一种基于Y型探针组的等温指数扩增方法及其应用

摘要

本发明提供一种基于Y型探针组的等温指数扩增方法及其应用。所述等温指数扩增方法包括如下步骤：将Y型探针组、靶标核酸、切刻内切酶和聚合酶混合，所述Y型探针组的主探针和辅助探针与靶标核酸互补配对后，引发所述切刻内切酶和聚合酶辅助的等温链置换扩增反应，得到游离的单链核酸，同时所述单链核酸作为引物继续引发扩增反应，实现等温指数扩增。所述方法能够快速、简单高效地扩增出目标核酸序列，且特异性较高。将其用于检测新型冠状病毒时，能够提高检测的效率和准确度。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种基于Y型探针组的等温指数扩增方法及其应用，尤其涉及一种基于Y型探针组的等温指数扩增方法在检测新型冠状病毒中的应用。

背景技术

传统的病毒检测方法主要是病毒培养分离法和免疫学检测法。病毒培养分离法周期长，不适合大量标本的检测鉴定；免疫学检测法其主要原理是基于传统血清学诊断，难以实现对潜伏期或发病初期的准确判断，难以实现在一次反应中同时对多种病毒进行分型和鉴定。

二代测序技术对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的发现和研究，包括分类，溯源，蛋白研究，疫苗开发等起着非常重要的作用。但是在临床病人诊断中并没有大量用到二代测序技术，其主要原因为测序所需要时间相对更长，操作复杂，价格昂贵，不适用于大规模的快速筛查使用。荧光定量PCR技术是目前SARS-CoV-2最重要的检测手段，该技术具有良好的敏感性和特异性，但是现在临床应用多为单重病毒检测，实时荧光定量PCR反应中引物越多，不稳定因素也相应地增加，检测的重复性和灵敏性就会降低，同时检测需要昂贵的PCR仪辅助，限制了其广泛应用。基因芯片可实现高通量、多基因、多靶点检测，但该技术操作复杂，耗时长，检测费用高，需要配备昂贵的仪器，限制了该技术的进一步临床推广应用。

近年新发展的核酸等温检测技术，在实际操作方面较PCR技术更为简单方便，摆脱了对精密设备的依赖。近年来已有多种等温扩增技术应用于病原体的检测，如环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，滚环扩增技术，重组酶聚合酶扩增技术，等温链置换扩增技术，SHERLOCK(Specific High Sensitivity EnzymaticReporter UnLOCKing)，等温指数扩增技术(isothermal exponential ampliflcationreaction，EXPAR)。其中，EXPAR为通过联用切刻内切酶和DNA聚合酶建立的一种能够以指数形式扩增寡核苷酸片段的恒温扩增技术。这些技术无需复杂的循环升降温步骤和复杂的温控设备，可实现便携式的快速检测。但是普遍存在特异性较差，容易出现非特异扩增从而导致假阳性结果的问题，这是限制等温检测技术广泛临床应用的一个瓶颈。

Y型交联探针是Y型探针组与靶标核酸序列杂交后形成的一种特殊的Y型核酸交联体结构。当Y型探针组的两条探针共存时，由于互补碱基数较少而不能杂交在一起，但当第三条单链核酸(靶标核酸)存在时，三条单链彼此相互杂交形成稳定的Y型结构。例如，CN104531697A中公开了利用Y型交联探针进行扩增的方法，但是其扩增速度仍然较为有限。

因此，提供一种能够快速高效地扩增目标核酸序列、特异性较好且不受仪器设备限制的核酸扩增方法，对新型冠状病毒等病原体的核酸检测具有较为重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于Y型探针组的等温指数扩增方法及其应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于Y型探针组的等温指数扩增方法，包括如下步骤：

将Y型探针组、靶标核酸、切刻内切酶和聚合酶混合，所述Y型探针组的主探针和辅助探针与靶标核酸互补配对后，引发所述切刻内切酶和聚合酶辅助的等温链置换扩增反应，得到游离的单链核酸，同时所述单链核酸作为引物继续引发扩增反应，实现等温指数扩增。

