基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组、试剂盒及其应用

摘要

本发明提供了基于多重PCR‑DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组和试剂盒及其应用，属于兽医临床检测技术领域。基于多重PCR‑DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组，包括扩增ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因的引物对。本发明提供的引物组具有较强的特异性，能够用于PCR扩增和DHPLC分析。本发明引物组或试剂盒在猪链球菌耐药基因检测中的应用，针对猪链球菌耐大环内酯类药物的四对耐药基因检测，能够同时检测四段目标基因，符合快速高通量技术的需要，检测特异性良好、灵敏度高，可以用于临床检测猪链球菌ermA、ermB、mefA、msrD四种耐大环内酯类药物耐药基因的检测。

说明书

技术领域

本发明属于兽医临床检测技术领域，具体涉及基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组和试剂盒及其应用。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是具有荚膜的一种革兰氏阳性球菌。猪链球菌的定植部位为猪的上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔。部分血清型的猪链球菌具有致病性，主要通过伤口感染。可引起猪的急性败血症(septicemia with sudden death)、脑膜炎(meningitis)、关节炎(arthritis)、心内膜炎(endocarditis)、肺炎(pneumonia)等疾病。部分菌株可引起人类感染，造成细菌性脑炎(bacterial meningitis)或引起中毒样休克综合征(toxic shock-like syndrome)。

猪链球菌病感染一般可根据临床症状和病理剖检变化进行初步诊断。确诊需要通过血清学检查、分离病原菌和病理组织学检查等实验室方法进行。针对检测的猪链球菌通常采用抗生素类药物进行治疗，例如大环内脂类抗生素常常用于治疗需氧革兰阳性球菌和阴性球菌。但是现有技术中有关于猪链球菌中存在耐药基因的报道，因此，在用药之前，对感染的猪链球菌进行耐药基因的检测有利于指导用药。

目前猪链球菌针对大环内脂类抗生素的耐药基因包括ermA/B/C、mefA、msrD、mphB、23S rRNA、L4、L22等，对上述耐药基因检测通常对单个基因进行PCR检测方法，当检测多个耐药基因时需要多次PCR检测，操作繁琐而且检测灵敏度较低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组和试剂盒及其应用，本发明提供的引物组能同时检测ermA、ermB、mefA、msrD四个基因，且具有检测灵敏性高、特异性强、快速准确的特点。

本发明提供的基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组，包括扩增ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因的引物对；

扩增ermA基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

扩增ermA基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

扩增ermB基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

扩增ermB基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

扩增mefA基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

扩增mefA基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

扩增msrD基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

扩增msrD基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明提供了基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的试剂盒，包括所述的引物组。

优选的，还包括以下试剂：含Mg

优选的，还包括DHPLC检测用流动相；

所述流动相由体积分数为55％的缓冲溶液A和体积分数为45％的缓冲溶液B组成；

所述缓冲液A为每1000ml包括以下含量的组分：50mL乙酸三乙胺、250mL乙腈，余量的去离子水；

所述缓冲液B为每1000ml包括以下含量的组分：50mL乙腈、250mL乙酸三乙胺，余量的去离子水。

本发明提供的所述的引物组或所述的试剂盒在猪链球菌耐药基因检测中的应用。

优选的，所述猪链球菌耐药基因检测的方法，包括以下步骤：

1)以猪链球菌的基因组DNA为模板，用所述的引物组进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)将步骤1)中PCR扩增产物进行DHPLC检测，得到DHPLC峰型图谱；

3)将步骤2)中所述DHPLC峰型图谱与标准品DHPLC峰型图谱比对，判断猪链球菌中耐药基因的存在情况。

优选的，步骤1)中所述多重PCR扩增的扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

优选的，步骤1)中所述多重PCR扩增的扩增体系如下：20mM含Mg

优选的，DHPLC检测的柱温为50℃；流动相的流速：0.75mL/min；进样量为5～10μL；洗脱时长为20min。

优选的，DHPLC检测用检测器为荧光检测器；所述荧光检测器的光源为150W Xenon灯；激发谱带宽为15nm；发射谱带宽为15.3nm；检测灵敏度为在波长350nm条件下2s积分。

