用于抑制CTGF表达的组合物

摘要

本发明涉及用于抑制CTGF表达的组合物，该组合物能够借助RNA干扰(RNAi)抑制CTGF的表达水平，并且本发明涉及能够以优异的功效预防或治疗各种纤维增生性疾病例如肥厚性瘢痕和瘢痕瘤的组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及高效抑制CTGF表达并且对纤维增生性疾病具有优异的预防或治疗效果的组合物。

背景技术

组织重建(tissue remodeling)是响应于生理或病理应激而重建现有组织。病理生理学中的组织重建的特征在于结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、肌纤维分化和活化、细胞外基质(ECM)的沉积和纤维化的过表达。在各种信号分子和因子中，CTGF被认为是组织重建中必不可少的介质。CTGF参与多种多样的信号转导通路，导致细胞粘附和迁移、ECM重建和器官结构的改变。组织重建和纤维化与许多纤维化病症例如肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、糖尿病视网膜病变和皮肤纤维化(瘢痕瘤和肥厚性瘢痕)有关。

使皮肤的伤口愈合的过程非常复杂并且由炎症、细胞分化和增殖、以及组织重建(包括胶原蛋白生成)的相互重叠的阶段构成。一些细胞因子和生长因子、尤其是TGF-β在伤口愈合的早期和晚期起重要作用。TGF-β通过CTGF上调来介导白细胞迁移、血管生成、成纤维细胞迁移和ECM组分(胶原蛋白和纤连蛋白)生成。由于已经在患有肥厚性瘢痕和瘢痕瘤的患者中观察到CTGF的过表达，因此抑制CTGF表达是调节可以抑制或逆转纤维化过程的纤维化机制的有吸引力的策略。

已经研究了很多抗体或反义寡核苷酸在抑制CTGF表达或者减少过量胶原蛋白生成和纤维化方面的作用。siRNA是用于CTGF抑制的有前景的候选物之一。由siRNA诱导的RNA干扰由识别与序列互补的靶mRNA并且将其切割的高特异性且高效的基因沉默机制来介导。尽管上述物质作为新型治疗剂具有高的潜力，但是存在若干限制和障碍，例如，1)在生物系统中被核酸酶快速降解，2)维持有效siRNA剂量的困难，3)跨生物屏障的有效递送的困难。

迄今为止，已经开发了阳离子聚合物、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒和各种纳米材料用于siRNAs的递送。阳离子聚合物和LNP的临床应用由于在体内的毒性和/或结构的不稳定性而应当谨慎实施，并且，病毒基因转移除了低包装能力(packaging capacity)以外，还导致突变形成。siRNA骨架的化学修饰可以增强稳定性和细胞摄取，但是可能仍有如下缺点，例如，高费用、劳动强度大且耗时的过程，以及给予大量的siRNA以在靶细胞中达到令人满意的疗效。

发明内容

本发明的目的在于提供通过高效抑制CTGF表达而具有优异的预防或治疗纤维增生性疾病的效果的组合物。

1.一种用于抑制CTGF基因表达的组合物，其包含由与SEQ ID NO：1的序列互补10个以上的核苷酸的序列构成的核酸分子。

2.根据上述1的组合物，其中核酸分子由与SEQ ID NO：1的序列互补16个以上的核苷酸的序列构成。

3.根据上述1的组合物，其中核酸分子由与SEQ ID NO：1的整个序列互补的序列构成。

4.根据上述1的组合物，其中核酸分子形成siRNA、dsRNA、PNA或miRNA的链。

5.根据上述4的组合物，其中组合物包含选自由以下组成的组中的至少一种siRNA或dsRNA：由具有SEQ ID NO：1的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：2的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：3的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQID NO：52的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：53的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQID NO：54的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：55的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：56的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：57的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：58的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：59的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：60的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：61的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：62的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：63的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：64的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：65的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：66的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQID NO：67的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：68的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQID NO：69的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：70的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：71的序列的反义RNA构成的siRNA；以及由具有SEQ ID NO：72的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA。

6.根据上述5的组合物，其在正义RNA序列和反义RNA序列的3’末端进一步包含UU或dTdT的序列。

7.根据上述4的组合物，其进一步包含至少一种由选自由SEQ ID NO：87至SEQ IDNO：99的序列组成的组中的一个序列构成的PNA。

8.根据上述7的组合物，其中PNA的至少一个末端进一步结合至具有选自由SEQ IDNO：101至SEQ ID NO：113组成的组中的至少一个序列的肽、或者mPEG

9.一种用于预防或治疗纤维增生性疾病的药物组合物，其包含根据上述1至8中任一项的组合物。

10.根据上述9的组合物，其中纤维增生性疾病为选自由以下疾病组成的组中的至少一种：肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、囊性纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、硬皮病、糖尿病视网膜病变、杜兴型肌营养不良、放射诱导的纤维化、心肌纤维化、糖尿病肾病、慢性肾衰竭、慢性病毒性肝炎、胆汁性纤维化、脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、增生性玻璃体视网膜病变、肌肉骨骼肿瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、卵巢癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、肾硬化、结节病、青光眼、黄斑变性、视网膜下纤维化、脉络膜血管生成、玻璃体视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变、角膜炎、翼状胬肉、眼科疾病、硬皮病、子宫肌瘤、全身性硬化症、肾小球肾炎、人类免疫缺陷性病毒性肾病、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、雷诺病、类风湿性关节炎、多肌炎、血管狭窄、牙周炎和牙周牙龈。

11.一种用于抑制CTGF基因表达的组合物，其包含：携带与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的多孔二氧化硅颗粒，

其中，多孔二氧化硅颗粒通过如下来制备：使具有孔径小于5nm的孔的二氧化硅颗粒与扩张剂(swelling agent)在120至180℃下反应24至96小时以使孔径小于5nm的孔扩张；并且将具有扩张的孔的二氧化硅颗粒在400℃以上的温度下煅烧至少3小时，

其中多孔二氧化硅颗粒的平均直径为100至1000nm，BET表面积为200至700m

其中多孔二氧化硅颗粒的特征在于，在下式1中的吸光度比达到1/2时，t为24以上，

[式1]

A

(其中A

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部和外部，

悬浮液的pH为7.4，和

A

12.根据上述11的组合物，其中多孔二氧化硅颗粒在中性pH下、在多孔二氧化硅颗粒的外表面上或孔的内部带正电荷或不带电荷。

13.根据上述11的组合物，其中多孔二氧化硅颗粒具有亲水性官能团或疏水性官能团。

14.根据上述11的组合物，核酸分子与SEQ ID NO：1的序列有10个以上的核苷酸互补。

15.根据上述11的组合物，核酸分子与SEQ ID NO：1的序列有16个以上的核苷酸互补。

16.根据上述11的组合物，其中核酸分子由与SEQ ID NO：1的整个序列互补的序列构成。

17.根据上述11的组合物，其中核酸分子形成siRNA、dsRNA、PNA或miRNA的链。

18.根据上述17的组合物，其中组合物包含选自由以下组成的组中的至少一种siRNA或dsRNA：由具有SEQ ID NO：1的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：2的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：3的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：52的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：53的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：54的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：55的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：56的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：57的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：58的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：59的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：60的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：61的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：62的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：63的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：64的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：65的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：66的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：67的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：68的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：69的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：70的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：71的序列的反义RNA构成的siRNA；以及由具有SEQ IDNO：72的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA。

19.根据上述18的组合物，其在正义RNA序列和反义RNA序列的3’末端进一步包含UU或dTdT的序列。

20.根据上述17的组合物，其进一步包含至少一种由选自由SEQ ID NO：87至SEQID NO：99的序列组成的组中的一个序列构成的PNA。

21.根据上述20的组合物，其中PNA的至少一个末端进一步结合至具有选自由SEQID NO：101至SEQ ID NO：113组成的组中的至少一个序列的肽、或者mPEG

22.一种用于预防或治疗纤维增生性疾病的药物组合物，其包含根据上述11至21中任一项的组合物。

23.根据上述22的组合物，其中纤维增生性疾病为选自由以下疾病组成的组中的至少一种：肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、囊性纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、硬皮病、糖尿病视网膜病变、杜兴型肌营养不良、放射诱导的纤维化、心肌纤维化、糖尿病肾病、慢性肾衰竭、慢性病毒性肝炎、胆汁性纤维化、脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、增生性玻璃体视网膜病变、肌肉骨骼肿瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、卵巢癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、肾硬化、结节病、青光眼、黄斑变性、视网膜下纤维化、脉络膜血管生成、玻璃体视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变、角膜炎、翼状胬肉、眼科疾病、硬皮病、子宫肌瘤、全身性硬化症、肾小球肾炎、人类免疫缺陷性病毒性肾病、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、雷诺病、类风湿性关节炎、多肌炎、血管狭窄、牙周炎和牙周牙龈。

本发明的组合物包含能够有效地抑制CTGF和胶原蛋白的表达的核酸分子，从而预防或治疗由于CTGF或胶原蛋白的过表达导致的各种各样的纤维增生性疾病。

附图说明

图1为示意性地示出由于通过病理通路诱导的CTGF的过表达导致的肥厚性瘢痕和瘢痕瘤的细胞机理以及借助LEM-S401有效抑制CTGF表达的原理的图。

图2和图3为示出在用不同剂量的LEM-S401(12.5、25、50、100nM)分别处理A549细胞(图2)和HaCaT细胞(图3)6小时之后通过12ng/ml TGF-β来诱导CTGF表达、以及使用RT-PCR进行的CTGF mRNA表达水平与对照(未处理、仅siCTGF处理、仅DegradaBALL处理、和杂乱siRNA处理(scrambled siRNA treatment))的比较(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005)的图。

图4和图5为示出在用携带siCTGF的脂质纳米颗粒(LNP)和LEM-S401分别处理A549细胞(图4)和HaCaT细胞(图5)之后这些细胞之间的比较的图，其中将细胞温育72小时和96小时，然后在收获细胞前12小时使用TGF-β进行处理(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005)。

图6示出在不同时间点(第1天、第3天、第5天)拍摄的切除的小鼠皮肤的荧光图像以测量在将LEM-S401皮下注射至小鼠皮肤中之后siCTGF和DegradaBALL在LEM-S401注射部位的皮肤停留时间(左，比例尺：25mm)；并且示出在DAPI染色后通过与上述相同的方法处理的皮肤切片的荧光图像(右，比例尺：100μm)。

图7示出在不同时间点拍摄的、皮下注射有未负载在DegradaBALL中的缀合有FITC的siCTGF的切除皮肤的荧光图像(左)；和在DAPI染色后通过与上述相同的方法处理的皮肤切片的荧光图像(比例尺：100μm)。

图8至图15为示出在第0天、第4天、第8天和第12天在小鼠皮肤伤口周围皮下注射LEM-S401(1nmol)的结果的图，具体地：图8至图10示出使用RT-PCR在第16天获得的CTGF以及1型和3型胶原蛋白的mRNA表达水平的测量结果；图11示出在处理的第10天，LEM-S401处理组与对照(缓冲液、仅DegradaBALL、仅siCTGF)之间受伤小鼠皮肤的图像中皮肤不规则度(skin irregularities)和柔软度的比较；图12示出在将分别用LEM-S401、游离siCTGF、仅DegradaBALL和缓冲液处理的皮肤切片分别用识别CTGF以及1型和3型胶原蛋白的抗体进行组织染色、然后用二抗处理所述皮肤切片之后所述皮肤切片的荧光图像(比例尺：100μm)；并且图13至图15示出基于图12中示出的图像的免疫组织化学数据的定量分析结果(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005)。