本发明中，当Y型探针组的两条探针共存时，由于互补碱基数较少而不能杂交在一起，但当第三条单链核酸(靶标核酸)存在时，三条单链彼此相互杂交形成稳定的Y型结构，从而引发PB的3′端发生切刻酶辅助的等温链置换扩增反应，扩增出单链核酸并被切刻酶切割和聚合酶扩增置换下来，该序列与靶标核酸序列相同，可继续作为引物不断去引发下一轮扩增，实现EXPAR指数扩增，得到大量的单链核酸(即靶标核酸)。

本发明将Y型交联探针的设计理念引入简单高效的等温指数扩增技术中，可提高常规等温指数扩增技术的特异性，减少非特异扩增信号的产生，同时酶切位点位于Y型长链探针，不和靶基因结合，避免了等温指数扩增设计时对靶基因序列上特定酶切位点的要求。

作为本发明优选的技术方案，所述Y型探针组的主探针与辅助探针的3′末端互补配对的核苷酸个数为2～5个，例如可以是2个、3个、4个或5个。

优选地，所述与辅助探针的3′末端互补配对的核苷酸为主探针自5′端起的第10～20个核苷酸。例如，辅助探针的3′端上有4个碱基与主探针的第16～19个碱基互补配对、辅助探针的3′端上有3个碱基与主探针的第17～19个碱基互补配对、辅助探针的3′端上有4个碱基与主探针的第17～20个碱基互补配对、辅助探针的3′端上有2个碱基与主探针的第19～20个碱基互补配对、辅助探针的3′端上有4个碱基与主探针的第17～20个碱基互补配对。

Y型结构的两条探针与靶标核酸的互补碱基序列(10-15nt之间)短于常规等温扩增技术的引物或者探针(一般大于20nt)，这种结构的优势在于对单核苷酸变异有更好的区分能力，从而具有更好的特异性。

优选地，所述主探针的3′末端修饰有磷酸基团，在3′末端修饰磷酸基团能够防止非特异性的扩增。

优选地，所述辅助探针扩增延伸后形成的长链上包括切刻内切酶的酶切位点。

第二方面，如第一方面所述的等温指数扩增方法在核酸扩增和/或核酸检测中的应用。优选地，所述核酸检测包括检测新型冠状病毒的核酸。

第三方面，利用如第一方面所述的等温指数扩增方法检测新型冠状病毒的试剂盒。

本发明中，所述试剂盒中包括Y型探针组、切刻内切酶、聚合酶、dNTPs和纳米金核酸生物传感器。

Y型探针组探针是本发明中影响SARS-CoV-2检测的特异性和灵敏度的最重要因素。决定探针优异与否的主要因素有探针的长度和探针的位置，探针的长度越长，发生非特异杂交反应的可能性就越大，随着探针碱基数目的减少，检测灵敏度也相应降低。

在选择探针的长度时要综合考虑检测的特异性和灵敏度，探针的设计还遵循以下原则：

(1)所设计的探针在不同型别病毒间特异，在每个型别的不同毒株间保守。设计出的探针进行Blast分析，确保其只对靶基因特异性结合，和其它物种无交叉；

(2)稳定的二级结构(二聚体或发夹)是降低引物探针利用效率的重要因素，影响检测灵敏度。采用DNA Star软件对探针的结构进行分析，通常应控制dG≥-1.0；其中，dG是一个用于衡量裂解二聚体或发夹所需要能量的参数，二级结构越稳定，裂解所需的能量越多，dG越小。

优选地，所述Y型探针组的主探针和辅助探针的3′末端互补配对的核苷酸个数为4个。

优选地，所述Y型探针组的主探针上10～15nt(例如可以是10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt)的核苷酸与新型冠状病毒的核酸序列互补配对，所述Y型探针组的辅助探针上10～15nt(例如可以是10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt)的核苷酸与新型冠状病毒的核酸序列互补配对。

优选地，所述Y型探针组的主探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述Y型探针组的辅助探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，SEQ ID NO.1的序列为：

GTAATGCGGGGTAACAGACTCCGATCGTAATGCGGGGT(5′-3′)；

SEQ ID NO.2的序列为：GGTCCACCAAAATCG(5′-3′)。

作为本发明优选的技术方案，所述纳米金核酸生物传感器包括顺次相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。