本发明提供的基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组，包括扩增ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因的引物对。本发明提供的引物组能同时检测ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因四个基因，同时4对引物在同一体系的PCR扩增中不发生任何干扰，能准确得到4个基因的扩增结果。同时本发明提供的引物组还具有特异性强的特点，能准确扩增目标基因片段，保证检测结果的准确性。

本发明提供的所述的引物组或所述的试剂盒在猪链球菌耐药基因检测中的应用。本发明将PCR与变性高效液相色谱(Denaturing highperformance liquidchromatography，DHPLC)方法有机结合，并根据NCBI收录的猪链球菌耐药基因，结合其耐药表型，选取ermA、ermB、mefA和msrD等4组耐大环内酯类药物的耐药基因设计特异性引物，将多重PCR体系以及DHPLC技术的结合以实现猪链球菌的高通量、自动化检测。同时整体检测方法简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，同时避免了PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测时，EB或者Goldview对人体和环境带来的潜在危害；PCR-DHPLC检测方法与传统微生物检验方法以及凝胶电泳法相比，具有灵敏性高、特异性强、快速准确、结果分析简单，对待样品要求不高，可进行大通量检测等优点。此外，猪链球菌耐药基因多重PCR-DHPLC检测引物具有较强的特异性，保证后续准确PCR扩增以及DHPLC分析。本发明提供的应用是一种操作简便、扩展性能好、灵敏度和分辨率高的猪链球菌耐药基因检测方法，实现了猪链球菌耐药基因的多靶标检测。利用对扩增产物进行分析，对不同大小的产物片段区分率可达数个碱基，碱基分辨率高。所述为猪链球菌耐药基因检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的高通量检测方法，特别适合用于口岸检验检疫、农业生产等部门使用。

附图说明

图1为本发明实验材料猪链球菌的16s rRNA及谷氨酸脱氢酶基因扩增片段，其中1、2、5～8为双阳性样本；3为16s rRNA阳性、谷氨酸脱氢酶基因阴性样本；4为阴性样本；

图2为常见抗生素MIC药敏实验150株供试菌株年代分布图；

图3为猪链球菌耐药基因ermA的PCR扩增电泳图，其中1、7、8为阴性样本；2～6为阳性样本；9为阳性对照，10为阴性对照；

图4为猪链球菌耐药基因ermA的DHPLC图谱，方框部分表示特异性峰值，ermA1、ermA2为阳性样本，ermA3为阴性样本；

图5为猪链球菌耐药基因ermB的PCR检测图，其中1～7为阳性样本；8为阴性样本；9为阳性对照，10为阴性对照；

图6为猪链球菌耐药基因ermB的DHPLC图谱，方框部分表示特异性峰值；

图7为猪链球菌耐药基因emfA的PCR检测图，其中1～4为阳性样本；5～8为阴性样本；9为阳性对照，10为阴性对照；

图8为猪链球菌耐药基因emfA的DHPLC图谱，方框部分表示特异性峰值，其中1、2、3、5为阳性样本，4为阴性样本；

图9为猪链球菌耐药基因msrD的PCR检测图，其中1～4为阳性样本；5～8为阴性样本；9为阳性对照，10为阴性对照；

图10为猪链球菌耐药基因msrD的DHPLC图谱，方框部分表示特异性峰值，其中1～3为阳性样本，4为阴性样本；

图11为灵敏度检测实验结果，其中图11-A为PCR-琼脂凝胶成像检测灵敏度，其中1～7分别表示稀释倍数为3

图12为mPCR-DHPLC检测猪链球菌耐大环内酯类药物基因的临床应用，其中图12-A为多重PCR检测电泳图，1号为ermA+ermB阳性；2号为ermA+msrD阳性；3号为ermB阳性；4号为ermB+mefA阳性；5号为mefA+msrD阳性；6号为ermB+mefA+msrD阳性；7号为ermB+msrD阳性；8号为ermA+ermB+mefA阳性；9号为阴性对照；图12-B为四种基因的阳性标准品的谱图；图12-C为mPCR-DHPLC检测结果，各样本见右侧标识。

具体实施方式

本发明提供的基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组，包括扩增ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因的引物对；

扩增ermA基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

扩增ermA基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

扩增ermB基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

扩增ermB基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

扩增mefA基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

扩增mefA基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

扩增msrD基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

扩增msrD基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

在本发明中，所述引物组4对引物根据现有技术中公开的ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因的核苷酸序列为模板设计得到。所述4对引物在同一体系，相同的退火温度下进行PCR扩增，彼此之间不产生干扰，能够准确得到四个基因的扩增结果。所述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。在本发明实施例中，所述引物组委托生工生物工程(上海)有限公司合成。

