引物标记技术的应用与葡萄球菌多重耐药基因检测法的建立

摘要

目的 基于多重基因遗传信息表达分析系统(GeXP)技术平台,应用CY5(荧光染料)标记的特异引物代替通用引物,建立一种高通量的葡萄球菌多重耐药基因检测法.方法 设计细菌16S rDNA、耐甲氧西林相关基因(mecA、MecA LGA251)与耐大环内酯类相关基因(ermA、ermB、ermC、sat4、msrA、ereA、ereB、mefA/E)的引物,经“PCR+琼脂糖电泳”筛查2014年1月-2016年12月中山大学附属第八医院129株耐甲氧西林或者耐红霉素葡萄球菌基因,同时优化PCR.用CY5标记上游引物5'端,制作GeXP多重PCR引物.应用多重PCR扩增多重耐药基因核酸,产物经琼脂糖电泳与GeXP毛细管电泳,分析电泳图优化PCR.应用优化后的GeXP多重PCR扩增43株葡萄球菌,验证应用效果.结果 129株葡萄球菌筛出7种基因(16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC、sat4和msrA).16S rDNA、mecA、ermA、ermB、ermC和msrA引物特异性好,但不同核酸的sat4基因能扩增出两种不同大小片段.建立的GeXP多重PCR能同时检出所有靶基因.43株葡萄球菌的检测结果与表型检测(VITEKⅡCompact System)相符;与“PCR+琼脂糖电泳”相比:sat4符合率为97.67％(42/43),无统计学差异(P＞0.05);msrA符合率为95.35％(41/43),无统计学差异(P＞0.05);ermA、mecA、16S rDNA、ermB和ermC符合率均为100％(43/43).结论 采用CY5标记特异引物应用于GeXP系统检测葡萄球菌多重耐药基因的方法可行,其特异性与敏感性高,若采用更多引物,其检测通量可进一步提高.