优选地，所述结合垫上包被纳米金颗粒，所述纳米金颗粒偶联链霉亲和素和核酸分子I，所述核酸分子I与目标核酸序列互补配对。

优选地，所述硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线。

优选地，所述检测线包被核酸分子II，所述核酸分子II与目标核酸序列互补配对，且配对区与核酸分子I的配对区不同。

优选地，所述质控线包被核酸分子III，所述核酸分子III与核酸分子I互补配对。

第四方面，如第一方面所述的检测新型冠状病毒的试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将所述试剂盒中的Y型探针组、切刻内切酶、dNTPs、聚合酶与待测样本混合；

(2)所述Y型探针组的主探针和辅助探针与待测样本中的新型冠状病毒的核酸序列互补配对后，引发所述切刻内切酶和聚合酶辅助的等温链置换扩增反应，得到游离的单链核酸，同时所述单链核酸作为引物继续引发扩增反应，实现等温指数扩增得到扩增产物；

(3)使用纳米金核酸生物传感器检测步骤(2)中的扩增产物，得到检测结果。

本发明中，将扩增得到的产物以纳米金核酸生物传感器进行检测，其中纳米金颗粒(gold nanoparticles，AuNP)由于其呈鲜艳的红色，性质稳定，使得该方法具有较快的检测速度，且不需其它任何仪器设备的辅助。

作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中所述等温指数扩增的温度为50～65℃，例如可以是50℃、52℃、54℃、55℃、56℃、58℃、60℃、62℃或65℃等，优选为60℃。

在等温扩增反应中，反应温度是影响检测灵敏度与特异性的另一个重要因素，除了考虑酶的活性因素外，在较低温度下探针的非特异结合可以在没有目的核酸存在情况下引发扩增，而在较高温度下检测灵敏度会受影响，因此反应温度的选择十分重要。

优选地，所述等温指数扩增的时间为10～45min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min或45min等。

扩增产物会随反应时间的增加而增加，但超过合理的反应时间后，随着反应液中的扩增试剂的消耗和酶的催化效率降低，最终反应液中的荧光值到达平台期。

作为本发明优选的技术方案，所述使用方法包括如下步骤：

(1)将所述试剂盒中的Y型探针组、切刻内切酶、dNTPs、聚合酶与待测样本混合，其中，所述Y型探针组的主探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Y型探针组的辅助探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)所述Y型探针组的主探针和辅助探针与待测样本中的新型冠状病毒的核酸序列互补配对后，在所述切刻内切酶和聚合酶的作用下进行的等温链置换扩增反应，得到游离的单链核酸，同时所述单链核酸作为引物继续引发扩增反应，扩增的温度为50～65℃，时间为10～45min，实现等温指数扩增得到扩增产物；

(3)将步骤(2)中得到的扩增产物转移到纳米金层析试纸条上，得到检测结果。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供的基于Y型探针组的等温指数扩增方法，将Y型探针的设计理念引入简单高效的等温指数扩增技术中，可提高常规等温指数扩增技术的特异性，减少非特异扩增信号的产生，同时，将等温链置换扩增技术与纳米金层析生物传感器结合，实现了单核苷酸突变的检测，检测灵敏度较高；

(3)本发明提供的检测新型冠状病毒的试剂盒，在检测待测样本时，整个检测过程从开始扩增到出结果耗时较短，且不需要复杂昂贵的仪器辅助，对于新型冠状病毒的监测防控以及患者治疗有重要指导意义和实际应用价值。

附图说明

图1(a)为本发明中基于Y型探针组的等温指数扩增方法的原理示意图。其中，1-靶标核酸，2-主探针，3-辅助探针。

图1(b)为本发明中利用等温指数扩增方法扩增目标核酸后再使用纳米金层析生物传感器检测时的原理示意图。其中，1-靶标核酸，4-偶联核酸分子I和链霉亲和素的纳米金颗粒，5-核酸分子II，6-核酸分子III，7-纳米金层析生物传感器，8-检测线，9-质控线。

图2为实施例1～4中采用不同配对碱基数后得到的荧光强度柱状图。

图3为实施例1和实施例5～7中采用不同温度扩增得到的荧光强度柱状图。

图4为不同碱基数错配时得到的荧光强度柱状图。

图5为流感病毒和新型冠状病毒RNA检测结果图。

图6为不同拷贝数新型冠状病毒RNA检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

首先结合图1(a)和图1(b)对本发明中涉及到的作用原理进行简单描述，如图1(a)所示，本发明中所述的Y型探针组包括：一个长的扩增信号探针，即主探针2(记为probe A，PA，含切刻酶识别序列)和一个短的辅助探针3(记为probe B，PB)；

