一种测定鸡蛋黄中斑蝥黄的固相萃取—高效液相色谱法

摘要

本发明公开一种测定鸡蛋黄中斑蝥黄的固相萃取—高效液相色谱法。5g蛋黄用乙腈在超声波辅助下提取，提取液经水稀释后直接上样至PRiME HLB固相萃取柱，先用5mL乙腈水溶液（体积比，1:1）淋洗，再用3mL乙腈洗脱，洗脱液于50℃氮气吹干，最后由Welch C18色谱柱分离，流动相为乙腈—水（95:5，V/V），流速为1.2 mL/min，等度洗脱，在紫外—可见吸收波长474 nm处检测，外标法对斑蝥黄及其异构体进行定量分析。该方法能够满足蛋黄中斑蝥黄及其异构体快速、准确测定的需要。

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定鸡蛋黄中斑蝥黄的固相萃取—高效液相色谱法。

背景技术

鸡蛋是许多国家重要的食物之一，它们除了含有营养物质还含有类胡萝卜素，类胡萝卜素在蛋黄中沉积赋予其金黄色或橙色（Brulc，2013）。斑蝥黄化学名称为β, β-胡萝卜-4, 4-二酮，主要有全反式（图1）和顺式（图2）异构体（Wenzel，2010），它作为一种重要的类胡萝卜素类红色色素，被用作禽类着色剂，以增强禽类皮肤、肌肉以及蛋黄的颜色（Choi，2005），除此之外，就像其他类胡萝卜色素一样，它还是一种有效的抗氧化剂（Weber，2013）。但是摄取过量的斑蝥黄可能在人和动物的视网膜上沉积，导致视觉问题（Surai，2012），另外，以笼养鸡和鸡蛋冒充高价土鸡和土鸡蛋的做法，侵害了消费者利益，为此，2019年315曝光了“化妆”的土鸡蛋。2003年英国对于肉禽和蛋禽饲料中斑蝥黄的添加量予以规定，在肉禽和蛋禽配合饲料中添加量分别不超过25 mg/kg和8 mg/kg（Weber，2013）。2017年我国农业农村部也做出了同样的限制（农业农村部公告第2625号）。欧洲食品安全局和日本厚生劳动省则分别规定了蛋黄中斑蝥黄的最高残留限量为30 µg/g和25 µg/g（Furusawa，2011）。

目前，文献报道关于蛋黄中斑蝥黄的检测，主要有高效液相色谱法（HPLC）（Furusawa，2014；Bononi，2002；Schlatterer，2006）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）（Wenzel，2010；Nimalaratne，2012；Tsiaka，2018）。基于高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法分析蛋黄中斑蝥黄的仪器方法较为成熟，也实现了对多种色素的同时检测，但是往往忽略了斑蝥黄的顺式异构体的定量（Li，2005；Furusawa，2011；Brucl，2013；Chen，2019），而据文献报道，斑蝥黄顺式异构体较全反式异构体具有更强的抗氧化性能（Venugopalan，2013）。另外，减少蛋黄中脂类物质的干扰以获得较高的回收率、简便的提取和净化方法，从而建立准确、快速的蛋黄中斑蝥黄顺反异构体定量分析方法是一项严峻的挑战。

蛋黄中脂类物质的去除主要有以下三种途径。皂化法：Larsen等（Larsen，2005）使用氢氧化钾的甲醇溶液提取叶黄素类物质，但是皂化过程会导致色素降解（Wenzel，2010），因此该方法在后续文献中较少报道；固相萃取法：有机溶剂先从样品基质中提取斑蝥黄，比较常见的溶剂有乙腈（He，2012；GB/T 22958—2008）、甲醇（Wenzel，2011）、丙酮（Li，2005）、石油醚—甲醇—乙酸乙酯混合溶液（Schlatterer，2006）、乙腈—乙酸乙酯混合溶液（Chen，2019）以及无水乙醇—二氯甲烷混合溶液（GB/T 18970-2003）等，随后经C

