lyoprotectant for Lactobacillus bulgaricus during vacuumfreeze-drying[J].Preparative Biochemistry and Biotechnology,2015,45(5):463-475.)

将实施例1中制得的酵母菌悬浮液分别与配方A，配方B和配方C的冻干保护剂溶液等体积混合均匀后进行冷冻干燥，然后测定冷冻干燥后的混合物中，酵母菌的存活率，即测定冷冻干燥前混合物和冷冻干燥后的混合物加入无菌水复水活化后酵母活菌数，采用稀释平板涂布法进行。结果如图1所示。图1中不同小写字母表示具有显著性差异，p<0.05。

从图1中分析可知，经过测定，配方A与酵母菌悬浮液混合冷冻干燥后的混合物中，酵母菌的存活率为82.05％±6.08％；配方B与酵母菌悬浮液混合冷冻干燥后的混合物中，酵母菌的存活率为59.08％±5.31％；配方C与酵母菌悬浮液混合冷冻干燥后的混合物中，酵母菌的存活率为73.14％±4.10％。从而证明了，配方A与酵母菌悬浮液混合冷冻干燥后的混合物中，酵母菌的存活率显著高于其他保护剂配方。

实施例3

本实施例研究了固体载体种类对桔梅奇酵母固体制剂理化性质的影响。具体为：将实施例1中的硅藻土替换为白炭黑或高岭土，其余实验条件和步骤与实施例1中相同。然后对三种不同固体载体种类制得的桔梅奇酵母固体制剂的悬浮率，润湿时间，活菌量和吸附容量进行测定，结果如表1所示。

悬浮率参照GB/T 14825-2006的方法进行测定；润湿时间参照GB 5451-2001的方法进行测定。

表1 载体种类对M.citriensis酵母固体制剂理化性质的影响

注：表中同一列的不同字母表示结果具有显著性差异，且p<0.05。

从表1中分析可知，白炭黑和硅藻土的有效释放活菌数较高且无显著性差异，其次是高岭土；白炭黑的生物相容性和吸附量较大，但悬浮率较低，润湿时间时间较长；硅藻土的悬浮率较高，润湿时间较短。由此可见，以硅藻土作为固体载体相比于白炭黑和高岭土更优。

实施例4

本实施例研究了润湿剂种类对桔梅奇酵母固体制剂理化性质的影响。具体为：将实施例1中的皂角粉替换为十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠，其余实验条件和步骤与实施例1中相同。然后对三种不同润湿剂种类制得的桔梅奇酵母固体制剂，以及实施例1中未添加任何润湿剂的混合酵母菌粉的悬浮率，润湿时间和活菌量进行测定，结果如表2所示。其中，润湿时间越短，桔梅奇酵母固体制剂的润湿性越好。

表2 润湿剂种类对M.citriensis酵母固体制剂理化性质的影响

注：表中同一列的不同字母表示结果具有显著性差异，且p<0.05。

从表2中分析可知，未添加任何润湿剂的混合酵母菌粉的润湿时间最长，十二烷基苯磺酸钠的润湿时间最短，皂角粉与十二烷基硫酸钠无显著差异；活菌量最高的是皂角粉，其次是未添加任何润湿剂的混合酵母菌粉，十二烷基苯磺酸钠和十二烷基硫酸钠，且皂角粉加入后高于其余两种润湿剂一个数量级，从而证明了皂角粉的生物相容性最好；悬浮率最高的是十二烷基苯磺酸钠，其次是十二烷基硫酸钠和皂角粉，未添加任何润湿剂的混合酵母菌粉的悬浮率最低。综合分析可知，以皂角粉作为润湿剂优于十二烷基苯磺酸钠和十二烷基硫酸钠。

实施例5

本实施例研究了分散剂种类对桔梅奇酵母固体制剂理化性质的影响。具体为：将实施例1中的亚甲基二萘磺酸钠替换为聚乙二醇，木质素磺酸钠，羧甲基纤维素钠或多聚磷酸钠，其余实验条件和步骤与实施例1中相同。然后对五种不同分散剂种类制得的桔梅奇酵母固体制剂，以及实施例1中未添加任何润湿剂的混合酵母菌粉的悬浮率，润湿时间和活菌量进行测定，结果如表3所示。其中，悬浮率越高，桔梅奇酵母固体制剂的分散性越好。

表3 分散剂种类对M.citriensis酵母固体制剂理化性质的影响

注：表中同一列的不同字母表示结果具有显著性差异，且p<0.05。

从表3中分析可知，未添加任何分散剂的混合酵母菌粉的悬浮率最低，不同种类分散剂的加入均可提高桔梅奇酵母菌粉的分散率。其中，悬浮性最好的是亚甲基二萘磺酸钠，其次为聚乙二醇，木质素磺酸钠，羧甲基纤维素钠和多聚磷酸钠。活菌量较好的有亚甲基二萘磺酸钠和木质素磺酸钠。综合分析分散剂与菌体的生物相容性和加入后制剂的润湿时间，以亚甲基二萘磺酸钠作为分散剂优于其他分散剂。