当靶标核酸1加入到反应体系中，PA和PB才能在靶标核酸的介导下两两互补配对，组装成“Y”型结构，并引发PB的3′端发生切刻酶辅助的等温链置换扩增反应，扩增出单链核酸并被切刻酶切割和聚合酶扩增置换下来，该序列与靶标核酸序列相同，可继续作为引物不断去引发下一轮扩增，实现EXPAR指数扩增，得到大量的靶标核酸1。

指数扩增反应完成后，将反应产物转移到纳米金生物传感器7的S孔(Sample孔)中，通过侧向层析作用流到金标垫上。反应液中靶标核酸与金标垫上的偶联核酸分子I和链霉亲和素的纳米金颗粒4互补杂交后，形成靶标核酸/核酸分子I/AuNP复合物；复合物继续流到检测线8(T线)，复合物与核酸分子II 5互补配对，在T线形成肉眼可见的红色条带，多余DNA1/AuNP复合物流过质控线9(C线)时，C线上包被核酸分子III 6，通过核酸分子I/核酸分子III互补配对，在C线形成肉眼可见的红色条带，检测结果可通过可视化窗口肉眼判读。

实施例1

本实施例提供一种新型冠状病毒的核酸检测方法。

首先从GenBank获取SARS-CoV-2病毒的核酸序列，用Clustalx1.8.msw Alignment软件进行序列同源性比对分析，按照本研究设计的Y型探针思路在靶基因保守区域进行探针设计。

设计好的长链探针在合成3′端用磷酸基团修饰，防止非特异扩增，设计出的探针具体信息见下表，其中主探针和辅助探针的配对碱基数为4个。

具体操作为：

在冰上配制反应体系，在NEB buffer中加入0.4units/μL切刻内切酶(N.BstNBI)，0.05units/μL Vent DNA聚合酶，400μM dNTPs，0.1μM PA和PB探针，在60℃下进行等温扩增。

经实验验证后发现，本实施例中所提供的Y型探针中，PA和PB在目标核酸不存在的情况下不发生自发的互补配对和杂交反应，只有在目标核酸序列介导下，PB的末端才会跟PA结合，从而引发链置换反应。

实施例2～4

与实施例1的区别在于，PA和PB末端配对个数分别为2(实施例2)，3(实施例3)和5(实施例4)，其余步骤与实施例1相同。

所用的序列分别为：SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5。

其中，SEQ ID NO.3的序列为：GGTCCACCAAAAT(5′-3′)；

SEQ ID NO.4的序列为：GGTCCACCAAAATC(5′-3′)；

SEQ ID NO.5的序列为：GGTCCACCAAAATCGG(5′-3′)。

实施例5～7

与实施例1的区别在于，在分别在50℃(实施例5)、55℃(实施例5)或65℃(实施例5)下进行等温扩增，其余步骤与实施例1相同。

实施例8

本实施例用于比较实施例1～7中提供的扩增方法。

由图2可知，用实施例1～4中的探针序列进行阴性样本检测，随着碱基配对数的增加，阴性样本检测反应液荧光值也随着增加，5个碱基的互补配对检测结果出现肉眼可见的假阳性结果，同时考虑到检测的灵敏度，选用4作为PA和PB结合的碱基数。

由图3可看出，实施例1和实施例5～7比较可知，检测的S/N值随着扩增效率增高逐渐增高。当反应温度继续升高到65℃后，检测的S/N值反而降低，其原因是随着温度的继续升高，扩增反应的酶活性受抑制，而且温度高PA/PB/T的结合更加困难，检测信号降低，从而使S/N值降低，因此60℃下本发明所提供的方法效率最高。

在最佳检测条件下，分别检测了目标核酸，单碱基错配，双碱基错配以及三碱基错配的核酸序列，图4可以看出，只有完全配对的目标核酸序列存在时，才会有扩增产物，说明该方法可以明显的区分单碱基错配的核酸序列，可显著降低了非特异扩增信号产生。