发明内容

针对现有鸡蛋黄中斑蝥黄检测方法前处理方法过于复杂、回收率较低、不能对斑蝥黄顺反式异构体同时定量的问题，本发明提供了一种测定鸡蛋黄中斑蝥黄的固相萃取—高效液相色谱法。该方法用乙腈在超声波辅助下提取蛋黄中斑蝥黄，提取液经水稀释后首次直接上样至PRiME固相萃取柱净化，最后由Welch C

一种测定鸡蛋黄中斑蝥黄的固相萃取—高效液相色谱法， 5 g蛋黄用乙腈在超声波辅助下提取，提取液经水稀释后直接上样至PRiME HLB 固相萃取柱，先用5 mL乙腈水溶液，体积比1:1淋洗，再用3 mL 乙腈洗脱，洗脱液于50 ℃氮气吹干，最后由Welch C

所述的测定鸡蛋黄中斑蝥黄的固相萃取—高效液相色谱法，取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g，精确至0.001 g，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠和20 mL乙腈，用玻棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10 min，再以8 000 rpm离心10 min，将提取液收集至50 mL容量瓶中；沉淀用20 mL乙腈重复提取1次，合并提取液于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，备用；准确移取5 mL提取液至15 mL离心管中，再加入5mL水，超声混匀后过Oasis

本发明的有益效果：

本实验选用乙腈超声提取蛋黄中斑蝥黄，取部分提取液与水混合后直接上样至PRiMEHLB 固相萃取柱净化，固相萃取柱无需要常规的活化与平衡步骤，常压下实现洗脱，洗脱液浓缩后由RP-HPLC检测，该方较文献报道方法简便、更易于操作且回收率高，可实现对蛋黄中斑蝥黄顺反异构体的快速、准确定量。

附图说明

图1是全反式斑蝥黄的分子结构。

图2是斑蝥黄的9-顺式异构体结构。

图3是斑蝥黄标准溶液色谱图（1.0 µg/mL）。

图4是不同前处理的对斑蝥黄回收率的影响图。

图5 是六种色素的色谱图（Rt 6.418: 虾青素, Rt 9.653: 叶黄素, Rt 9.844:玉米黄质, Rt 11.764: 全反式斑蝥黄, Rt 13.519: β-阿朴-8'-胡萝卜素醛, Rt19.929: β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯）。

图6是空白鸡蛋黄添加斑蝥黄色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细的说明。

方法原理

用乙腈提取蛋黄中的斑蝥黄，提取液经过固相萃取柱净化后，斑蝥黄提取液经反相C

操作步骤

取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g（精确至0.001 g，置于50mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠和20 mL乙腈，用玻棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10min，再以8 000 rpm离心10 min，将提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀用20 mL乙腈重复提取、离心，合并提取液于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，备用。准确移取5 mL提取液至15 mL离心管中，再加入5 mL水，超声混匀后过上样至Oasis

仪器与试剂

斑蝥黄（纯度≥95.2%）购自德国LGC Labor GmbH公司。色谱级乙腈购自美国SigmaAldrich公司。Oasis PRiME HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL），购自美国Waters公司。分析纯乙腈、正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇、二氯甲烷和无水硫酸钠购自国药集团化学试剂有限公司。

（e2695，美国Waters公司）、超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）、纯水仪（Millipore，德国EMD Millipore公司）、电子分析天平（ME204E，瑞士MettlerToledo公司）、离心机（ST 40R，美国Thermo Scientific公司）、氮吹仪（N-EVAP 112，美国Organomation公司）。

新鲜白鸡蛋、红鸡蛋、五谷蛋和本鸡蛋采购自综合性大型超市。

实施例1 标准曲线的绘制

称取斑蝥黄62.5 mg（精确到0.000 1 g），用二氯甲烷溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混匀，配制成浓度为1250 μg/mL的斑蝥黄标准储备溶液。分装后至-20 ℃保存。准确移取1250 μg/mL的斑蝥黄标准储备溶液，用乙腈配制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 和10.0 μg/mL的标准工作溶液。现配现用。