图16为示出通过CCK-8分析获得的随着DegradaBALL的浓度增加在A549细胞和HaCaT细胞中的毒性的测量结果的图。

图17为示出用2ng/ml TGF-β分别处理A549细胞和HaCaT细胞24小时的结果的图，其中，在不同时间点收获细胞，并且通过RT-PCR来分析CTGF表达水平。

图18至图24为示出在伤口形成后第10天、第14天、第18天和第22天将LEM-S401皮下注射至伤口部位的结果的图，具体地：图18至图20示出通过RT-PCR获得的CTGF以及1型和3型胶原蛋白在注射部位的mRNA表达水平的测量结果；图21示出通过免疫组织化学法测得的获得的小鼠皮肤的CTGF以及1型和3型胶原蛋白的荧光图像(比例尺：100μm)，并且图22至图24示出免疫组织化学数据的量化结果(P<0.05，**P<0.01，***P<0.005)。

图25示出在将负载在DDV(多孔二氧化硅颗粒、DegradaBALL)中的siRNA皮下注射至小鼠体内和将游离siRNA皮下注射至小鼠体内时，体内荧光图像的检测和比较结果。

图26和图27为示出以下siRNA在A549细胞和HaCaT细胞中的体内CTGF表达水平抑制能力的图：由具有SEQ ID NO：1的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：2的序列的反义RNA构成的siRNA(#1)；由具有SEQ ID NO：4的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：5的序列的反义RNA构成的siRNA(#2)；由具有SEQ ID NO：7的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：8的序列的反义RNA构成的siRNA(#3)，具体地：图26示出siRNA处理12小时后TGF-β处理的结果；并且图27示出TGF-β处理24小时后siRNA处理的结果。

图28为根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。

图29为根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。

图30为在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的制造过程中获得的小孔颗粒的显微照片。

图31为根据本发明的一个实施方案的小孔颗粒的显微照片。

图32为根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。

可降解的递送载体(Degradable Delivery Vehicle(DDV))为根据实施方案的颗粒，其中括号中的数字意指颗粒的直径并且下标的数字意指孔径。例如，DDV(200)

图33为鉴定根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性的显微照片。

图34为示出根据一个说明性实例的具有圆筒状渗透膜的管的视图。

图35为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图36为示出根据本发明的一个实施方案的各粒径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图37为示出根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图38为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度针对每种环境的pH随时间降低的结果的图。

图39为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。

图40为示出根据一个说明性实例的用于确认siRNA或dsRNA释放的管的视图。

图41为示出根据本发明的一个实施方案的负载在多孔二氧化硅颗粒中的siRNA随时间的释放程度的图。

具体实施方式

在本发明的详细描述中，定义了术语的特定含义，然而，术语的特定含义实质上以本领域技术人员所理解的通常含义被接受并且不旨在限于以下定义的特定含义。

“siRNA”是指能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子。siRNA可以抑制靶基因的表达，并且由此作为有效的基因敲低方法或基因治疗方法来提供。siRNA分子可以具有如下结构，其中正义链(对应于靶基因的mRNA序列的序列)和反义链(与靶基因的mRNA序列互补的序列)位于彼此相对的位置以形成双链。此外，siRNA分子可以有具有自身互补的正义链和反义链的单链结构。siRNA不限于其中RNA配对的完整配对的双链RNA部分，还可以包括由于错配(相应碱基不互补)、凸起(没有对应于一条链的碱基)等导致的受损部分。siRNA末端结构可以为平末端或粘性末端，只要靶基因的表达可以被RNAi(RNA干扰)效应抑制即可。粘性末端结构可以为3’末端突出结构和5’末端突出结构二者。此外，siRNA分子可以包括插入在自身互补的正义链和反义链之间的短核苷酸序列(例如，约5-15nt)。在该情况下，通过核苷酸序列的表达形成的siRNA分子可以通过分子内杂交形成发夹结构并且整体上形成茎环结构。该茎环结构可以在体外或体内进行加工，以产生能够介导RNAi的活性siRNA分子。

“dsRNA”为siRNA的前体分子，与含有靶细胞的DICER酶(核糖核酸酶III)的RISC复合物相遇，并且被切割成siRNA。在该过程中，产生了RNAi。dsRNA具有比siRNA长几个核苷酸的序列，并且可以具有如下结构，其中正义链(对应于靶基因的mRNA序列的序列)和反义链(与靶基因的mRNA序列互补的序列)位于彼此相对的位置以形成双链。

“PNA”是一种合成聚合物，其具有与DNA或RNA相似的结构，但是设计为不具有电荷(与DNA或RNA不同)，从而具有强的结合力，其中DNA和RNA分别具有脱氧核糖骨架或核糖骨架，而PNA的骨架具有通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单元的结构。以上结构为通过亚甲基(-CH

术语“核酸”意在包括任何PNA、DNA或RNA，例如，组织样品中存在的染色体、线粒体、病毒和/或细菌核酸。包括双链核酸分子的一条或两条链，并且还包括完整核酸分子的任何片段或部分。

术语“基因”是指在蛋白质编码或转录中或者在其它基因表达的调节中起到功能性作用的任何核酸序列或其部分。基因可以由任何编码功能性蛋白质的核酸或者编码或表达蛋白质的核酸的仅一部分构成。核酸序列可以包括外显子、内含子、起始区或终止区、启动子序列、其它调节序列、或与基因相邻的特定序列中的基因异常。

术语“基因表达”通常是指细胞过程，其中生物活性多肽由DNA序列产生并且在细胞中表现出生物学活性。从这个意义上讲，基因表达不仅包括转录过程和翻译过程，而且还包括可能影响基因或基因产物的生物学活性的转录后过程和翻译后过程。这些过程包括RNA合成、加工和转运、以及多肽合成、转运和多肽的翻译后修饰，但是不限于此。在不编码蛋白质产物的基因例如siRNA基因的情况下，术语“基因表达”是指从基因产生前体siRNA的过程。通常，该过程称为转录，尽管siRNA基因的转录产物不会通过翻译产生蛋白质，这与RNA聚合酶II对蛋白质编码基因诱导的转录不同。然而，由于术语“基因表达”在本文中使用，因此该术语涵盖由siRNA基因产生成熟siRNA。

术语“靶基因”是指使用作为本文中公开的主题的方法和组合物靶向调节的基因。因此，靶基因包括表达水平被siRNA下调至mRNA或多肽水平的核酸序列。类似地，术语“靶RNA”或“靶mRNA”是指靶基因的转录物，其与siRNA结合以诱导靶基因的表达的调节。

术语“转录”是指涉及表达诱导型基因与RNA聚合酶之间的相互作用的细胞过程，所述表达诱导型基因为存在于基因的编码序列中的结构信息的RNA。

表达“下调”是指与正常组织细胞相比，在活化细胞中通过细胞内基因转录或基因翻译显著降低特定基因向mRNA或蛋白质的表达。

术语“治疗”意指获得有益或期望的临床结果的方法。为了本发明的目的，有益或期望的临床结果包括而不限于症状的减轻、疾病范围的减小、疾病状态的稳定化(即，不恶化)、延迟或维持不变的疾病进展、疾病状态的改善或者暂时的缓解和减轻(部分或全部)，而无论其可以检测到或不能检测到。术语“治疗”还可以意指与未治疗时的预期存活率相比增加的存活率。所述治疗是指治疗性治疗和预防性或预防措施二者。此类治疗不仅包括要预防的病症的治疗，还包括已经发生的病症所需的治疗。

术语“预防”意指抑制或延迟相关疾病的发展的任何作用。对于本领域技术人员将显而易见的是，如果在疾病的发生之前给药，本发明的组合物可以预防初始症状或相关疾病。

下文中，将详细地描述本发明。

本发明提供用于抑制CTGF基因表达的组合物，其包含由与SEQ ID NO：1的序列互补10个以上的核苷酸的序列构成的核酸分子。

与SEQ ID NO：1的序列的互补性可以为10个以上的核苷酸(nucleotide；nt)、11个以上的核苷酸、12个以上的核苷酸、13个以上的核苷酸、14个以上的核苷酸、15个以上的核苷酸、16个以上的核苷酸、17个以上的核苷酸、或全部18个核苷酸。

核酸分子可以为siRNA、dsRNA、PNA或miRNA的单链，并且，在该情况下，siRNA、dsRNA、PNA或miRNA可以通过RNAi(RNA干扰(RNA interference))来抑制CTGF基因的表达。更具体地，在作为CTGF基因的转录物的mRNA序列中，核酸分子可以与由SEQ ID NO：1的序列构成的区域的至少一部分互补地结合，从而抑制CTGF基因表达。

当核酸分子形成siRNA、dsRNA、PNA或miRNA的单链时，显而易见的是，序列符合在本领域技术人员的水平下在siRNA、dsRNA、PNA或miRNA的设计中要考虑的条件。在该情况下，可以设计为避免回文序列，这进而防止由发夹形状或十字形状导致的RNAi效率的降低。具体地，例如，可以将本发明的siRNA或dsRNA设计为不包括SEQ ID NO：100的序列(5’-AACUUGAACU-3’)。在本发明的PNA的情况下，可以设计为分别在两个末端不具有C和G，从而避免彼此的互补关系。此外，可以设计为保持核酸分子的整个序列长度超过期望的长度，从而具有稳定的RNAi效率。

核酸分子的总序列长度可以为10至30个核苷酸、11至29个核苷酸、12至28个核苷酸、13至27个核苷酸、14至26个核苷酸、15至25个核苷酸、16至24个核苷酸、16至23个核苷酸、16至22个核苷酸、16至21个核苷酸、或16至20个核苷酸，但是不必限于此。为了保持期望的长度或更长的长度并且由此实现稳定的RNAi效率，总序列长度优选为16至20个核苷酸。

具体地，核酸分子可以为以下中的任一者：与具有SEQ ID NO：1的序列的正义RNA互补地结合以形成siRNA的反义RNA(SEQ ID NO：2的序列)；与由SEQ ID NO：3的序列构成的链互补地结合以形成dsRNA的链；与具有SEQ ID NO：1的序列的正义RNA互补地结合以形成siRNA的反义RNA(SEQ ID NO：53的序列)；与由SEQ ID NO：54的序列构成的链互补地结合以形成dsRNA的链；与具有SEQ ID NO：55的序列的正义RNA互补地结合以形成siRNA的反义RNA(SEQ ID NO：56的序列)；与由SEQ ID NO：57的序列构成的链互补地结合以形成dsRNA的链；与具有SEQ ID NO：58的序列的正义RNA互补地结合以形成siRNA的反义RNA(SEQ ID NO：59的序列)；与由SEQ ID NO：60的序列构成的链互补地结合以形成dsRNA的链；与具有SEQ IDNO：61的序列的正义RNA互补地结合以形成siRNA的反义RNA(SEQ ID NO：62的序列)；与由SEQ ID NO：63的序列构成的链互补地结合以形成dsRNA的链；与具有SEQ ID NO：64的序列的正义RNA互补地结合以形成siRNA的反义RNA(SEQ ID NO：65的序列)；与由SEQ ID NO：66的序列构成的链互补地结合以形成dsRNA的链；与具有SEQ ID NO：67的序列的正义RNA互补地结合以形成siRNA的反义RNA(SEQ ID NO：68的序列)；与由SEQ ID NO：69的序列构成的链互补地结合以形成dsRNA的链；与具有SEQ ID NO：70的序列的正义RNA互补地结合以形成siRNA的反义RNA(SEQ ID NO：71的序列)；或与由SEQ ID NO：72的序列构成的链互补地结合以形成dsRNA的链。