实施例9

本实施例用于制备纳米金层析生物传感器，具体包括步骤如下：

(1)采用柠檬酸三钠还原法制备纳米金

在500mL洁净的圆底烧瓶中加入300mL的超纯水，再加入1％的氯金酸溶液3mL，使氯金酸的终浓度为0.01％，边搅拌边加热至沸腾；

新鲜配制1％的柠檬酸三钠溶液，取不同体积(与氯金酸按照1:2，1:4，1:8的比例)加入到上述沸腾的氯金酸溶液中；

继续加热搅拌，保持溶液沸腾，溶液的颜色会从淡黄色转变为黑色再转变成酒红色；继续加热搅拌约7分钟，此时溶液变成均匀透亮的酒红色；

停止加热，但要继续搅拌，使金纳米颗粒逐渐冷却至室温，4℃保存备用；

制备好的金纳米颗粒用TEM电镜和紫外可见分光光度计进行扫描。

TEM下颗粒尺寸形貌均一，整个紫外可见吸收光谱没有杂峰，半峰宽窄，说明制备的金纳米颗粒粒径均匀，适合后续标记使用。

(2)链霉亲和素(SA)标记纳米金

取9个1.5mL试管，分别加入1mL纳米金；

每管加入1mL未浓缩的纳米金溶液，依次加入0.1M的K

每孔分别加入10μg的SA混合，室温下震荡5min；每孔分别加入100μL浓度为10％的NaCl溶液，混合均匀，室温下静置10min；观察纳米金颜色变化，记录保持砖红色的最低pH；

观察纳米金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持砖红色的为最佳标记pH；

确定好pH后，取1个1.5mL试管，加入1mL直径为15nm的纳米金溶液；加入上面确定的量0.1M的K

加入浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液10μL，室温下振荡混匀60min；加入100μL浓度为10％的BSA溶液，混合均匀,室温下静置60min；

将上述溶液在13400g离心30分钟，弃上清加入100μL重悬液(10％BSA，0.05％叠氮纳(NaN

(3)制备AuNP-SA-DNA1偶联物

向1mL的纳米金溶液中加入0.1M K

弃上清，用100μL硼酸缓冲液(0.2M，pH 9.0)重悬AuNP-SA偶联物，加入不同浓度的生物素修饰的DNA1，DNA1上的生物素和纳米金上的SA结合，从而将DNA1结合至纳米金表面。

(4)层析体系的建立与条件优化

样品垫，检测线和质控线的处理：裁剪所需大小的玻璃纤维，将其浸泡在样品垫处理液中(1％Triton，1％BSA，2％glucose，50mM boric acid，pH 8.0)10min后取出晾在塑料架上，37℃烘干。

将1mg链霉亲和素溶解于1mL的PBS(pH 7.4)中，使其终浓度为1.0mg/mL；裁剪所需大小的硝酸纤维素膜，并同时将吸水垫共同组装在底板上；

在划膜仪的检测线(T线)和质控线(C线)的划线速度均调为0.5μL/cm，各检测线以及质控线的距离为2.0mm。

实施例10

使用应用例9中制备的纳米金层析生物传感器检测实施例1中扩增得到的目标核酸序列。此外，本发明中以同样的方法构建了检测流感病毒核酸的纳米金层析生物传感器作为对照。

由图5可以看出，使用流感病毒核酸和SARS-CoV-2病毒的体外转录RNA进行检测，NC为流感病毒核酸，1～10为SARS-CoV-2病毒的体外转录RNA，可以看出本研究具有良好的特异性和重复性。

同时，由图6可以看出，本方法可以检测到每个反应中10个拷贝的RNA，具有极高的灵敏度，其中T/C为T线强度除以C线强度的百分比值。

综上所述，本发明提供的检测新型冠状病毒的试剂盒，不需要复杂昂贵的仪器辅助，能够检测到反应中10个拷贝的RNA，灵敏度较高；同时，将等温链置换扩增技术与纳米金层析生物传感器结合，实现了单核苷酸突变的检测，检测灵敏度较高。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 南方科技大学

<120> 一种基于Y型探针组的等温指数扩增方法及其应用

<130> 20201026

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

gtaatgcggg gtaacagact ccgatcgtaa tgcggggt 38

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

ggtccaccaa aatcg 15

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

ggtccaccaa aat 13

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

ggtccaccaa aatc 14

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

ggtccaccaa aatcgg 16