实施例2样品的提取与净化

做3次平行实验。取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g（精确至0.001 g，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠和20 mL乙腈，用玻棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10 min，再以8 000 rpm离心10 min，将提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀用20 mL乙腈重复提取、离心，合并提取液于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，备用。准确移取5 mL提取液至15 mL离心管中，再加入5 mL水，超声混匀后过HLB固相萃取柱，向离心管中先后加入1 mL 乙腈和1 mL水，洗涤离心管，洗涤液一并过柱。用5 mL乙腈水溶液（体积比，1:1）淋洗固相萃取柱，最后用3 mL 乙腈洗脱，收集洗脱液于50 ℃氮气吹干，准确加入0.5 mL乙腈溶解残渣，以8 000 rpm离心5 min，取上清液上机测定。

实施例3样品中斑蝥黄的回收率实验

筛选不含斑蝥黄的鸡蛋—空白鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g（精确至0.001 g，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠，再向其中分别加入0.2 mL浓度分别为1.25 µg/mL、25.0 µg/mL和100.0 µg/mL的斑蝥黄标准溶液，使蛋黄中斑蝥黄添加水平为0.1 µg/g、1.0 µg/g和4.0 µg/g，按1.2步骤提取与净化，计算回收率及变异系数。结果见表1所示。在添加水平为0.1~4.0 µg/g 范围内，斑蝥黄回收率为85.9%~98.6%，相对标准偏差（RSD）为1.7％~8.0％。

实施例4样品中其他色素干扰性实验

制备虾青素、玉米黄质、叶黄素、斑蝥黄、β-阿朴-8'-胡萝卜素醛、β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯混合标准溶液，上机测定，以考察上述色素的色谱分离情况。

实施例5检测方法的应用

对所采购的白鸡蛋、红鸡蛋、五谷蛋和本鸡蛋采用实施例2步骤进行前处理并经过HPLC分析其斑蝥黄含量，结果见表2所示。

根据以上实施例1-5得到的结果与讨论：

标准曲线的绘制

按实施例1步骤进行处理，结果显示，斑蝥黄在0.1~10.0 μg/mL的浓度范围内，其标准曲线方程为y=173321x-9521，相关系数（

样品的前处理方法优化

分别考虑到蛋黄含有大量脂类物质，本实验首先开展了针对乙腈提取液的，使用正己烷分次萃取除脂，作为乙腈提取液进一步直接用固相萃取柱净化的对照：

做3次平行实验。取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g（精确至0.001 g，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠和20 mL乙腈，用玻棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10 min，再以8 000 rpm离心10 min，将提取液用20 mL乙腈饱和的正己烷萃取，收集乙腈相至50 mL容量瓶中。沉淀用20 mL乙腈重复提取，再用20 mL乙腈饱和的正己烷萃取，合并乙腈相于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，备用。准确移取5 mL提取液至10mL离心管中，50℃水浴氮吹浓缩至干，准确加入0.5 mL乙腈溶解残渣，以8 000 rpm离心5min，取上清液上机测定。

同时本实验考察了乙腈—乙酸乙酯、无水乙醇—二氯甲烷两个不同混合溶剂提取体系对蛋黄中斑蝥黄的提取效率，作为乙腈提取液的对照：

做3次平行实验。取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g（精确至0.001 g，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠和20 mL乙腈—乙酸乙酯（体积比，1:1）/无水乙醇—二氯甲烷（体积比，1:1），用玻棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10 min，再以8 000 rpm离心10 min，将提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀用20 mL相应的提取液重复提取1次，合并提取液于容量瓶中，用相应的提取溶剂定容至刻度，摇匀，备用。准确移取5 mL提取液至10 mL离心管中，50℃水浴氮吹浓缩至干，加入3 mL 乙腈，超声15 秒，再加入3 mL水，超声混匀过PRiME HLB固相萃取柱，向离心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗涤离心管，洗涤液一并过柱。用5 mL乙腈水溶液（体积比，1:1）淋洗固相萃取柱，抽干淋洗液，用3mL乙腈洗脱，收集洗脱液于50 ℃氮气吹干，准确加入0.5 mL乙腈溶解残渣，以8 000 rpm离心5 min，取上清液上机测定。