本发明提供了基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的试剂盒，包括所述的引物组。所述试剂盒优选还包括以下试剂：含Mg

在本发明中，所述试剂盒优选还包括DHPLC检测用流动相；所述流动相由体积分数为55％的缓冲溶液A和体积分数为45％的缓冲溶液B组成；

所述缓冲液A为每1000ml包括以下含量的组分：50mL乙酸三乙胺、250μL乙腈，余量的去离子水；所述缓冲液B为每1000ml包括以下含量的组分：50mL乙腈、250mL乙酸三乙胺，余量的去离子水。

本发明提供的所述的引物组或所述的试剂盒在猪链球菌耐药基因检测中的应用。

在本发明中，所述猪链球菌耐药基因检测的方法，优选包括以下步骤：

1)以猪链球菌的基因组DNA为模板，用所述的引物组进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)将步骤1)中PCR扩增产物进行DHPLC检测，得到DHPLC峰型图谱；

3)将步骤2)中所述DHPLC峰型图谱与标准品DHPLC峰型图谱比对，根据标准品的出峰情况，判断猪链球菌中耐药基因是否存在。

在本发明中，所述猪链球菌的基因组DNA的提取方法没有特殊限制采用本领域所熟知的细菌DNA提取方法即可。在本发明实施例中，所述猪链球菌的基因组DNA的提取方法如下：取培养后的增菌液1mL，离心，去除上清，得到沉淀用溶葡菌酶进行预处理1h；然后按照细菌DNA提取试剂盒的说明书提取猪链球菌基因组DNA。所述猪链球菌的分离方法优选包括以下步骤：将样本接种至哥伦比亚血琼脂培养基，置于5％CO

在本发明中，所述多重PCR扩增的扩增程序优选如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。所述多重PCR扩增的扩增体系优选如下：20mM含Mg

在本发明中，DHPLC检测用色谱柱优选为PS-DVB C18DNASep色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×50mm，3μm。DHPLC检测的柱温优选为50℃；流动相的流速优选为0.75mL/min；进样量优选为5～10μL；洗脱时长优选为20min。DHPLC检测用检测器优选为荧光检测器；所述荧光检测器的光源优选为150WXenon灯；激发谱带宽优选为15nm；发射谱带宽优选为15.3nm；检测灵敏度优选为在波长350nm条件下2s积分。

在本发明中，标准品DHPLC峰型图谱的获得方法优选如下：将猪链球菌的ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因采用上述引物组的4对引物分别扩增，得到的4种扩增片段混合，得到的混合液按照上述检测方法进行DHPLC检测，得到标准品DHPLC峰型图谱。根据标准品DHPLC峰型图谱可以明确得到ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因扩增片段的出峰位置。将所述DHPLC峰型图谱与标准品DHPLC峰型图谱比对，根据标准品中4种扩增片段的出峰位置，判断猪链球菌中耐药基因是否存在，如果猪链球菌中4种耐药基因均未出峰，说明检测的猪链球菌不带有上述4种耐药基因，当与标准品DHPLC峰型图谱相比，在对应位置处出现1～4个峰，说明检测的猪链球菌带有相应的耐药基因。

下面结合实施例对本发明提供的基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组和试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

所用猪链球菌菌株均来自本中心1998年至2017年间分离、鉴定和保存的猪链球菌。所述鉴定用基因包括猪链球菌16s rRNA及谷氨酸脱氢酶基因。采用PCR的方法对16srRNA及谷氨酸脱氢酶基因进行双重PCR检测。PCR反应体系为25μL：2×premix 12.5μL、两对引物上下游各0.5μL、DNA模板2μL、灭菌蒸馏水8.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃延伸10min。两对引物的核苷酸序列信息见表1。

表1猪链球菌16s rRNA及谷氨酸脱氢酶基因扩增引物信息一览表

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后呈像并拍照，16s目的片段大小为328bp，谷氨酸脱氢酶基因目的片段大小688bp。

结合菌株分离年代背景、场户来源等信息，选取其中150株菌株开展5类8种常见抗生物的MIC药敏试验(见图2)。选取99株菌株开展大环内酯类耐药检测及耐药表型检测的菌种信息见表2。