具体地，核酸分子可以为具有选自由SEQ ID NO：87至SEQ ID NO：99组成的组中的一个序列的PNA。

上述序列的详细信息在所附序列表和下表1中具体地说明。

本发明的核酸分子可以源自包括人类的动物，例如，猴子、猪、马、牛、绵羊、犬、猫、小鼠和兔子等，并且优选源自人类。

本发明的核酸分子通过构成核酸分子的功能性等价物(functional equivalent)例如，根据本发明的核酸分子的一些核苷酸序列的缺失、取代或插入来修饰。然而，具有与本发明的核酸分子相同的功能的变体基本上可以归属于相同的概念。

更具体地，当本发明的核酸分子形成siRNA的正义RNA或反义RNA时，正义RNA序列和反义RNA序列可以在其3’末端进一步包含UU或dTdT的序列。在该情况下，siRNA或dsRNA可以具有例如通过提高对核酸水解酶的抗性来改善siRNA或dsRNA的结构稳定性、和通过诱导稳定的RISC来改善siRNA或dsRNA的RNAi效率等优点。

更具体地，当本发明的核酸分子形成PNA时，PNA的至少一个末端可以进一步结合至具有选自由SEQ ID NO：101至SEQ ID NO：113组成的组中的至少一个序列的肽、或者mPEG

本发明的核酸分子可以使用例如化学合成或重组方法等标准分子生物学技术来分离或制备，或者可以是商购可得的。此外，本发明的组合物不仅可以包括本发明的核酸分子自身，还可以包括能够增加本发明的核酸分子在细胞中的表达率的其它物质，例如，化合物、天然产物和新型蛋白质等。

同时，本发明的核酸分子可以包含在用于细胞内表达的载体中来提供。

可以使用多种多样的转化技术例如DNA和DEAE-葡聚糖的复合物、DNA和核蛋白的复合物、DNA和脂质的复合物将本发明的核酸分子导入至细胞中。为了该目的，本发明的核酸分子可以包含在允许有效引入至细胞中的运载体(carrier)中。运载体优选为载体(vector)，并且可以使用病毒载体和非病毒载体二者。病毒载体可以包括例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和禽痘病毒载体等，并且优选慢病毒载体，但是不限于此。慢病毒是一种逆转录病毒，其特征在于，由于预整合复合物(病毒“壳(shell)”)的亲核性而可以感染未分裂细胞以及分裂细胞，使得能够主动导入至核孔(nucleopore)或完整的核膜中。

含有本发明的核酸分子的载体优选进一步包含选择性标志物。“选择性标志物(selectable marker)”旨在促进选择引入有本发明的核酸分子的细胞。对可以在载体中使用的选择性标志物没有特别限制，只要它们是能够容易地检测或确定是否引入载体的基因即可。然而，代表性的选择性标志物可以包括赋予可选择的表型例如抗药性、营养需求、对细胞毒性剂的耐受性、或表面蛋白的表达的标志物，例如，GFP(绿色荧光蛋白)、嘌呤霉素、新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene，hisD)和鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(guanine phosphosribosyltransferase，Gpt)等，并且优选使用GFP(绿色荧光蛋白)和嘌呤霉素标志物。

本发明提供用于预防或治疗纤维增生性疾病的药物组合物，其包含上述组合物。

本发明的药物组合物具有预防或治疗纤维增生性疾病的效果，其可以为根据本发明的核酸分子通过抑制CTGF基因表达而实现的效果。

作为要由本发明的药物组合物来预防或治疗的疾病的纤维增生性疾病的实例可以包括选自由以下疾病组成的组中的至少一种：肥厚性瘢痕、瘢痕瘤、纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、囊性纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、硬皮病、糖尿病视网膜病变、杜兴型肌营养不良、放射诱导的纤维化、心肌纤维化、糖尿病肾病、慢性肾衰竭、慢性病毒性肝炎、胆汁性纤维化、脂肪性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、增生性玻璃体视网膜病变、肌肉骨骼肿瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、卵巢癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、肾硬化、结节病、青光眼、黄斑变性、视网膜下纤维化、脉络膜血管生成、玻璃体视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变、角膜炎、翼状胬肉、眼科疾病、硬皮病、子宫肌瘤、全身性硬化症、肾小球肾炎、人类免疫缺陷性病毒性肾病、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、雷诺病、类风湿性关节炎、多肌炎、血管狭窄、牙周炎和牙周牙龈，但是不必限于此。具体地，对疾病没有特别限制，只要其对应于任意由CTGF或胶原蛋白等的过表达引起的疾病即可。

本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体，并且可以与此类载体一起配制。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指不刺激生物体并且不抑制所给予的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。在配制为液体溶液的组合物中的可接受的药用载体是无菌的和生物相容的，并且可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、和这些组分中的一种或多种的混合物。此外，如果需要，可以添加其它通常的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以将药物组合物配制成可注射制剂例如水溶液剂、混悬剂和乳剂等，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。

本发明的药物组合物适用于含有本发明的核酸分子作为活性成分的任意制剂形式，并且可以以口服制剂或肠胃外制剂的形式来制备。本发明的药物制剂可以包括适合于口服给药、直肠给药、经鼻给药、局部(包括脸颊和舌下)给药、皮下给药、阴道给药或肠胃外(肌内、皮下)给药的形式。可选地，还可以包括适合于通过吸入或吹入来给药的形式。

本发明的药物组合物以药学有效量来给药。可以取决于患者的疾病类型、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和释放速率、治疗持续时间、包括同时存在的药物的因素、和在医学领域众所众知的其它因素来确定有效剂量水平。本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合来给药，可以与常规治疗剂顺序或同时给药，并且可以以单剂量或多剂量给药。考虑到所有上述因素，重要的是以可以以最小量达到最大效果而没有副作用的量来给予药物组合物，这可以由本领域技术人员容易地确定。

根据本发明的药物组合物的剂量可以取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况或饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的严重程度而有很大变化，并且合适的剂量取决于例如蓄积在患者体内的药物量和/或要使用的本发明的核酸分子的特定功效而变化。通常，可以基于在体内动物模型中和体外通常确定为有效的EC50来计算所述量，例如，每kg体重0.01μg至1g。此外，本发明的药物组合物可以在例如每天、每周、每月或每年等单位时间周期期间每单位时间给药一次或数次，或者可以使用输液泵长时间连续给药。考虑到药物在体内的保留时间、体内的药物浓度等来确定重复给药的次数。根据疾病治疗的过程，即使在治疗后也可以进一步给予组合物以防止复发(recurrence)，即，疾病的复发(relapse)。

本发明的药物组合物可以进一步包含显示相同或相似的与纤维增生性疾病的治疗相关的功能的一种或多种活性成分、或者保持/增加至少一种活性成分的溶解度和/或吸收的化合物。此外，组合物还可以任选地包含化学治疗剂、抗炎剂、抗病毒剂和/或免疫调节剂等。

此外，可以使用本领域已知的任何方法来配制本发明的药物组合物，以允许在对哺乳动物给药后活性成分的快速释放、持续释放或延迟释放。可以以散剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌注射液、无菌粉末的形式来生产制剂。

本发明的组合物可以负载在具有与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的运载体上。对运载体的种类没有特别限制，只要其可以负载其上的核酸分子并且是本领域已知的即可。例如，运载体可以包括选自由脂质体、脂质转染胺、树状聚合物、胶束、多孔二氧化硅颗粒、氨基粘土和水凝胶组成的组中的至少一种，然而，优选具有例如高的核酸分子负载率、持续释放和生物降解性等优点的多孔二氧化硅颗粒。

本发明提供用于抑制CTGF基因表达的组合物，其包含携带与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的多孔二氧化硅颗粒。多孔二氧化硅颗粒是基于二氧化硅(SiO

本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒为多孔颗粒，其各自具有纳米级的孔并且可以在颗粒的表面上和/或孔的内部携带与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子(下文中，简写为“互补地结合CTGF基因转录物的核酸分子”)。

本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的颗粒，其携带与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子，并且在对身体给药时可以在体内生物降解的同时释放与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子。本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在体内缓慢地降解以允许所负载的与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的持续释放。例如，在下式1的吸光度比达到1/2时，“t”为24以上。

[式1]

A

(其中A

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部和外部，

悬浮液的pH为7.4，和

A

上式1意指多孔二氧化硅颗粒在类似于体内的环境中降解的速率。

如图34中所示，例如，可以在将多孔二氧化硅颗粒和悬浮液置于圆筒状渗透膜中并且还将相同的悬浮液置于渗透膜的外部之后测量上式1中的吸光度A

本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的，并且可以在悬浮液中缓慢地降解。50kDa的直径相当于约5nm，其允许可生物降解的多孔二氧化硅颗粒通过直径为50kDa的渗透膜，并且以60rpm水平搅拌圆筒状渗透膜以将悬浮液均匀地混合，以使降解的多孔二氧化硅颗粒可以从渗透膜中出来。

可以例如在其中用新的悬浮液替换渗透膜外部的悬浮液的环境下测量上式1中的吸光度。悬浮液可以连续替换或者每周期替换，其中所述周期是定期的或不规律的。例如，可以在1小时至1周的范围内以1小时间隔、2小时间隔、3小时间隔、6小时间隔、12小时间隔、24小时间隔、2天间隔、3天间隔、4天间隔、7天间隔等替换悬浮液，但是不限于此。

吸光度比为1/2意味着在t小时后吸光度为初始吸光度的一半，即，意味着约一半的多孔二氧化硅颗粒被降解。

悬浮液可以是缓冲溶液，例如，选自由磷酸盐缓冲盐水(PBS)和模拟体液(SBF)组成的组中的至少一种，并且更具体地为PBS。

在吸光度比达到1/2时，本发明的上式1中的“t”可以为24以上，例如，t可以为24至120。即，t可以为在上述范围内的24至96、24至72、30至70、40至70、50至65等，但是不限于此。

对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/5时，t可以为70至140。例如，t可以为在上述范围内的80至140、80至120、80至110、70至140、70至120、70至110等，但是不限于此。

对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/20时，t可以为130至220。例如，t可以为在上述范围内的130至200、140至200、140至180、150至180等，但是不限于此。

对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到0.01以下时，t可以为250以上。例如，t可以为300以上、350以上、400以上、500以上、1000以上等，并且上限可以为2000，但是不限于此。

