一种用于阪崎肠杆菌O抗原血清型分型的环介导等温扩增检测方法

摘要

本发明涉及一种对阪崎肠杆菌O1‑O7血清型O抗原分型的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。本发明以阪崎肠杆菌O1‑O7的O抗原基因簇内的特异基因，即wzx和wzy为靶基因，设计并筛选了对阪崎肠杆菌O1‑O7的O抗原分型的各自四条引物，并建立了一种环介导等温扩增（LAMP）反应体系。为食品，特别是婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测和血清学分型提供了相应技术。利用本发明的LAMP体系检测阪崎肠杆菌，并且对其进行血清学分型，具有操作简便和快速高效的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及对样品中阪崎肠杆菌O1-O7血清型菌株O抗原分型的LAMP技术及其制备方法。本发明还设计利用所述的LAMP引物进行检测的方法。

背景技术

阪崎肠杆菌感染能引起非常严重的疾病，尤其是在早产儿中。具体为引起脑膜炎、脓毒症和致死性坏死性小肠结肠炎、败血症。疾病和预防控制中心估计阪崎肠杆菌感染病例的病死率高达40 %。据报道，受感染的新生儿和婴儿的病死率为50-80 %，其中20 %的幸存者发展为严重的神经障碍。在年龄较大的儿童中，阪崎肠杆菌可以在胃肠腔定殖，报告显示由此引起的病死率为10-55 %。该菌可从很多食品中分离出来，包括奶粉、干蔬菜和谷物粉，但最常见于婴儿配方奶粉。

2017年6月27日，国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理局发布的食品安全国家标准（GB4789.40-2016）中采用食品微生物学的检测方法对阪崎肠杆菌进行生化鉴定，该方法经济实惠，但是缺点在于实验过程较复杂，耗时较长（约5-6天）；2011年7月1日中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局实施的出入境检验检疫行业标（SN/T2754.15-2011）中采用环介导恒温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）检测方法对出口食品中的阪崎肠杆菌进行检测，但该标准只对阪崎肠杆菌检测至种水平，并未进行血清型检测，难以满足对于食源性疾病病原体溯源的需求。

环介导恒温扩增（LAMP）技术原理为：60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。

扩增分两个阶段：第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的F1区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板，形成DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮的扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成。周而复始，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

该方法具有快速简便的优点，能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本较低。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了一种对样品中阪崎肠杆菌O1-O7血清型O抗原分型的LAMP引物，该引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。

LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因 3'端的F3c、F2c和Flc区以及 5'端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。

Primer) Inner FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因 5'端的Flc区域序列相同。

F3引物：上游外部引物Primer) Outer (Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。

BIP引物：下游内部引物Primer) Inner (Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因 3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因 5'端的Blc区域序列相同.

B3引物：下游外部引物Primer) Outer (Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。

其主要特征在于上述LAMP引物是在阪崎肠杆菌O1-O2型、O4-O6的wzy基因，以及O3型、O7型的wzx基因中分别选取的4个DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:28所示。

本发明还提供了一种环介导等温扩增（LAMP）反应体系，组成成分如下：

本发明进一步公开了上述环介导等温扩增（LAMP）反应体系在用于检测阪崎肠杆菌菌株O抗原血清型方面的应用，所述的阪崎肠杆菌菌株指的是分离于该菌所处的婴儿配方奶粉中的该细菌的纯培养物或核酸DNA粗提液。实验结果显示，该反应体系可以实现对于全部7个O抗原血清型阪崎肠杆菌至少一种的检测（图1-图7）。

本发明主要提供了利用环介导等温扩增（LAMP）方法，对婴儿配方奶粉中的常见致病菌-阪崎肠杆菌全部O抗原血清型进行检测的技术手段。其积极效果在于：

（1）首次公开了利用环介导等温扩增（LAMP）方法，对阪崎肠杆菌全部O抗原血清型进行检测的技术手段，对于该菌的临床检测和流行病学监控提供了有效方法。

（2）操作简便，无需昂贵反应设备，在普通水域环境中即可完成反应。

（3）检测时间短：利用该技术手段，自获得基因组DNA粗提液后，可在约1.5小时内完成检测。

附图说明

图1 阪崎肠杆菌O1 LAMP反应特异性检测：在阪崎肠杆菌基因组样品O1的LAMP体系中分别加入阪崎肠杆菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7的基因组，除O1基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明阪崎肠杆菌O1的LAMP引物特异性良好；