表2大环内酯耐药基因检测及MIC药敏试验-99株菌株背景信息表

实施例2

从实施例1的表2中选取91株菌株作为猪链球菌耐大环内酯类药物耐药基因mPCR-DHPLC检测技术的临床验证菌株，具体选择的菌种为表2中的1～90号和96号。

为了验证ermA基因基因的引物扩增情况，进行如下实验：

猪链球菌Streptococcus suis strain 36a/Genbank登录号EU348757.1的ermA基因序列(gataatgtaatagaaattggatcaggaaaaggtcattttaccaaagaacttgtcaaaatgagtcggtgggtggattctatagaaattgatgaggacttgtgtcaagtcacccaaaaagtcgtgaagccttttcagaatataaaagttatccatacggatattctgaaatttaacttccccaaaaacaaagactataaaatatttggtaatatcccctttaacatcagtactgatattgtcaaaaaaattgcttttgaaagcaattcgaaatatagttaccttattgtggagaatggttttgcaaaaagattacaaaatacgaaacgagctttaggtttgctattgatggtggaattggacataagagttctcaaaaaagtgccacgagcatattttcaccctaaaccgaatgtagactctgtattgattgttcttgaacgacatcaaccattgattttaaagaaggactacaaagagtatcaatcttttgtttataagtgggtaaaccgtgaatatcgcgttctttttactaaaaaccaattccgacaggctttgaagcatgcaaatgtcactaatattaataaactatcgaag，SEQ IDNo.13)为模板，设计引物，得到ermA-F tctaaaaagcatgtaaaagaa(SEQ ID No.1)，ermA-Rcttcgatagtttattaatattagt(SEQ ID No.2)。

分别以表2中菌种为原料，提取猪链球菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以ermA-F和ermA-R为引物进行PCR扩增反应，PCR扩增的扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR扩增的扩增体系优选如下：20mM含Mg

将得到的PCR扩增产物进行DHPLC检测，具体检测方法如下：

PCR产物上样量5μL；色谱柱为PS-DVB C18DNASep色谱柱，且该色谱柱的规格为4.6mm×50mm，3μm；柱温为50℃；流速为0.75mL/min；

流动相由缓冲溶液A体积分数为55％和缓冲溶液B体积分数为45％组成；缓冲液A为50mLTEAA、250μL乙腈，去离子水定容至1000mL，缓冲液B为50mL乙腈、250mLTEAA，去离子水定容至1000mL；

检测器为荧光检测器，光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm条件下2s积分；

系统自动按照线性递增的方式将DNASep柱上的DNA分子洗脱(洗脱液即为流动相，溶液A体积分数55％，溶液B体积分数为45％)下来，在波长260nm处读取吸光值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱(图4)。

实施例3

为了验证单个基因的引物扩增情况，进行如下实验

猪链球菌Streptococcus suis BM407/Genbank登录号FM252032.1(atgaacaaaaatataaaatattctcaaaactttttaacgagtgaaaaagtactcaaccaaataataaaacaattgaatttaaaagaaaccgataccgtttacgaaattggaacaggtaaagggcatttaacgacgaaactggctaaaataagtaaacaggtaacgtctattgaattagacagtcatctattcaacttatcgtcagaaaaattaaaactgaatactcgtgtcactttaattcaccaagatattctacagtttcaattccctaacaaacagaggtataaaattgttgggaatattccttaccatttaagcacacaaattattaaaaaagtggtttttgaaagccatgcgtctgacatctatctgattgttgaagaaggattctacaagcgtaccttggatattcaccgaacactagggttgctcttgcacactcaagtctcgattcagcaattgcttaagctgccagcggaatgctttcatcctaaaccaaaagtaaacagtgtcttaataaaacttacccgccataccacagatgttccagataaatattggaagctatatacgtactttgtttcaaaatgggtcaatcgagaatatcgtcaactgtttactaaaaatcagtttcatcaagcaatgaaacacgccaaagtaaacaatttaagtaccgttacttatgagcaagtattgtctatttttaatagttatctattatttaacggga ggaaataa，SEQ ID No.14)为模板，设计引物，得到ermB-F(gaaaaggatctcaaccaaata，SEQ ID No.3)，ermB-F(agtaacggtacttaaattgtttac，SEQ ID No.4)。