对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，上式1中的吸光度比与t具有高的正相关性。例如，皮尔森相关系数可以为0.8以上，例如0.9以上和0.95以上。

上式1中的“t”意味着多孔二氧化硅颗粒在类似于体内的环境下降解的速度。即，可以通过调整例如表面积、粒径、孔径、在多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、和表面的致密性等来调节t。

例如，可以增加颗粒的表面积来使t减小，或者可以减小表面积来使t增大。可以通过调整颗粒的粒径和孔径来调节表面积。此外，如果通过将取代基置于颗粒的表面上和/或孔的内部来减少多孔二氧化硅颗粒对环境(例如溶剂)的直接暴露，则可以使t增大。此外，当多孔二氧化硅颗粒负载或携带与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子时、并且当使与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子和多孔二氧化硅颗粒之间的亲和性提高时，可以减少多孔二氧化硅颗粒对环境的直接暴露，从而使t增大。此外，可以通过制备具有更致密的表面的颗粒来使t增大。如上所述，已描述了调整上式1中的t的各种实例，但是不限于此。

本发明的多孔二氧化硅颗粒可以具有球形形状，但是不限于此。

本发明的多孔二氧化硅颗粒的平均直径可以为例如150至1000nm。例如，平均直径可以为在上述范围内的150至800nm、150至500nm、150至400nm、150至300nm、和150至200nm等，但是不限于此。

本发明的多孔二氧化硅颗粒的平均孔径可以为例如1至100nm。例如，孔径可以为在上述范围内的5至100nm、7至100nm、7至50nm、10至50nm、10至30nm、7至30nm等，但是不限于此。具有如上所述的大直径的多孔二氧化硅颗粒可以携带与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子，并且可以进一步携带与大尺寸的CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子。

本发明的多孔二氧化硅颗粒的BET表面积可以为例如200至700m

本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒的每克的体积可以为例如0.7至2.2ml。例如，该体积可以为在上述范围内的0.7至2.0ml、0.8至2.2ml、0.8至2.0ml、0.9至2.0ml、1.0至2.0ml等，但是不限于此。如果每克的体积过小，则降解速率可能会过高。此外，难以制造过大的颗粒或具有完整形状的颗粒。

本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在其外表面上和/或孔的内部具有亲水性取代基和/或疏水性取代基。例如，仅亲水性取代基或仅疏水性取代基可以存在于颗粒的表面和孔的内部二者中，亲水性取代基或疏水性取代基可以存在于颗粒的表面或孔的内部，或者亲水性取代基可以存在于颗粒的表面上而疏水性取代基可以存在于孔的内部，反之亦然。

负载在根据本发明的多孔二氧化硅颗粒上的、与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子(即，互补地结合CTGF基因转录物的核酸分子)的释放主要通过纳米颗粒的降解来进行。具体地，调整多孔二氧化硅颗粒和与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的释放环境的相互作用以调节纳米颗粒的降解速率，从而可以调节与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的释放速率。此外，与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子可以从纳米颗粒中扩散和释放，其中调整取代基可以调节与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子与纳米颗粒的结合力，从而控制与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的释放。

此外，为了增加二氧化硅颗粒对与难溶性(疏水性)CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质的结合力，可以使疏水性取代基存在于颗粒的孔内部。此外，在容易使用和配制的方面，还可以对颗粒的表面进行处理以具有亲水性取代基。

亲水性取代基可以包括例如羟基、羧基、氨基、羰基、巯基、磷酸基、硫醇基、铵基、酯基、酰亚胺基、硫代酰亚胺基、酮基、醚基、茚基、磺酰基、和聚乙二醇基等。此外，疏水性取代基可以包括例如取代或未取代的C1至C30烷基、取代或未取代的C3至C30环烷基、取代或未取代的C6至C30芳基、取代或未取代的C2至C30杂芳基、卤素基团、C1至C30酯基、和含卤素基团等。

此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在其外表面和/或孔的内部带正电荷、带负电荷和/或不带电荷。例如，颗粒的表面和孔的内部二者均可以带正电荷或带负电荷，仅颗粒的表面或孔的内部可以带正电荷或带负电荷。可选地，颗粒的表面可以带正电荷而孔的内部可以带负电荷，反之亦然，这与不带电荷的情况类似。

可以例如借助非离子取代基、阳离子取代基或阴离子取代基的存在来进行带电荷。

阳离子取代基可以包括例如作为碱性基团的氨基或任何其它含氮基团，具体地，选自由氨基、氨基烷基、烷基氨基、含有氮原子的杂环芳香族化合物基团、氰基和胍基组成的组中的至少一种官能团，但是不限于此。

阴离子取代基可以包括例如作为酸性基团的羧基(-COOH)、磺酸基(-SO

同样地，当通过借助带电荷调整取代基来调节多孔二氧化硅颗粒和与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的释放环境的相互作用时，可以调节纳米颗粒的降解速率以控制与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的释放速率。此外，与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子可以从纳米颗粒中扩散和释放。在这一点上，调整取代基可以调节与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子与纳米颗粒的结合力，从而控制与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的释放。

此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以包含取代基用于以下目的：在颗粒的表面上和/或孔的内部负载与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子；将与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子递送至靶细胞中；负载其它物质用于其它目的；或者结合其它取代基。此外，多孔二氧化硅颗粒还可以包括与其结合的抗体、配体、细胞穿透肽(cell permeable peptide)或适体。

可以通过例如表面修饰来添加上述在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、电荷、粘合剂等。

可以例如通过使具有要引入的取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。烷氧基硅烷具有一个或多个烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被烷氧基取代的取代基。

本发明的多孔二氧化硅颗粒可以例如通过小孔颗粒制备和孔扩张工序来制造，并且，如果需要，可以进一步通过煅烧或表面修饰工序等来制造。如果实施煅烧和表面修饰工序二者，则可以在煅烧后对颗粒进行表面修饰。

小孔颗粒可以为例如平均孔径为1至5nm的颗粒。

可以通过在溶剂中添加表面活性剂和二氧化硅前体、然后进行搅拌和均匀化来收获小孔颗粒。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

当使用水和有机溶剂的混合溶剂时，水与有机溶剂的相对比例可以为例如以体积比计1:0.7至1.5，例如，1:0.8至1.3，但是不限于此。

表面活性剂可以包括例如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基溴化铵(TMABr)、十六烷基三甲基氯化吡啶鎓(TMPrCl)、四甲基氯化铵(TMACl)等，并且具体地，可以使用CTAB。

可以例如以每1升溶剂1至10g例如1至8g、2至8g或3至8g的量添加表面活性剂，但是不限于此。

在将表面活性剂添加至溶剂的情况下，可以在搅拌后添加二氧化硅前体。二氧化硅前体可以为例如原硅酸四甲酯(TMOS)，但是不限于此。

搅拌可以进行例如10至30分钟，但是不限于此。

可以以每1升溶剂0.5至5ml，例如，在上述范围内的0.5ml至4ml、0.5至3ml、0.5至2ml、1至2ml等的量添加二氧化硅前体，但是不限于此。

如果需要，可以进一步使用氢氧化钠作为催化剂，具体地，可以在向溶剂中添加表面活性剂之后并且在向溶剂中添加二氧化硅前体之前在搅拌下添加。

可以基于1M氢氧化钠水溶液以每1升溶剂0.5至8ml，例如，在上述范围内的0.5至5ml、0.5至4ml、1至4ml、1至3ml、2至3ml等的量添加氢氧化钠，但是不限于此。

在添加二氧化硅前体之后，可以使溶液在搅拌下反应。搅拌可以进行2至15小时，例如，在上述范围内的3至15小时、4至15小时、4至13小时、5至12小时、6至12小时、6至10小时等，但是不限于此。如果搅拌时间(反应时间)过短，则成核(nucleation)可能不充分。

搅拌后，可以使溶液老化。老化可以进行8至24小时，例如，在上述范围内的8至20小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至16小时、10至14小时等，但是不限于此。

此后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获多孔二氧化硅颗粒，并且，如果需要，可以在清洗前进行未反应的材料的分离。

可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。例如，可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。

在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。

此后，可以使收获的多孔二氧化硅颗粒的孔扩张，并且此类孔扩张可以使用孔扩张剂来进行。

孔扩张剂可以包括例如三甲基苯、三乙基苯、三丙基苯、三丁基苯、三戊基苯、三己基苯、甲苯、苯等，并且具体地，可以使用三甲基苯，但是不限于此。

此外，本文中使用的孔扩张剂可以为例如N,N-二甲基十六烷基胺(DMHA)，但是不限于此。

可以例如通过使多孔二氧化硅颗粒与孔扩张剂在溶剂中混合并且加热混合物以诱导反应来进行孔扩张。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

可以以每1升溶剂10至200g，例如，在上述范围内的10至150g、10至100g、30至100g、40至100g、50至100g、50至80g、60至80g等的比例添加多孔二氧化硅颗粒，但是不限于此。

可以将多孔二氧化硅颗粒均匀地分散在溶剂中。例如，可以将多孔二氧化硅颗粒添加至溶剂中并且进行超声分散。在使用混合溶剂的情况下，可以将多孔二氧化硅颗粒分散在第一溶剂中，然后向其中添加第二溶剂。

可以以相对于100体积份溶剂为10至200体积份，例如，在上述范围内的10至150体积份、10至100体积份、10至80体积份、30至80体积份、30至70体积份等的比例添加孔扩张剂，但是不限于此。

可以在120至190℃，例如，在上述范围内的120至190℃、120至180℃、120至170℃、130至170℃、130至160℃、130至150℃、130至140℃等进行反应，但是不限于此。

反应可以进行6至96小时，例如，在上述范围内的30至96小时、30至96小时、30至80小时、30至72小时、24至80小时、24至72小时、36至96小时、36至80小时、36至72小时、36至66小时、36至60小时、48至96小时、48至88小时、48至80小时、48至72小时、6至96小时、7至96小时、8至80小时、9至72小时、9至80小时、6至72小时、9至96小时、10至80小时、10至72小时、12至66小时、13至60小时、14至96小时、15至88小时、16至80小时、17至72小时等，但是不限于此。

可以在以上示例的范围内根据期望调整时间和温度，从而可以使反应充分地进行但不会过度进行。例如，当使反应温度降低时，可以增加反应时间，并且当使反应温度提高时，可以缩短反应时间。如果反应没有充分地进行，则孔扩张可能不充分。另一方面，如果反应过度进行，则颗粒可能会由于孔的过度扩张而塌陷。

反应可以例如通过逐渐升高温度来进行。具体地，可以通过将温度以0.5至15℃/min的速率从室温逐渐升高至以上限定的温度来进行反应。例如，可以使温度以1至15℃/min、3至15℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率升高，但是不限于此。

反应可以在搅拌下进行。例如，可以以100rpm以上的速度，具体地，以100至1000rpm的速度进行搅拌，但是不限于此。

反应后，可以例如通过逐渐降低温度来使反应溶液缓慢地冷却。具体地，可以通过将温度以0.5至20℃/min的速率从以上限定的温度逐渐降低至室温来进行反应。例如，可以使温度以在上述范围内的1至20℃/min、3至20℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率降低，但是不限于此。

冷却后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获具有扩张的孔的多孔二氧化硅颗粒。如果需要，可以在清洗前首先分离未反应的材料。