实施例6

本实施例研究了润湿剂-皂角粉和分散剂-亚甲基二萘磺酸钠的添加比例对桔梅奇酵母固体制剂理化性质的影响。具体为：将实施例1中，皂角粉的添加比例替换为10％或15％，或者将亚甲基二萘磺酸钠的添加比例替换为10％或15％，其余实验条件和步骤与实施例1中相同。然后将不同添加比例的皂角粉制得的桔梅奇酵母固体制剂，不同添加比例的亚甲基二萘磺酸钠制得的桔梅奇酵母固体制剂，以及实施例1中未添加任何润湿剂的混合酵母菌粉的悬浮率，润湿时间和活菌量进行测定，结果如表4所示。

表4 添加量对M.citriensis酵母固体制剂理化性质的影响

从表4中分析可知，随着皂角粉添加量的增加，桔梅奇酵母固体制剂悬浮率呈逐渐增加的趋势，但随着皂角粉浓度增加，桔梅奇酵母固体制剂的活菌量会降低。亚甲基二萘磺酸钠的加入量的增加，可以改善桔梅奇酵母固体制剂的悬浮效果，同时也能够降低制剂的润湿时间，改善润湿性，但随着亚甲基二萘磺酸钠加入量的增加，不仅降低了桔梅奇酵母粉的比例，同时还造成了菌体的大量死亡，因此，以皂角粉和亚甲基二萘磺酸钠的添加量为5％为宜。

实施例7

本实施例进一步研究了皂角粉，亚甲基二萘磺酸钠和混合酵母菌粉的添加比例对桔梅奇酵母固体制剂理化性质的影响。具体为：将实施例1中的皂角粉替换为7.5％，10％，12.5％或15％，或者亚甲基二萘磺酸钠替换为7.5％，10％，12.5％或15％，以及或者将混合酵母菌粉替换为70％，75％，80％或85％，其余实验条件和步骤与实施例1中相同。然后将不同添加比例的皂角粉制得的桔梅奇酵母固体制剂，不同添加比例的亚甲基二萘磺酸钠制得的桔梅奇酵母固体制剂的悬浮率，润湿时间和活菌量进行测定，结果如表5所示，并通过皂角粉，亚甲基二萘磺酸钠和混合酵母母粉的加入量进行活菌数，润湿时间和悬浮率三个值进行响应交互分析，结果如图2所示。

表5 添加比例对M.citriensis酵母固体制剂理化性质的影响

图2中白色区域表示为活菌数、润湿时间、悬浮率三个响应值交互后的最佳区域，根据表5和图2中综合分析可知，当皂角粉的添加比例为5.69％，亚甲基二萘磺酸钠的添加比例为8.74％和混合酵母粉为85.57％时，得到的M.citriensis酵母固体制剂的润湿时间，悬浮率和活菌量较优。

实施例8

将实施例7当皂角粉的添加比例为5.69％，亚甲基二萘磺酸钠的添加比例为8.74％和混合酵母粉为85.57％时，得到的M.citriensis酵母固体制剂的悬浮率，润湿时间和活菌量进行检测，并与预测值进行对比分析。结果如表6所示。

表6 实测和预测的对比结果

从表6中分析可知，实施例7中，通过响应面优化曲线分析制得的M.citriensis酵母固体制剂的各项指标的实测值与预测值接近，从而证明了该优化区域中所得的制剂配方的可行性。

综上可知，本发明的桔梅奇酵母固体制剂，通过在桔梅奇酵母菌悬浮液中加入保护剂以提高酵母均的生物活性；加入固体载体，以提高桔梅奇酵母菌的悬浮率；加入润湿剂以缩短桔梅奇酵母菌的润湿时间；加入分散剂，以进一步提高桔梅奇酵母菌的悬浮率和分散性；同时，通过优化配比及其相互之间的协同作用，以增强酵母菌的胁迫耐受性，从而提高桔梅奇酵母菌在保存过程中的存活率，以及润湿性和分散性。本发明的桔梅奇酵母固体制剂的制备方法，通过将桔梅奇酵母接种到YPD培养基上活化培养后，在接种环上挑取2环YPD培养基上的酵母单菌落至YPD液体培养基中进行培养，得发酵液，以发酵液为种子液，加入YPD培养基中进行培养，处理后得酵母菌悬浮液，具有操作简单、条件温和、安全环保等优点。本发明的桔梅奇酵母固体制剂，以桔梅奇酵母菌为主要原料，并辅以安全无毒，且能提高桔梅奇酵母菌的活菌量的冻干保护剂，以及具有良好悬浮性，湿润性和分散性的固体载体，润湿剂和分散剂，相比于现有的固体化学保鲜剂，具有安全环保，抑菌谱广泛、活性较高，方便使用，生防效力高等优点，在采后果蔬病原菌浸染的防治方面，具有实用价值，适宜推广应用。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。