分别以表2中菌种为原料，提取猪链球菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以ermB-F和ermB-R为引物进行PCR扩增反应，PCR扩增的扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR扩增的扩增体系优选如下：20mM含Mg

将得到的PCR扩增产物进行DHPLC检测，具体检测方法如下：

PCR产物上样量5μL；色谱柱为PS-DVB C18DNASep色谱柱，且该色谱柱的规格为4.6mm×50mm，3μm；柱温为50℃；流速为0.75mL/min；

流动相由缓冲溶液A体积分数为55％和缓冲溶液B体积分数为45％组成；缓冲液A为50mLTEAA、250μL乙腈，去离子水定容至1000mL，缓冲液B为50mL乙腈、250mLTEAA，去离子水定容至1000mL；

检测器为荧光检测器，光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm条件下2s积分；

系统自动按照线性递增的方式将DNASep柱上的DNA分子洗脱(洗脱液即为流动相，溶液A体积分数55％，溶液B体积分数为45％。)下来，在波长260nm处读取吸光值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱(图6)。

实施例4

为了验证mefA基因的引物扩增情况，进行如下实验：

猪链球菌Streptococcus suis strainYY060816/Genbank登录号KX077898.(atggaaaaatacaacaattggaaacttaagttttatacaatatgggcagggcaagcagtatcattaatcactagtgccatcttgcaaatggcgattattttttaccttacagaaaaaactggatccgcgatggtcttgtctatggcttcactattaggttttttaccctatgcggtctttggacctgcaattggtgtgctagtggatcgtcatgataggaagaagataatgattggtgctgatttaattatcgcagcagctggttcggtgcttactattgttgcattctatatggagctacctgtctggatggttatgatagtattgtttatccgtagcattggaacagcttttcacaccccggctctcaatgcggttacgccacttttagtaccagaagaacagcttacgaaatgtgcaggctatagtcagtctttgcagtctataagctatattgttagtccggcagttgcagcactcttatactccgtttgggaactaaatgctattattgccatcgatgtattgggtgctgtgattgcatctattacggtagcaattgtacgtatacctaagctgggtaatcaagtgcaaagtttagaaccaaatttcataagagagatgaaagaaggagttgtggttctgagacaaaacaaaggattgtttgccttattactcttaggaacactatatacttttgtttatatgccaatcaatgcactatttcctttaataagcatggaacactttaatggaacgcctgtgcatatttctattacggaaatttcctttgcatttgggatgctagcaggaggcttattattaggaagattagggggcttcgaaaagcatgtattactaataacaagttcattttttataatggggaccagtttagccgtttcgggaatacttcctccaaatggatttgtaatattcgtagtttgctgtgcaataatggggctttcggtgccattttatagcggtgtgcaaacagctctttttcaggagaaaattaagcctgaatatttaggacgtgtattttctttgaccggaagtatcatgtcacttgctatgccaattgggttaattctttctgcactctttgctgatagaatcggtgtaaatcattggtttttactatcaggtattttaattat ttgcattgca atagtttgcc caatgataaatgagattagaaaattagatttaaaataa，SEQ ID No.15)为模板，设计引物，得到mefA-F(agtatcattaatcactagtgc，SEQIDNo.5)，mefA-R(ttcttctggtactaaaagtgc，SEQ ID No.6)。

分别以表2中菌种为原料，提取猪链球菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以mefA-F和mefA-R为引物进行PCR扩增反应，PCR扩增的扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR扩增的扩增体系优选如下：20mM含Mg

将得到的PCR扩增产物进行DHPLC检测，具体检测方法如下：

PCR产物上样量5μL；色谱柱为PS-DVB C18DNASep色谱柱，且该色谱柱的规格为4.6mm×50mm，3μm；柱温为50℃；流速为0.75mL/min；

流动相由缓冲溶液A体积分数为55％和缓冲溶液B体积分数为45％组成；缓冲液A为50mLTEAA、250μL乙腈，去离子水定容至1000mL，缓冲液B为50mL乙腈、250mLTEAA，去离子水定容至1000mL；

检测器为荧光检测器，光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm条件下2s积分；

系统自动按照线性递增的方式将DNASep柱上的DNA分子洗脱(洗脱液即为流动相，溶液A体积分数55％，溶液B体积分数为45％)下来，在波长260nm处读取吸光值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱(图8)。