可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。本文中，可以例如以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3分钟至60分钟。例如，离心可以进行在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次、4次、5次、6次、7次、8次等。

有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。

在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。

此后，可以对收获的颗粒进行煅烧，其为加热颗粒以除去存在于颗粒的表面上和孔的内部的硅烷醇基从而降低颗粒的反应性、提供更致密的结构并且除去填充孔的有机物质的工序。例如，可以将颗粒加热至400℃以上的温度。对温度的上限没有特别限制，但是可以为1000℃、900℃、800℃、700℃等。加热可以进行例如3小时以上。对加热时间的上限没有特别限制，并且可以为24小时、12小时、10小时、8小时、6小时等。更具体地，加热可以在400至700℃下进行3至8小时或者在500至600℃下进行4至5小时，但是不限于此。

除去填充孔的有机物质可以防止由残留的有机物质导致的细胞毒性或起泡的一些问题。

然后，可以对收获的多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰，并且可以在颗粒的表面上和/或孔的内部进行表面修饰。颗粒表面和孔的内部二者可以以相同的方式进行表面修饰，或者可以以不同的方式进行表面修饰。

通过表面修饰可以使颗粒带电荷或者具有亲水性和/或疏水性。

更具体地，为了有效地负载与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子，多孔二氧化硅颗粒的表面修饰可以通过具有选自由氨基、氨基烷基、烷基氨基、含有氮原子的杂环芳香族化合物基团、氰基和胍基组成的组中的至少一种取代基来进行。

可以例如通过使具有要引入的亲水性取代基、疏水性取代基、阳离子取代基或阴离子取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。

烷氧基硅烷具有一个或多个烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被烷氧基取代的取代基。

当烷氧基硅烷与多孔二氧化硅颗粒反应时，在硅原子和氧原子之间形成共价键以使烷氧基硅烷可以键合至多孔二氧化硅颗粒的表面和/或孔的内部。由于烷氧基硅烷具有要引入的取代基，因此可以将相应的取代基引入至多孔二氧化硅颗粒的表面和/或孔的内部。

反应可以通过使分散在溶剂中的多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷反应来进行。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

带正电荷可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有例如含氮基团(例如，氨基或氨基烷基)等碱性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]苯胺、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷等，但是不限于此。

带负电荷可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有例如羧基、磺酸基、硫醇基等酸性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，但是不限于此。

带电至无电荷(处于不带电的状态而不是带正电荷或负电荷)可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有不带电荷的普通官能团的烷氧基硅烷反应来进行。可以通过适当地将带正电荷和带负电荷进行组合以抵消正电荷和负电荷而在无电荷的情况下带电，但是不限于此。

可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有亲水性基团例如羟基、羧基、氨基、羰基、巯基、磷酸基、硫醇基、铵基、酯基、酰亚胺基、硫代酰亚胺基、酮基、醚基、茚基、磺酰基、和聚乙二醇基等的烷氧基硅烷反应来获得亲水性。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷，但是不限于此。

可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有疏水性取代基例如取代或未取代的C1至C30烷基、取代或未取代的C3至C30环烷基、取代或未取代的C6至C30芳基、取代或未取代的C2至C30杂芳基、卤素基团、C1至C30酯基、和含卤素基团等的烷氧基硅烷反应来获得疏水性。具体地，可以使用三甲氧基(十八烷基)硅烷、三甲氧基正辛基硅烷、三甲氧基(丙基)硅烷、异丁基(三甲氧基)硅烷、三甲氧基(7-辛烯-1-基)硅烷、三甲氧基(3,3,3-三氟丙基)硅烷、三甲氧基(2-苯基乙基)硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、氰基甲基、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]三硫代碳酸酯、(3-溴丙基)三甲氧基硅烷等，但是不限于此。

此外，为了通过表面修饰来改善二氧化硅颗粒对与难溶性(疏水性)CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质的结合能力，可以使疏水性取代基存在于颗粒的孔内部。此外，在容易使用和配制的方面，还可以对颗粒的表面进行处理以具有亲水性取代基。此外，在颗粒的表面上可以存在取代基，从而结合与另一CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质。

此外，表面修饰可以组合进行。例如，可以在颗粒的外表面上或孔的内部进行表面修饰两次以上。作为具体实例，可以使含有羧基的化合物通过酰胺键结合至其中引入有氨基的二氧化硅颗粒，从而改变带正电荷的颗粒以具有不同的表面性质，但是不限于此。

多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷的反应可以例如在加热下进行。加热可以在80至180℃，例如，在上述范围内的80至160℃、80至150℃、100至160℃、100至150℃、110至150℃等进行，但是不限于此。

多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷的反应可以进行4至20小时，例如，在上述范围内的4至18小时、4至16小时、6至18小时、6至16小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至14小时等，但是不限于此。

可以根据表面修饰的程度根据期望来选择反应温度、时间和用于表面修饰的化合物的量，并且反应条件将取决于本发明的核酸分子或物质的亲水性、疏水性和电荷水平而变化。通过控制多孔二氧化硅颗粒的亲水性、疏水性和电荷水平，可以控制与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质的释放速率。例如，如果与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质在中性pH下具有强的负电荷，则可以提高反应温度、可以延长反应时间或者可以增加所处理的化合物的量，从而使多孔二氧化硅颗粒具有强的正电荷，但是不限于此。

此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以通过例如小孔颗粒的制备、孔扩张、表面修饰和孔内部修饰来制造。

小孔颗粒的制备和孔扩张可以通过上述工序来进行，并且，在小孔颗粒的制备之后和孔扩张之后，可以进行清洗工序和干燥工序。

如果需要，可以在清洗之前将未反应的材料分离，并且可以通过借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。

可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

小孔颗粒的制备之后的清洗可以通过在上述范围内的方法/条件来进行，但是不限于此。

孔扩张之后的清洗可以在比上述实施方案更宽松的条件下进行。例如，清洗可以进行三次以下，但是不限于此。

表面修饰和孔内部修饰可以分别通过上述工序来进行。本文中，表面修饰和随后的孔内部修饰可以按该顺序进行，并且可以在上述两个工序之间进一步进行清洗工序。

当在小孔颗粒的制备和孔扩张之后在更宽松的条件下进行清洗时，例如用于颗粒制备和孔扩张的表面活性剂等反应溶液填充在孔中，以使在表面修饰期间不会使孔的内部被修饰，而是仅可以修饰颗粒的表面。此后，可以将在孔的内部的反应溶液洗去并除去。

在表面修饰工序与孔内部修饰工序之间的颗粒清洗可以使用水和/或有机溶剂来进行。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。

可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。

在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。

可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。

与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子可以负载在多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔的内部。本文中，可以例如通过将多孔二氧化硅颗粒和与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子在溶剂中混合来进行负载。

溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。

此外，可以使用PBS(磷酸盐缓冲盐水溶液(phosphate buffered salinesolution))、SBF(模拟体液(simulated body fluid))、硼酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水作为溶剂。

本发明中多孔二氧化硅颗粒与核酸分子的相对比例没有特别限制，但是以重量比计可以为1:0.05至0.8，例如，在上述范围内的1:0.05至0.7、1:0.05至0.6、1:0.1至0.8、1:0.1至0.6、1:0.2至0.8、1:0.2至0.6等。

负载在多孔二氧化硅颗粒上的与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子可以在延长的时间内逐渐释放。此类持续释放可以是连续或不连续的、或者线性或非线性的。此外，该释放可以取决于多孔二氧化硅颗粒的特性和/或多孔二氧化硅颗粒和与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子之间的相互作用而变化。

负载在多孔二氧化硅颗粒上的与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子随着多孔二氧化硅颗粒被生物降解而释放。具体地，使根据本发明的多孔二氧化硅颗粒缓慢地降解从而使得以持续方式释放与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子。此类释放可以通过例如调整多孔二氧化硅颗粒的表面积、粒径、孔径、在颗粒的表面上和/或孔的内部的取代基、表面致密性等来控制，但是不限于此。

负载在多孔二氧化硅颗粒上的与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子可以在从多孔二氧化硅颗粒分离并且扩散的同时释放。此类释放受到多孔二氧化硅颗粒、与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子及其释放环境之间的关系的影响。因此，调节该关系可以控制与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的释放。例如，通过借助表面修饰来增强或减弱多孔二氧化硅颗粒对与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的结合力，可以控制与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的释放。

更具体地，在所负载的与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质难溶(疏水)的情况下，颗粒的表面和/或孔的内部具有疏水性取代基，从而增加多孔二氧化硅颗粒对与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质的结合力，由此可以以持续的方式释放与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质。例如，可以用具有疏水性取代基的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

如本文中所使用的，术语“难溶性”意指不溶、几乎不溶或仅微溶(在水中)，其为“Pharmaceutical Science”第18版(由U.S.P.、Remington和Mack Publishing Company发行)中定义的词语。

难溶性物质在1个大气压和25℃下可以具有例如小于10g/L、具体地小于5g/L、并且更具体地小于1g/L的水溶解度，但是不限于此。

当所负载的与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质是水溶性的(亲水性的)时，颗粒的表面和/或孔的内部具有亲水性取代基，从而增加多孔二氧化硅颗粒对与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质的结合力，由此可以以持续的方式释放与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质。例如，可以用具有亲水性取代基的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

例如，水溶性物质在1个大气压和25℃下可以具有10g/L以上的水溶解度，但是不限于此。

在所负载的与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质带电荷的情况下，颗粒的表面和/或孔的内部带有相反的电荷，从而增加多孔二氧化硅颗粒对与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质的结合力，由此可以以持续的方式释放与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子。例如，可以用具有酸性基团或碱性基团的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

具体地，如果与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质在中性pH下带正电荷，则颗粒的表面和/或孔的内部可以在中性pH下带负电荷，从而增加多孔二氧化硅颗粒对与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质的结合力，由此可以以持续的方式释放与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质。例如，可以用具有例如羧基(-COOH)、磺酸基(-SO

此外，如果与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质在中性pH下带负电荷，则颗粒的表面和/或孔的内部可以在中性pH下带正电荷，从而增加多孔二氧化硅颗粒对与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质的结合力，由此可以以持续的方式释放与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质。例如，可以用具有例如氨基或任何其它含氮基团等碱性基团的烷氧基硅烷对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰。

与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质可以释放例如7天至1年以上的时间，这取决于所需处理的类型、释放环境和要使用的多孔二氧化硅颗粒的类型。

此外，由于本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的并且可以100％降解，因此与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质可以100％释放。

如上所述，与CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子或物质可以以10个以上的核苷酸(nt)、至少11个以上的核苷酸、12个以上的核苷酸、13个以上的核苷酸、14个以上的核苷酸、15个以上的核苷酸、16个以上的核苷酸、17个以上的核苷酸、或全部18个核苷酸的程度与SEQ ID NO：1的序列具有互补性。其详细描述如上所述。

本发明提供用于预防或治疗纤维增生性疾病的药物组合物，其包括：包含携带与上述CTGF基因的转录物的至少一部分互补地结合的核酸分子的多孔二氧化硅颗粒的抑制CTGF基因表达的组合物。