图2 阪崎肠杆菌O2 LAMP反应特异性检测：在阪崎肠杆菌基因组样品O2的LAMP体系中分别加入阪崎肠杆菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7的基因组，除O2基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明阪崎肠杆菌O2的LAMP引物特异性良好；

图3阪崎肠杆菌O3 LAMP反应特异性检测：在阪崎肠杆菌基因组样品O3的LAMP体系中分别加入阪崎肠杆菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7的基因组，除O3基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明阪崎肠杆菌O3的LAMP引物特异性良好；

图4 阪崎肠杆菌O4 LAMP反应特异性检测：在阪崎肠杆菌基因组样品O4的LAMP体系中分别加入阪崎肠杆菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7的基因组，除O4基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明阪崎肠杆菌O4的LAMP引物特异性良好；

图5 阪崎肠杆菌O5 LAMP反应特异性检测：在阪崎肠杆菌基因组样品O5的LAMP体系中分别加入阪崎肠杆菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7的基因组，除O5基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明阪崎肠杆菌O5的LAMP引物特异性良好；

图6 阪崎肠杆菌O6 LAMP反应特异性检测：在阪崎肠杆菌基因组样品O6的LAMP体系中分别加入阪崎肠杆菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7的基因组，除O6基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明阪崎肠杆菌O6的LAMP引物特异性良好；

图7 阪崎肠杆菌O7 LAMP反应特异性检测：在阪崎肠杆菌基因组样品O7的LAMP体系中分别加入阪崎肠杆菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7的基因组，除O7基因组外，电泳检测均无扩增条带出现，说明阪崎肠杆菌O7的LAMP引物特异性良好。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

引物的设计

1、特异基因的筛选

O抗原加工基因wzy，wzx，wzm和wzt具有高度血清型决定性，因此已被广泛用作许多革兰氏阴性细菌分子血清分型的靶基因。本发明以阪崎肠杆菌O1-O2型、O4-O6的wzy基因，以及O3、O7型的wzx基因为靶基因。

本发明通过对基因簇中所有的基因进行all_vs_all_blast的方法，进行比对，特异基因的匹配数必然会远小于保守基因。综合上述方法找到特异基因并对其设计引物。

2、引物的设计

以挑选出来的1种阪崎肠杆菌的特异基因为模板设计 LAMP 的引物。

使用 Inner FIP(Forward：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因 5'端的Flc区域序列相同；F3引物：上游外部引物Primer) Outer (Forward，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补；BIP引物：下游内部引物) Primer Inner (Backward，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因 3'端的B2c区域互补，B1C域与靶基因 5'端的Blc区域序列相同；B3引物：下游外部引物) Primer Outer(Backward，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。每种引物的数量和序列信息列于下表中。 http://primerexplorer.jp/e/ 根据加工 wzx和wzy 基因的序列设计 LAMP引物。Primer)

B3、F3引物长度约为20 nt，Tm在55-60℃之间；BIP、FIP引物长度约为50 nt。引物由GENEWIZ（中国天津）合成。

LAMP 所用到的引物

实施例2

样本核酸的提取

1、针对获得的纯培养细菌，采用以下方式进行处理：

（1）挑取细菌单菌落至10 µL去离子水中，或过夜培养的细菌菌液10 µL，沸水浴中处理15 min。

（2）置于冰上1 min后，8000 rpm离心1 min。

（3）取3 µL 上清液作为下一步LAMP反应的模板。

2、取婴儿配方奶粉10g，采用以下方式进行处理：

（1）将样品置于20 mL LB培养基中，37度震荡培养3 h。

（2）取1 mL（1）中的培养物，8000 rpm离心5min，弃去上清。

（3）加入 500µL去离子水，重悬混匀，8000 rpm离心5min，弃去上清。

（4）加入100µL去离子水，沸水浴中处理15 min。

（5）置于冰上1 min后，8000 rpm离心1 min。

（6）取3 µL 上清液作为下一步LAMP反应的模板。

实施例3

LAMP反应

以实施例2提取的核酸溶液作为反应的模板，分别加入O1-O7每个LAMP反应体系，至于水浴锅中，按如下条件进行反应。

实施例4

琼脂糖凝胶电泳检测

从实施例3的O1-O7的每个反应体系中，吸取2μL反应产物，进行琼脂糖（2%）凝胶电泳，电压120v，电泳时间20min。后至于紫外灯下观察。

实验结果显示，该反应体系可以实现对于全部7个O抗原血清型阪崎肠杆菌至少一种的检测（图1-图7）。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

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