环介导等温核酸扩增(LAMP)技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究

摘要

2002年国际食品微生物标准化委员会(ICMSF)把阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌。婴儿配方奶粉是其最主要的传播途径，而且婴儿配方奶粉中微量的阪崎肠杆菌污染(<3CFU/100g)也能导致感染的发生，因此检测阪崎肠杆菌的方法是否灵敏、特异及快速至关重要。
　　 目前对阪崎肠杆菌的检测方法主要有FDA推荐的传统检测方法，免疫学方法和PCR方法。传统检测方法操作繁琐，检测时间长，而且灵敏度较低；免疫学方法的特异性和灵敏度也不理想；PCR方法敏感、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程，而使其难以在基层普及和推广。采用环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）技术，检测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌，灵敏度高，特异性强，检测方法简便，耗时短而且检测成本低，能够在基层普及和推广。
　　 针对阪崎肠杆菌（ATCC29544）GenBank中（基因号AY702093）16S-23S rRNA的保守序列，运用在线引物设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP引物。对反应时间、反应温度、镁离子浓度等扩增条件进行优化，确定25 μL的 LAMP反应体系为：内引物（FIP和BIP）各1.2 μM，外引物（F3和B3）各0.2 μM，环引物（LF和LB）各0.6 μM,2.5 mM dNTP，1.6 M甜菜碱,4 mM MgSO4，10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液,8U的Bst DNA聚合酶大片段,3 μL DNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。LAMP反应过程是首先在64℃水浴锅中反应20min，然后将其放入80℃水浴锅中，水浴10min终止反应，通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀，即可判断是否发生了LAMP反应。
　　 为了比较LAMP检测阪崎肠杆菌灵敏度和人工污染检出限，以 PCR方法作对照。PCR反应的引物是改良LAMP的两条外引物（F3和B3）。结果表明，改良LAMP检测阪崎肠杆菌的检出限为0.101CFU/mL，人工污染阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉的检出限为1.100CFU/g。采用试剂盒提取DNA，从样品处理到报告结果，耗时1h。对照PCR耗时3h，检测阪崎肠杆菌的检出限为101CFU/mL，人工污染阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉的检出限为1100CFU/g。改良LAMP的灵敏度是PCR的1000倍。
　　 对普通LAMP和改良LAMP以及改良LAMP自身加环引物和未加环引物进行了检测阪崎肠杆菌纯培养和人工污染检出限的比较，结果表明，改良LAMP的灵敏度是普通LAMP和未加环引物改良LAMP的10倍。
　　 初步研究了6种模板制备方法对LAMP检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的影响。研究表明LAMP方法对制备模板DNA的要求不高。通过对实际样品进行检测，将本方法与行业标准SN/T1632.1-2005方法进行比较，确定LAMP方法敏感性为100％，特异性为98.15％，符合率为98.25％。
　　 研究表明LAMP，将成为可以替代PCR的核酸扩增新技术，为快速检测食源性致病菌构建了一个技术平台。

目录

文摘

英文文摘

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1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

附录A

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