核酸分子、多孔二氧化硅颗粒、CTGF基因表达的抑制、纤维增生性疾病和药物组合物的各种制剂等的详细描述如上所述。

下文中，将参考以下实施例详细地描述本发明。

下文中，本发明中使用的siRNA可以缩写为‘siCTGF’。同样地，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以缩写为‘DegradaBALL或DDV’，并且携带siCTGF的DegradaBALL可以缩写为‘LEM-S401’。

1.实验材料

DegradaBALL和结合有TAMRA的DegradaBALL由Lemonex,Inc.(Seoul，Korea)提供，并且细胞计数试剂盒-8购自Dojindo molecular technologies,Inc.(Maryland，USA)。TGF-β购自Peprotech(New Jersey，USA)，并且10％磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Dulbecco的改良型Eagle的培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、Roswell Park Memorial Laboratory 1640(RPMI 1640)、青霉素-链霉素和0.05％胰蛋白酶-EDTA购自WelGene(Korea)。所有核酸分子均由Lemonex(Seoul，Korea)合成，并且在本说明书全文中使用的它们的序列和核酸分子序列在下表1中示出。所有PCR引物均购自Cosmogenetech(Seoul，Korea)。抗小鼠CTGF抗体购自Abcam(Cambridge，UK)并且抗小鼠胶原蛋白1和3的抗体购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。Trizol细胞裂解液购自Molecular Probes Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)并且所有PCR试剂购自TaKaRa Bio Inc.(Shiga，Japan)。所有化学品均按原样使用。

[表1]

2.动物模型

所有动物实验均按照首尔国立大学的机构动物保护和使用委员会(IACUC)来进行，并且C57BL/6雄性小鼠(5周)购自ORIENT BIO(Seongnam，Korea)。

3.细胞活力的测量

将A549细胞和HaCaT细胞以每孔10,000个细胞的密度接种在具有100μl生长培养基的96孔培养板中(50％-70％融汇(confluency))。在含血清培养基中用适当浓度的DegradaBALL处理细胞并且在37℃下温育24小时。温育后，将细胞用1×PBS清洗两次，然后添加100μl的含有10μl CCK-8的无血清培养基，随后进一步温育1小时。在450nm波长下测量培养板中各孔的光学密度。计算一式三份的偏差的平均值和标准偏差并且作图。

4.基于细胞的CTGF敲低分析

为了证明LEM-S401在体外的CTGF基因沉默效率，使用500μl的在无血清培养基中的LEM-S401(12.5、25、50和100nM)来处理板中的A549细胞和HaCaT细胞(以每孔25,000个细胞的融汇度接种)。在37℃下、在湿润的5％CO

为了确定通过LEM-S401敲低CTGF的持续时间，在无血清培养基中用500μl含有LNP的LEM-S401(50nM siCTGF)和siCTGF(50nM)处理A549细胞和HaCaT细胞。在37℃下、在湿润的5％CO

5.RT-PCR

使用以下反应条件将在体外和体内提取的所有RNA用于热循环反应。cDNA合成：在65℃下5分钟、在42℃下2分钟、在42℃下50分钟和在70℃下15分钟灭活，1个循环，扩增过程：在95℃下30秒、在55℃下60秒和在72℃30秒，30个循环。

6.siCTGF和多孔二氧化硅颗粒的体内成像

将30μl LEM-S401(33mM)(缀合有FITC的siCTGF和缀合有TAMRA的DegradaBALL)在7个不同的部位注射至小鼠皮肤中。处死后，使用FOBI体内成像装置(NeoScience Co.,Ltd.，Seoul，Korea)来拍摄切除的小鼠皮肤的荧光图像。将获得的皮肤样品置于4％PFA溶液中。将样品插入至石蜡中并且切成厚度为10μm。脱水后，将切片用DAPI染色。用装配有20×物镜的BX71显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)来观察样品。

7.使用小鼠皮肤伤口模型的体内实验

使用活检穿孔器(biopsy punch)(4mm)将小鼠皮肤刺破以形成伤口。随着时间的推移，使用黑色丝线在伤口周围缝合硅树脂夹板(silicone splint)(外部15mm、内部8mm)，从而清楚地观察伤口。在伤口周围4个不同的部位每4天(第4天、第8天和第12天)皮下注射30μl的在1×PBS中的LEM-S401(3mM)。每隔一天更换Tegaderm和绷带来管理伤口，并且在16天之后将小鼠处死。

为了证明LEM-S401在组织重建期间可以抑制CTGF表达，在小鼠皮肤上刺一个孔，使用活检穿孔器(4mm)将孔弄伤并且用绷带包扎。在伤口完全闭合之后，每4天(第10天、第14天、第18天和第22天)将30μl的在1×PBS中的LEM-S401(33mM)在4个不同的部位皮下注射至伤口部位，并且在第26天将小鼠处死。

8.免疫组织化学

在4℃下将小鼠皮肤样品在4％PFA溶液中温育24小时。然后将样品插入至石蜡中并且将切片制作为厚度为10μm。将切片的样品脱水并且在渗透溶液(在1×PBS中的0.2％吐温20)中温育两次，每次10分钟。然后，将样品在湿润的气氛中、在封闭溶液(5％正常山羊血清、在1×PBS中的0.2％吐温20)中温育45分钟。将样品与2％正常山羊血清和在PBS中的抗体以1:100稀释的含有0.2％吐温20的一抗溶液一起在加湿室中在室温下温育3小时。将样品在渗透溶液中漂洗三次，每次10分钟，并且与含有在1×PBS中的2％正常山羊血清和0.2％吐温20的二抗稀释溶液一起在室温下温育2小时。将样品用渗透溶液清洗并且用DAPI染色。在装配有20×物镜的BX71显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)下观察样品。

9.多孔二氧化硅颗粒(DDV或DegradaBALL)

9-1.多孔二氧化硅颗粒的制备

(1)多孔二氧化硅颗粒的制备

1)小孔颗粒的制备

将960mL蒸馏水(DW)和810mL MeOH置于2L圆底烧瓶中。将7.88g CTAB添加至烧瓶中，然后在搅拌下快速添加4.52mL 1M NaOH。在搅拌10分钟的同时添加均匀的混合物之后，进一步添加2.6mL TMOS。在搅拌6小时以均匀地混合之后，将反应溶液老化24小时。

然后，将反应溶液在8000rpm和25℃下离心10分钟以除去上清液，在8000rpm和25℃下离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将所得产物在70℃的烘箱中干燥以收获1.5g粉末状小孔多孔二氧化硅颗粒(孔平均直径为2nm并且粒径为200nm)。

2)孔扩张

将1.5g小孔多孔二氧化硅颗粒粉末添加至10ml乙醇中并且进行超声分散，并且进一步添加10ml水和10ml TMB(三甲基苯)，然后进行超声分散。

此后，将分散液置于高压釜中，并且在160℃下反应48小时。

在高压釜中，反应在25℃下开始并且在使温度以10℃/min的速率升高的同时进行，然后以1至10℃/min的速率缓慢地冷却。

将冷却的反应溶液在25℃下以8000rpm离心10分钟以除去上清液，在25℃下以8000rpm离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

然后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获粉末状多孔二氧化硅颗粒(孔径为10至15nm，并且粒径为200nm)。

3)煅烧

将在2)中制备的多孔二氧化硅颗粒放入玻璃小瓶中，在550℃下加热5小时，并且在反应完成之后缓慢地冷却至室温以制备颗粒。

(2)多孔二氧化硅颗粒的制备

除了将孔扩张时的反应条件改变为140℃和72小时以外，通过与9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(3)多孔二氧化硅颗粒的制备(10L规模)

除了使用大5倍的容器并且每种物质以5倍容量使用以外，通过与实施例9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(4)多孔二氧化硅颗粒(粒径为300nm)的制备

除了使用920ml蒸馏水和850ml甲醇来制备小孔颗粒以外，通过与9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(5)多孔二氧化硅颗粒(粒径为500nm)的制备

除了使用800ml蒸馏水、1010ml甲醇和10.6g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(6)多孔二氧化硅颗粒(粒径为1000nm)的制备

除了使用620ml蒸馏水、1380ml甲醇和7.88g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(7)多孔二氧化硅颗粒(孔径为4nm)的制备

除了使用2.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(8)多孔二氧化硅颗粒(孔径为7nm)的制备

除了使用4.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(9)多孔二氧化硅颗粒(孔径为17nm)的制备

除了使用11ml TMB用于孔扩张以外，通过与9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(10)多孔二氧化硅颗粒(孔径为23nm)的制备

除了使用12.5ml TMB用于孔扩张以外，通过与9-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。

(11)多孔二氧化硅颗粒的制备(双重修饰)

1)小孔颗粒的制备

通过与实施例9-1-(1)-1)相同的方法来制备小孔颗粒。

2)孔扩张

通过与实施例9-1-(1)-2)相同的方法，使小孔颗粒与TMB反应、冷却并且离心以除去上清液。此后，将剩余的溶液在与实施例9-1-(1)-2)相同的条件下离心，用乙醇和蒸馏水交替清洗三次，然后在与实施例9-1-(1)-2)相同的条件下干燥，由此收获粉末状多孔二氧化硅颗粒(孔径为10至15nm，并且粒径为200nm)。

3)表面修饰

在将0.8g至1g具有扩张的孔的多孔二氧化硅颗粒分散在50ml甲苯中之后，将5ml(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷添加至其中，然后在120℃下回流加热12小时。该过程之后是上述清洗和干燥过程，然后将1ml三甘醇(PEG3，2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸)、100mgEDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和200mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分散在30ml PBS中并且使其在搅拌下在室温下反应12小时。然后将产物进行清洗和干燥。

由于前一步骤的反应溶液保留在孔的内部，因此孔的内部未被修饰。

4)清洗孔内部

将800mg表面修饰的颗粒粉末溶解于40ml 2M HCl/乙醇中并且在剧烈搅拌下回流12小时。

此后，将冷却的反应溶液以8000rpm离心10分钟以除去上清液，在8000rpm和25℃下离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将产物在70℃的烘箱中干燥，由此收获粉末状多孔二氧化硅颗粒。

5)修饰孔内部

①通过与下述实施例9-2-(2)-1)相同的方法将丙基引入至孔中。

②通过与下述实施例9-2-(2)-2)相同的方法将辛基引入至孔中。

9-2.多孔二氧化硅颗粒的表面修饰

(1)带正电荷

1)粒径为300nm的颗粒

使实施例9-1-(4)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应，以使其带正电荷。

具体地，用浴超声仪(bath sonicator)将100mg多孔二氧化硅颗粒分散在100ml圆底烧瓶中的10ml甲苯中。然后，添加1ml APTES并且在400rpm和130℃下搅拌12小时。

反应后，将产物缓慢地冷却至室温并且以8000rpm离心10分钟以除去上清液，进一步在8000rpm和25℃下离心10分钟，然后用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。

此后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获在颗粒的表面上和孔的内部具有氨基的粉末状多孔二氧化硅颗粒。

2)粒径为200nm的颗粒

①通过使实施例9-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电荷，并且除了添加0.4ml APTES和反应时间为3小时以外，通过与9-2-(1)-1)相同的方法来修饰。