实施例4

为了验证msrD基因的引物扩增情况，进行如下实验：

猪链球菌Streptococcus suis strainYY060816/Genbank登录号KX077898.1(atggaattaatattaaaagcaaaagacattcgtgtggaattcaaaggacacgatgttttagatataaatgaattagaagtatatgattatgaccgtattggtttagtaggagcaaatggtgcaggaaaaagcactttattcaaggtacttttaggagaattaattcccccaggatgtaaaatgaatcatctgggtgaacttgcctatattccccagttggacgaagtaactctgcaggaggaaaaagattttgcgcttgtaggcaagctaggtgttgagcaattaaatatacagaccatgagcggtggtgaagaaacaaggcttaaaatagcacaggccttatcggcacaggttcatggtattttagcggatgaacctacgagccatttagaccgtgaaggaattgattttctaataggacagctaaaatattttacaggtgcactgttagttattagccatgaccgctattttcttgatg aaatagtaga taaaatatgggaactgaaag atggcaaaat cactgagtattggggaaactattctgattatcttcgtcagaaagaggaagaacgtaagagacaagctgcagaatacgaacaatttattgcggaacgtgctcgattggaaagggctgcggaggaaaagcgaaaacaggctcgtaaaatagaacagaaggcaaaaggttcttcaaagaaaaaaagtactgaaggcggagggcgtttagctcatcaaaaatcaataggaagtaaggaaaaaaagatgtataatgctgctaaaaccctagagca caggattgcggccttaggaaaagtagaagctccggaaggcattcgcagaa ttcgtttcaggcaaagtaaagcattggagctccataatccataccctatagtcggtgcagaaattaataaagtatttggggataaggctctttttgaaaatgcatcttttcaaattccgttaggagcaaaagtggcgttaactggtggtaatggaatcggaaaaacaactttaatccaaatgatcttaaaccatgaagaaggaatttctatttcgcctaaggcaaaaataggttactttgcacagaatggttacaagtacaacagtaatcagaatgttatggagtttatgcagaaggattgtgactacaatatatcagaaattcgttcagtgctagcatctatggggttcaaacagaacgatattggaaaaagtttatctgttttaagcggtggagaaat tataaaattgttgcttgctaaaatgctcatgggtagatataacatcctaataatggatgaacccagtaacttccttgacataccaagtttagaggctttggaaatactaatgaaggagtacaccggaactatcgtgtttatcacccacgataaacgattactcgaaaatg tagcagatgt agtttatgaaattagagata agaaaataaatctgaaacattaa，SEQ ID No.16)为模板，设计引物，得到msrD-F(ccttatcggcacaggttcat，SEQ ID No.7)，msrD-R(gccttccggagctcctactt，SEQ ID No.8)。

分别以表2中菌种为原料，提取猪链球菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以msrD-F和msrD-R为引物进行PCR扩增反应，PCR扩增的扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR扩增的扩增体系优选如下：20mM含Mg

将得到的PCR扩增产物进行DHPLC检测，具体检测方法如下：

PCR产物上样量5μL；色谱柱为PS-DVB C18DNASep色谱柱，且该色谱柱的规格为4.6mm×50mm，3μm；柱温为50℃；流速为0.75mL/min；

流动相由缓冲溶液A体积分数为55％和缓冲溶液B体积分数为45％组成；缓冲液A为50mLTEAA、250μL乙腈，去离子水定容至1000mL，缓冲液B为50mL乙腈、250mLTEAA，去离子水定容至1000mL；

检测器为荧光检测器，光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm条件下2s积分；

系统自动按照线性递增的方式将DNASep柱上的DNA分子洗脱(洗脱液即为流动相，溶液A体积分数55％，溶液B体积分数为45％。)下来，在波长260nm处读取吸光值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱(图10)。

实施例5

灵敏度检测实验

以ermB阳性菌株(课题编号为3号)为模板，提取菌株核酸并测定核酸样本原始DNA含量为406.6ng/μL。采用1：3：9：27：81：243：729依次3倍稀释的7个梯度样本按照实施例4的方法进行PCR-DHPLC检测，分别采用传统琼脂糖凝胶电泳和DHPLC检测方法读取检测结果。