乙腈由正己烷脱脂和乙腈—乙酸乙酯、乙腈和无水乙醇—二氯甲烷3种提取溶剂提取再经固相萃取柱净化后回收率结果见图4所示。

通过比较针对乙腈提取液的两种脱脂方法——正己烷分次萃取除脂和固相萃取柱净化，以及乙腈、乙腈—乙酸乙酯、无水乙醇—二氯甲烷三个不同溶剂提取体系对蛋黄中斑蝥黄的提取效率发现：乙腈对蛋黄中的斑蝥黄具有很好的提取效率，采用正己烷分次萃取除脂，虽然成本低，但是有机溶剂消耗量大，正己烷在萃取除脂的过程中造成了部分斑蝥黄损失，导致斑蝥黄回收率偏低；从获得更浅的残渣颜色上推断乙腈—乙酸乙酯和无水乙醇—二氯甲烷提取体系对蛋黄中斑蝥黄提取完全，但萃取液中含有大量的脂类物质，造成了固相萃取柱堵塞，无法在固相萃取柱上实现进一步净化，基质明显影响了斑蝥黄的回收率。其次，斑蝥黄提取过程中未净化完全的基质杂质在色谱柱上吸附，不能被洗脱，造成了色谱柱柱效降低，同时造成了系统压力升高。

斑蝥黄具有脂溶性，具有很强的疏水性，而PRiME HLB 作为反相固相萃取吸附剂，对斑蝥黄具有很好的保留。整个净化过程，无需要活化和平衡，在常压下，实现了样品的净化。文献报道将斑蝥黄提取液经过C

乙腈作为斑蝥黄的提取溶剂，与水混匀后，直接过固相萃取柱，无需浓缩至干，避免了加热可能造成的斑蝥黄分解。

所以，本实施例选用乙腈超声提取蛋黄中斑蝥黄，取部分提取液与水混合后直接上样至PRiME HLB 固相萃取柱净化。

实施例4样品中其他色素干扰性实验

常用的畜禽着色剂如叶黄素、β-阿朴-8'-胡萝卜素醛、β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯常被饲料生产商和养殖场添加至饲料中，考察虾青素、玉米黄质、叶黄素、斑蝥黄、β-阿朴-8'-胡萝卜素醛、β-阿朴-8'-胡萝卜素酸乙酯混合标准溶液的色谱分离情况发现，在保留时间在11.7和12.7分钟左右，其他常见色素峰没有对斑蝥黄的顺反异构体峰产生干扰，表明该检测方法专一性好。（见图5）。

方法学考察结果

斑蝥黄在浓度0.1~10 µg/mL的范围内呈现良好线性关系良好，相关系数（

斑蝥黄的定量计算

斑蝥黄标准品主要成分为全反式异构体，含量达95%以上，其次还有部分顺式异构体。而对鸡蛋黄中斑蝥黄分析过程中发现，顺式斑蝥黄异构体约占15%。在对斑蝥黄定量时统计的是两种异构体的总量。

市售鸡蛋中斑蝥黄的测定

应用上述乙腈提取，固相萃取-高效液相色谱法对市场上新鲜商品鸡蛋黄中斑蝥黄进行检测的结果表明：所选购市售白鸡蛋、红鸡蛋、五谷蛋和本鸡蛋黄中斑蝥黄含量差异较大，从低于0.1 µg/g到高达8 µg/g不等。