②通过使实施例9-1-(9)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电荷，并且通过与9-2-(1)-1)相同的方法来修饰。

③通过使实施例9-1-(10)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应来使颗粒带正电荷，并且通过与9-2-(1)-1)相同的方法来修饰。

(2)疏水基团的引入

1)丙基

使实施例9-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与三甲氧基(丙基)硅烷反应以将丙基引入至颗粒的表面和孔的内部，并且除了添加0.35ml三甲氧基(丙基)硅烷来代替APTES、然后进行反应12小时以外，通过与实施例9-2-(1)相同的方法进行修饰。

2)辛基

使实施例9-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与三甲氧基正辛基硅烷反应以将辛基引入至颗粒的表面和孔的内部，并且除了添加0.5ml三甲氧基正辛基硅烷来代替APTES、然后进行反应12小时以外，通过与实施例9-2-(1)相同的方法进行修饰。

(3)带负电荷

1)羧基

通过使实施例9-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与琥珀酸酐(succinic anhydride)反应来使颗粒带负电荷。

此外，除了使用DMSO(二甲亚砜)来代替甲苯、添加80mg琥珀酸酐来代替APTES以使反应在搅拌下在室温下进行24小时、和在清洗时使用DMSO来代替蒸馏水以外，通过与实施例9-2-(1)-1)相同的方法对带电荷的颗粒进行修饰。

2)硫醇基

除了使用1.1ml MPTES来代替APTES以外，通过与实施例9-2-(1)-1)相同的方法对颗粒进行修饰。

3)磺酸基

将100mg实施例9-2-(3)-2)的多孔二氧化硅纳米颗粒分散在1ml 1M硫酸水溶液和20ml 30％过氧化氢溶液中，并且在室温下搅拌以引发氧化反应，从而将硫醇基氧化为磺酸基。此后，通过与实施例9-2-(1)-1)相同的方法将产物进行清洗和干燥。

9-3.核酸分子的负载

将10μg实施例9-2-(1)-2)-②的多孔二氧化硅颗粒和50pmol核酸分子在1×PBS条件下混合，然后在室温下放置30分钟以完成负载。

1.本发明的核酸分子抑制CTGF表达的分析

根据以上实施例，所制备的核酸分子(PNA、siRNA或dsRNA；参见表1)的CTGF表达抑制率在下表2和3中示出。

参照下表1和2，包含与SEQ ID NO：1的序列互补至少10个核苷酸的链的核酸分子(即：由具有SEQ ID NO：1的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：2的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：3的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ IDNO：52的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：53的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ IDNO：54的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：55的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：56的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：57的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：58的序列的正义RNA和具有SEQ IDNO：59的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：60的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：61的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：62的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：63的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：64的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：65的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：66的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQID NO：67的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：68的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQID NO：69的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；由具有SEQ ID NO：70的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：71的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：72的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA；和由选自由SEQ ID NO：87至SEQ ID NO：99的序列组成的组中的一个序列构成的反义PNA)显示超过90％的抑制率。另一方面，可以看出，不满足上述构成的其它核酸分子显示小于75％的低抑制率。

特别地，仅7个核苷酸互补的链的核酸分子(即：由具有SEQ ID NO：4的序列的正义RNA和具有SEQ ID NO：5的序列的反义RNA构成的siRNA；由具有SEQ ID NO：6的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA)显示非常低的表达抑制能力(例如约60％的抑制率)，表明当与SEQ ID NO：1的序列互补10个以上的核苷酸时取得技术意义。

其中，在以下实验中选择和使用具有以全部18个核苷酸与SEQ ID NO：1的序列互补的链以及最高的表达抑制能力的由具有SEQ ID NO：1的序列的正义RNA和具有SEQ IDNO：2的序列的反义RNA构成的siRNA、或者由具有SEQ ID NO：3的序列的链和与其互补的另一条链构成的dsRNA。

[表2]

[表3]

2.多孔二氧化硅颗粒(DDV或DegradaBALL)

2-1.颗粒形成和孔扩张的鉴定

在显微镜下观察在实验例9-1-(1)至(3)中制备的小孔颗粒和多孔二氧化硅颗粒，以确定小孔颗粒是否均匀形成或者孔是否充分扩张以均匀形成多孔二氧化硅颗粒(图28至31)。

图28为实验例9-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，图29为实验例9-1-(2)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，并且从这些图可以看到，均匀地形成了具有充分扩张的孔的球形多孔二氧化硅颗粒。

图30为实验例9-1-(1)中的小孔颗粒的照片，图31为实验例9-1-(1)和9-1-(3)中的小孔颗粒的比较照片，并且从这些图可以看到，均匀地形成了球形小孔颗粒。

2-2.BET表面积和孔体积的计算

计算实验例9-1-(1)中的小孔颗粒和实验例9-1-(1)、(7)、(8)和(10)的多孔二氧化硅颗粒的表面积和孔体积。通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)法来计算表面积，并且通过Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法来计算孔径分布。

各颗粒的显微照片在图32中示出，并且计算结果在下表4中示出。

[表4]

2-3.生物降解性的鉴定

为了鉴定实验例9-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性，在0小时、120小时和360小时在显微镜下观察在37℃下在SBF(pH 7.4)中的生物降解性，并且其结果在图33中示出。

参照图33，可以看出多孔二氧化硅颗粒被生物降解并且在360小时之后几乎完全降解。

2-4.吸光度比的测量

根据下式1来测量随时间推移的吸光度比。

[式1]

A

(其中A

使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在60rpm和37℃下水平地搅拌渗透膜的内部和外部，并且

A

具体地，将5mg多孔二氧化硅颗粒粉末溶解于5ml SBF(pH 7.4)中。此后，将5ml多孔二氧化硅颗粒溶液置于图34中示出的具有孔径为50kDa的孔的渗透膜中。将15ml SBF添加至外膜(outer membrane)，并且每12小时更换外膜的SBF。多孔二氧化硅颗粒的降解在37℃下、在水平搅拌下以60rpm来进行。

然后，吸光度通过UV-可见光谱法来测量并且在λ＝640nm处分析。

(1)吸光度比的测量

根据上述方法来测量实验例9-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度比，并且其结果在图35中示出。

参照图35，可以看出，在吸光度比达到1/2时，t为约58小时，以证明非常缓慢的降解。

(2)粒径

根据上式1来测量实验例9-1-(1)、(5)和(6)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图36中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。

参照图36，可以看出t随着粒径的增加而降低。

(3)平均孔径

根据上式1来测量实验例9-1-(1)和(9)中的多孔二氧化硅颗粒以及作为对照的实验例9-1-(1)中的小孔多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图37中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。

参照图37，可以看出，本发明实施例的多孔二氧化硅颗粒具有比对照显著更大的t。

(4)pH

测量实验例9-1-(4)中的多孔二氧化硅颗粒针对每种pH的吸光度。在pH 2、5和7.4下在SBF和Tris中测量吸光度，并且其结果在图38中示出。

参照图38，可以看出，虽然针对pH，t存在差异，但是在所有吸光度比达到1/2时，t为24以上。

(5)带电荷

测量实验例9-2-(1)-1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图39中示出(Tris(pH 7.4)用作悬浮液和溶剂)。

参照图39，可以看出，在带正电荷的颗粒的吸光度比达到1/2时，t为24以上。

2-5.负载的核酸分子的释放

将10μl负载有Cy5-siRNA的多孔二氧化硅颗粒重悬于SBF(pH 7.4，37℃)中并且置于孔径为20kDa的渗透膜(图40中的管)中。

此后，将渗透管浸入1.5ml SBF中。

siRNA的释放在37℃下、在60rpm水平搅拌下进行。

在24小时之前，经过0.5、1、2、4、8、12和24小时，回收释放溶剂，此后，每24小时回收0.5ml释放溶剂用于荧光测量，然后添加等量的SBF。

在670nm波长(λ

参照图41，可以看出释放50％siRNA的时间为约48小时。

3.LEM-S401有效诱导CTGF mRNA敲低的体外鉴定

为了确定LEM-S401的靶基因敲低效率，用携带siCTGF的DegradaBALL(LEM-S401)来处理A549细胞(人肺癌非小细胞)和HaCaT细胞(人角质形成细胞)。由于两种细胞系均具有功能活性的CTGF转录途径，因此A549细胞和HaCaT细胞在纤维化研究中广泛地用作体外模型细胞。首先，将A549细胞用各种浓度(12.5、25、50和100nM)的LEM-S401进行处理，然后用2ng/ml TGF-β温育，从而诱导CTGF表达(图1)。先前的研究已显示TGF-β在体外诱导CTGF表达，并且证实了通过用TGF-β处理A549细胞和HaCaT细胞使CTGF表达显著增加(图17)。LEM-S401对细胞系的处理以浓度依赖性方式降低CTGF的mRNA表达水平。另一方面，对照(仅siCTGF、杂乱siRNA(scrambled siRNA)和仅载体(DegradaBALL))在A549细胞和HaCaT细胞二者中均未显示CTGF的mRNA水平的显著差异(图2和3)。这些结果表明，LEM-S401有效地将siCTGF转染至细胞中并且诱导CTGF基因的敲低。

4.LEM-S401的体外持续siCTGF释放

在本实验中，与LNP相比，LEM-S401在A549细胞和HaCaT细胞中维持更长的CTGF敲低效果。将A549细胞和HaCaT细胞分别用LEM-S401(50nM)和负载在LNP(50nM)上的siCTGF来处理，然后通过TGF-β处理来诱导CTGF表达。在LEM-S401处理之后，CTGF在A549细胞中的下调持续至96小时(CTGF表达水平，72小时：26.3％，96小时：26.9％)。然而，负载在LNP上的siCTGF的敲低效率在72小时和96小时均不高(CTGF表达水平，72小时：46.4％，96小时：58.6％)。此外，确定了LEM-S401在HaCaT细胞中的敲低效率(CTGF表达水平，72小时：34.3％，96小时：35.8％)比负载在LNP上的siCTGF(CTGF表达水平，72小时：62.5％，96小时：78.8％)更恒定和优越(图4、5)。综上所述，可以看出，与负载在LNP上的siCTGF相比，LEM-S401在更长的时间段抑制细胞中的靶mRNA表达水平。

5.LEM-S401在小鼠皮肤伤口模型中的CTGF表达和肥厚性瘢痕形成抑制能力的鉴定

接下来，进行实验以确定LEM-S401是否可以在体内下调CTGF表达。在体内测量基因敲低效果之前，向C57BL/6小鼠注射由负载在缀合有TAMRA的DegradaBALL上的缀合有FITC的siCTGF构成的荧光标记的LEM-S401。另一方面，仅将未负载的(游离的)缀合有FITC的siCTGF通过皮下注射途径注射至小鼠体内。然后，试图比较LEM-S401和游离siCTGF二者在注射部位的持续时间。因此，在注射后第1天、第3天和第5天分析切除的小鼠皮肤和切片皮肤的荧光图像。携带FITC-siCTGF的TAMRA-DegradaBALL在第1天在注射部位显示强的荧光发射。此外，荧光随着时间的推移逐渐降低，但是在注射部位保持至注射后第5天(图6)。注射部位的荧光随时间降低的趋势追随皮肤切片滑动趋势(图6)。另一方面，在来自仅注射有未负载的游离FITC-siCTGF的小鼠的切除的皮肤或碎片化的皮肤切片中未观察到荧光信号，表明游离siCTGF在体内迅速分散或者降解成小片段，这进而诱导非常迅速的扩散(图7)。以上数据表明，与游离siCTGF相比，LEM-S401可以在皮肤中维持显著更高浓度的siCTGF，具体地，直至注射后至少第3天。