传统琼脂糖凝胶电泳结果见图11-A。DHPLC峰型图谱见图11-B。

表4传统PCR检测与DHPLC检测灵敏度比较表

以ermB(3号菌株)为模板进行梯度稀释后，PCR检测至1:3

实施例6

mPCR-DHPLC检测方法的建立与初步应用(临床检验)

通过对已测定样本的筛选，最终选取mefA、msrD均检测为阳性的13号样本；ermB、mefA、msrD均检测为阳性的8号样本；ermA、mefA均检测为阳性的14号样本；ermA、ermB均检测为阳性的17号样本为验证检测方法的阳性样本。同时选取4种耐药基因检测结果全部为阴性的4号样本作为阴性对照。采用建立的mPCR-DHPLC检测方法对已有的50株门诊分离猪链球菌开展耐大环内酯类药物耐药基因的检测，并将检测结果与四组单独检测进行比较，检验该方法的准确性。

对已知样本的检测结果如下图12-A所示：所有阳性样本均可在特定位置检测到峰值，阴性样本则不能检测到峰值。图12-B为4种基因的阳性标准品得到的峰形图谱。而如图12-C所示的mPCR-琼脂糖凝胶电泳方法则可以看出，条带大小相近的ermA和ermB基因在凝胶电泳中发生重叠，肉眼无法区分，而DHPLC方法虽波峰略有重叠，但可明显分别两个波峰，因此可很大程度上排除人眼识别误差，结果更为直观。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心）

<120> 基于多重PCR-DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组、试剂盒及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctaaaaagc atgtaaaaga a 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttcgatagt ttattaatat tagt 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaaaggatc tcaaccaaat a 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtaacggta cttaaattgt ttac 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtatcatta atcactagtg c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcttctggt actaaaagtg c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccttatcggc acaggttcat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccttccgga gctcctactt 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagtatttac cgcatggtag atat 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtaagatacc gtcaagtgag aa 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccatggacag ataaagatgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcagcgtatt ctgtcaaacg 20

<210> 13

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gataatgtaa tagaaattgg atcaggaaaa ggtcatttta ccaaagaact tgtcaaaatg 60

agtcggtggg tggattctat agaaattgat gaggacttgt gtcaagtcac ccaaaaagtc 120

gtgaagcctt ttcagaatat aaaagttatc catacggata ttctgaaatt taacttcccc 180

aaaaacaaag actataaaat atttggtaat atccccttta acatcagtac tgatattgtc 240

aaaaaaattg cttttgaaag caattcgaaa tatagttacc ttattgtgga gaatggtttt 300

gcaaaaagat tacaaaatac gaaacgagct ttaggtttgc tattgatggt ggaattggac 360

ataagagttc tcaaaaaagt gccacgagca tattttcacc ctaaaccgaa tgtagactct 420

gtattgattg ttcttgaacg acatcaacca ttgattttaa agaaggacta caaagagtat 480

caatcttttg tttataagtg ggtaaaccgt gaatatcgcg ttctttttac taaaaaccaa 540

ttccgacagg ctttgaagca tgcaaatgtc actaatatta ataaactatc gaag 594

<210> 14

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgaacaaaa atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt actcaaccaa 60

ataataaaac aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg aacaggtaaa 120

gggcatttaa cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat tgaattagac 180

agtcatctat tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt 240

caccaagata ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggaat 300

attccttacc atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccatgcgtct 360

gacatctatc tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca 420

ctagggttgc tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa 480

tgctttcatc ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca 540

gatgttccag ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga 600

gaatatcgtc aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta 660

aacaatttaa gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta 720

tttaacggga ggaaataa 738

<210> 15

<211> 1218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggaaaaat acaacaattg gaaacttaag ttttatacaa tatgggcagg gcaagcagta 60