接下来，在小鼠皮肤伤口模型中证明了LEM-S401可以诱导CTGF基因敲低并且减少胶原蛋白过度产生。在借助活检穿孔器在小鼠的背部皮肤形成伤口孔(第0天)之后，在伤口周围缝合硅树脂夹板用于管理和观察。在第0天、第4天、第8天和第12天在伤口周围皮下注射LEM-S401。在第16天将小鼠处死，并且通过RT-PCR来分析皮肤中的CTGF表达水平。CTGF表达水平在LEM-S401处理组中显著降低，而在单独用siCTGF或DegradaBALL处理的组中未观察到变化。此外，1型和3型胶原蛋白表达水平在LEM-S401处理组中也显著下调(图8至10)。已知由CTGF诱导的1型和3型胶原蛋白是肥厚性瘢痕和瘢痕瘤的主要组分。因此，可以确定，表达被LEM-S401抑制的CTGF影响1型和3型胶原蛋白的表达水平。

由伤口结缔组织的过度生长造成的不均匀、凹凸不平和不规则的皮肤表面是肥厚性瘢痕和瘢痕瘤的主要特征。第10天的受伤皮肤照片在对照组中显示不规则的特征，但是LEM-S401处理组的皮肤照片表现为规则且平滑的(图11)。这些结果证明LEM-S401抑制不受控制且不均匀的皮肤形成并且防止肥厚性瘢痕形成。免疫组织化学分析结果还显示，CTGF以及1型和3型胶原蛋白的表达在LEM-S401处理组中显著低于对照组(图12至15)。在使皮肤伤口愈合的过程中，在表皮痊愈之后，在真皮中发生组织重建。在该过程中，使胶原蛋白纤维的表达增加，如果胶原蛋白形成是不可控制的，则进而会导致肥厚性瘢痕或瘢痕瘤。因此，为了确定LEM-S401是否可以在组织重建期间抑制CTGF和胶原蛋白的表达，在表皮痊愈之后注射LEM-S401。具体地，使用活检穿孔器来刺穿小鼠皮肤(第0天)，并且在表皮彻底愈合后，在第10天、第14天、第18天和第22天，将LEM-S401注射至伤口部位。通常，在小鼠伤口模型中，在伤口形成之后，10天足以使表皮彻底愈合。在第26天处死之后，通过RT-PCR来分析CTGF以及1型和3型胶原蛋白的表达水平。LEM-S401处理组中CTGF和胶原蛋白的表达水平显著低于对照组中的那些(图18至20)。免疫组织化学分析结果显示，CTGF以及1型和3型胶原蛋白表达水平在LEM-S401处理组中显著降低(图21至24)。

<110> 雷莫内克斯生物制药有限公司(LEMONEX INC.)

<120> 用于抑制CTGF表达的组合物

<130> 19P03005

<150> US 62/712317

<151> 2018-07-31

<160> 113

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 1

cucauuagac uggaacuu 18

<210> 2

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列 1: siRNA 反义链

<400> 2

aaguuccagu cuaaugag 18

<210> 3

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列 1: dsRNA

<400> 3

cucauuagac uggaacuuuu ucuaaag 27

<210> 4

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列 2: siRNA 正义链

<400> 4

ggaacuugaa cugauuca 18

<210> 5

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列 2: siRNA 反义链

<400> 5

ugaaucaguu caaguucc 18

<210> 6

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列 2: dsRNA

<400> 6

ggaacuugaa cugauucauu ccuuucuaaa g 31

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 7

cugagugacu cuauauagcu 20

<210> 8

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 8

agcuauauag agucacucag 20

<210> 9

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 9

cugagugacu cuauauagcu uuucuaaag 29

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 10

gcaugaagac auaccgagc 19

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 11

gcucgguaug ucuucaugc 19

<210> 12

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 12

gcaugaagac auaccgagcu uucuaaag 28

<210> 13

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 13

auguuugcac cuuucuag 18

<210> 14

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 14

cuagaaaggu gcaaacau 18

<210> 15

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 15

auguuugcac cuuucuaguu ccuuucuaaa g 31

<210> 16

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 16

ugagaggaga cagccagu 18

<210> 17

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 17

acuggcuguc uccucuca 18

<210> 18

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 18

ugagaggaga cagccaguuu ccuuucuaaa g 31

<210> 19

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 19

uucgguggua cgguguac 18

<210> 20

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 20

guacaccgua ccaccgaa 18

<210> 21

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 21

uucgguggua cgguguacuu ccuuucuaaa g 31

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 22

uccuuccaga gcagcugcaa 20

<210> 23

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 23

uugcagcugc ucuggaagga 20

<210> 24

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 24

uccuuccaga gcagcugcaa uuucuaaag 29

<210> 25

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 25

ugugugacga gcccaagga 19

<210> 26

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 26

uccuugggcu cgucacaca 19

<210> 27

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 27

ugugugacga gcccaaggau uucuaaag 28

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 28

ugccuggucc agaccacaga 20

<210> 29

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 29

ucuguggucu ggaccaggca 20

<210> 30

<211> 33

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 30

ugccuggucc agaccacaga uuccuuucua aag 33

<210> 31

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 31

caggcuagag aagcagag 18

<210> 32

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 32

cucugcuucu cuagccug 18

<210> 33

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 33

caggcuagag aagcagaguu ucuaaag 27

<210> 34

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 34

ugugcauggu caggccuu 18

<210> 35

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 35

aaggccugac caugcaca 18

<210> 36

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 36

ugugcauggu caggccuuuu ccuuucuaaa g 31

<210> 37

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 37

ugauuucagu agcacaag 18

<210> 38

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 38

cuugugcuac ugaaauca 18

<210> 39

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 39

ugauuucagu agcacaaguu ccuuucuaaa g 31

<210> 40

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 40

uagcgugcuc acugaccu 18

<210> 41

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 41

aggucaguga gcacgcua 18

<210> 42

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 42

uagcgugcuc acugaccuuu ccuuucuaaa g 31

<210> 43

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 43

cugauucgaa ugacacuguu 20

<210> 44

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 44

aacaguguca uucgaaucag 20

<210> 45

<211> 33

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 45

cugauucgaa ugacacuguu uuccuuucua aag 33

<210> 46

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 46

cagauuguuu gcaaaggg 18

<210> 47

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 47

cccuuugcaa acaaucug 18

<210> 48

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 48

cagauuguuu gcaaaggguu ccuuucuaaa g 31

<210> 49

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 49

gcaucagugu ccuuggca 18

<210> 50

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 50

ugccaaggac acugaugc 18

<210> 51

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 51

gcaucagugu ccuuggcauu ccuuucuaaa g 31

<210> 52

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 52

gacauuaacu cauuagac 18

<210> 53

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 53

gucuaaugag uuaauguc 18

<210> 54

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 54

gacauuaacu cauuagacuu ucuaaag 27

<210> 55

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 55

aacucauuag acuggaac 18

<210> 56

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 56

guuccagucu aaugaguu 18

<210> 57

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 57

aacucauuag acuggaacuu ucuaaag 27

<210> 58

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 58

acucauuaga cuggaacu 18

<210> 59

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 59

aguuccaguc uaaugagu 18

<210> 60

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 60

acucauuaga cuggaacuuu ucuaaag 27

<210> 61

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 61

uuagacugga acuugaac 18

<210> 62

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 62

guucaaguuc cagucuaa 18

<210> 63

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 63

uuagacugga acuugaacuu ucuaaag 27

<210> 64

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 64

auuagacugg aacuugaa 18

<210> 65

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 65

uucaaguucc agucuaau 18

<210> 66

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 66

auuagacugg aacuugaauu ucuaaag 27

<210> 67

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 67

cauuagacug gaacuuga 18

<210> 68

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 68

ucaaguucca gucuaaug 18

<210> 69

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 69

cauuagacug gaacuugauu ucuaaag 27

<210> 70

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 70

ucauuagacu ggaacuug 18

<210> 71

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 71

caaguuccag ucuaauga 18

<210> 72

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dsRNA

<400> 72

ucauuagacu ggaacuuguu ucuaaag 27

<210> 73

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 正义链

<400> 73

gcaccagugu gaagacaua 19

<210> 74

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 反义链

<400> 74

uaugucuuca cacuggugc 19

<210> 75

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物正向链

<400> 75

gctcgtcgac aagggctc 18

<210> 76

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物反向链

<400> 76

caaacatgat ctgggtca 18

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物正向链

<400> 77

caagggcctc ttctgtgact 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物反向链

<400> 78

ccgtcggtac atactccaca 20

<210> 79

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物正向链

<400> 79

gcctcccttc ttgggtatgg aa 22

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物反向链

<400> 80

cagctcagta acagtccgcc 20

<210> 81

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物正向链

<400> 81

gggcctcttc tgcgatttc 19

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物反向链

<400> 82

atccaggcaa gtgcattggt a 21

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物正向链

<400> 83

gagcggagag tactggatcg 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物反向链

<400> 84

gttcgggctg atgtaccagt 20

<210> 85

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物正向链

<400> 85

agctttgtgc aaagtggaac ctgg 24

<210> 86

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物反向链

<400> 86

caaggtggct gcatcccaat tcat 24

<210> 87

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 87

ttagactgga acttga 16

<210> 88

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 88

cattagactg gaactt 16

<210> 89

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 89

tccagtctaa tgagtt 16

<210> 90

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 90

ttccagtcta atgagt 16

<210> 91

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 91

agttccagtc taatga 16

<210> 92

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 92

tcaagttcca gtctaa 16

<210> 93

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 93

ttcaagttcc agtcta 16

<210> 94

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 94

caagttccag tctaat 16

<210> 95

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 95

ttcaagttcc agtcta 16

<210> 96

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 96

caagttccag tctaat 16

<210> 97

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 97

tcaagttcca gtctaa 16

<210> 98

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 98

agttccagtc taatga 16

<210> 99

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PNA 反义链

<400> 99

caagttccag tctaat 16

<210> 100

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA 回文序列

<400> 100

aacuugaacu 10

<210> 101

<211> 1

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 101

Lys

1

<210> 102

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 102

Lys Lys

1

<210> 103

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 103

Lys Lys Lys

1

<210> 104

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 104

Lys Lys Lys Lys

1

<210> 105

<211> 1

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 105

Arg

1

<210> 106

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 106

Arg Arg

1

<210> 107

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 107

Arg Arg Arg

1

<210> 108

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 108

Arg Arg Arg Arg

1

<210> 109

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 109

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg

1 5 10 15

Arg Met Lys Trp Lys Lys Gly Gly Cys

20 25

<210> 110

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 110

Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Val Lys Val Gln Arg

1 5 10 15

<210> 111

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 111

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 112

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 112

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 113

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 与PNA末端结合的肽缀合物

<400> 113

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10