tcattaatca ctagtgccat cttgcaaatg gcgattattt tttaccttac agaaaaaact 120

ggatccgcga tggtcttgtc tatggcttca ctattaggtt ttttacccta tgcggtcttt 180

ggacctgcaa ttggtgtgct agtggatcgt catgatagga agaagataat gattggtgct 240

gatttaatta tcgcagcagc tggttcggtg cttactattg ttgcattcta tatggagcta 300

cctgtctgga tggttatgat agtattgttt atccgtagca ttggaacagc ttttcacacc 360

ccggctctca atgcggttac gccactttta gtaccagaag aacagcttac gaaatgtgca 420

ggctatagtc agtctttgca gtctataagc tatattgtta gtccggcagt tgcagcactc 480

ttatactccg tttgggaact aaatgctatt attgccatcg atgtattggg tgctgtgatt 540

gcatctatta cggtagcaat tgtacgtata cctaagctgg gtaatcaagt gcaaagttta 600

gaaccaaatt tcataagaga gatgaaagaa ggagttgtgg ttctgagaca aaacaaagga 660

ttgtttgcct tattactctt aggaacacta tatacttttg tttatatgcc aatcaatgca 720

ctatttcctt taataagcat ggaacacttt aatggaacgc ctgtgcatat ttctattacg 780

gaaatttcct ttgcatttgg gatgctagca ggaggcttat tattaggaag attagggggc 840

ttcgaaaagc atgtattact aataacaagt tcatttttta taatggggac cagtttagcc 900

gtttcgggaa tacttcctcc aaatggattt gtaatattcg tagtttgctg tgcaataatg 960

gggctttcgg tgccatttta tagcggtgtg caaacagctc tttttcagga gaaaattaag 1020

cctgaatatt taggacgtgt attttctttg accggaagta tcatgtcact tgctatgcca 1080

attgggttaa ttctttctgc actctttgct gatagaatcg gtgtaaatca ttggttttta 1140

ctatcaggta ttttaattat ttgcattgca atagtttgcc caatgataaa tgagattaga 1200

aaattagatt taaaataa 1218

<210> 16

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggaattaa tattaaaagc aaaagacatt cgtgtggaat tcaaaggaca cgatgtttta 60

gatataaatg aattagaagt atatgattat gaccgtattg gtttagtagg agcaaatggt 120

gcaggaaaaa gcactttatt caaggtactt ttaggagaat taattccccc aggatgtaaa 180

atgaatcatc tgggtgaact tgcctatatt ccccagttgg acgaagtaac tctgcaggag 240

gaaaaagatt ttgcgcttgt aggcaagcta ggtgttgagc aattaaatat acagaccatg 300

agcggtggtg aagaaacaag gcttaaaata gcacaggcct tatcggcaca ggttcatggt 360

attttagcgg atgaacctac gagccattta gaccgtgaag gaattgattt tctaatagga 420

cagctaaaat attttacagg tgcactgtta gttattagcc atgaccgcta ttttcttgat 480

gaaatagtag ataaaatatg ggaactgaaa gatggcaaaa tcactgagta ttggggaaac 540

tattctgatt atcttcgtca gaaagaggaa gaacgtaaga gacaagctgc agaatacgaa 600

caatttattg cggaacgtgc tcgattggaa agggctgcgg aggaaaagcg aaaacaggct 660

cgtaaaatag aacagaaggc aaaaggttct tcaaagaaaa aaagtactga aggcggaggg 720

cgtttagctc atcaaaaatc aataggaagt aaggaaaaaa agatgtataa tgctgctaaa 780

accctagagc acaggattgc ggccttagga aaagtagaag ctccggaagg cattcgcaga 840

attcgtttca ggcaaagtaa agcattggag ctccataatc cataccctat agtcggtgca 900

gaaattaata aagtatttgg ggataaggct ctttttgaaa atgcatcttt tcaaattccg 960

ttaggagcaa aagtggcgtt aactggtggt aatggaatcg gaaaaacaac tttaatccaa 1020

atgatcttaa accatgaaga aggaatttct atttcgccta aggcaaaaat aggttacttt 1080

gcacagaatg gttacaagta caacagtaat cagaatgtta tggagtttat gcagaaggat 1140

tgtgactaca atatatcaga aattcgttca gtgctagcat ctatggggtt caaacagaac 1200

gatattggaa aaagtttatc tgttttaagc ggtggagaaa ttataaaatt gttgcttgct 1260

aaaatgctca tgggtagata taacatccta ataatggatg aacccagtaa cttccttgac 1320

ataccaagtt tagaggcttt ggaaatacta atgaaggagt acaccggaac tatcgtgttt 1380

atcacccacg ataaacgatt actcgaaaat gtagcagatg tagtttatga aattagagat 1440

aagaaaataa atctgaaaca ttaa 1464