一种富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯的制备方法

摘要

本发明公开了一种富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯的制备方法，属于油脂深加工领域。本发明方法包括，取含有多不饱和脂肪酸的油脂、脂肪酶、乙醇和水于反应器中反应后，脱除非目标产物，得富含多不饱和脂肪酸的甘油酯；然后取得到的富含多不饱和脂肪酸的甘油酯、中链脂肪酸(C8‑12)和脂肪酶于反应器中反应，除去混合物中的中链脂肪酸，得到富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯。本发明与传统化学催化相比，酶法反应条件温和、副产物少、环保。相比直接酯化法，PUFA的损失更低，得率更高；相比酸解和酯酯交换，可以减少饱和和单不饱和脂肪酸的比例，使其更具药用和保健价值。

说明书

技术领域

本发明属于油脂深加工领域，具体涉及一种富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯的制备方法。

背景技术

多不饱和脂肪酸(PUFA)对人类机体具有重要的生物学意义，医学中已证实ARA、DHA和EPA能够显著地防治心血管疾病，抑制癌细胞的生长；此外，这些物质还具有促进婴幼儿感官器官的正常发育，以及预防、治疗老年痴呆症等功能，因此，被广泛地应用于健康食品中。

中长链甘油三酯(Medium-and long-chaintriglyceride,MLCT)是指甘油骨架上同时含有中链脂肪酸(MCFA，C8～12)和长链脂肪酸(LCFA)的结构脂。中碳链甘油三酯(MCT)与长碳链甘油三酯(LCT)相比，前者可以更快地被水解和被人体吸收。而MLCT同时含有MCFA和LCFA，可以实现脂肪酸的同步运输，使MCFA以一个更可控的水解速率释放到血液中，还能提高对LCFA的吸收，兼具MCT和LCT的优点。有研究表明，MLCT可以有效降低血脂和胆固醇水平，防治血栓等血管疾病。此外，MLCT水解产生的中链脂肪酸及其单甘油酯还具有很强的抑菌和抗病毒活性。另外，饱和脂肪酸的链长会影响其抗菌活性，碳链过长或过短都会导致活性降低。

市面上的PUFA产品主要有乙酯型、甘油酯型和游离脂肪酸型三种形式，据研究报道，乙酯型产品在人体中消化和吸收都较为困难，游离脂肪酸型储存稳定性差，甘油酯型兼具前两者的优点。但自然界中直接提取的甘油酯型的PUFA含量相对较低，已经有不少研究去富集高浓度的甘油酯型PUFA，其核心内容是将油脂中饱和或单不饱和脂肪酸通过酶法去掉或者替换成PUFA，从而提升油脂的价值。然而，目前研究制备得到的MLCT中的LCFA多为C14～18的饱和和单不饱和居多的脂肪酸，并偏向于婴幼儿配方中的MLCT的研究。主要通过长链大豆油或菜籽油与中链椰子油进行酯交换制备得到。目前对于制备富含PUFA的MLCT的研究报道还比较少，并且已经报道的研究成果中得到的MLCT会有较多多余但除不去的脂肪酸，例如饱和脂肪酸或者单不饱和脂肪酸等，影响其生物学价值。因此，本领域亟需一种符合绿色安全理念，并且可以有效的精准制备富含PUFA的MLCT的方法。

发明内容

鉴于上述和/或现有富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯的制备方法中存在的问题，提出了本发明。本发明提供了一种富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯的制备方法，本发明先利用脂肪酸特异性脂肪酶醇解掉油脂中饱和和单不饱和脂肪酸，得到高浓度的PUFA甘油酯；其次，将第一步水解得到的甘油酯产物与中链脂肪酸在脂肪酶催化下酯化成MLCT，产物中饱和和单不饱和脂肪酸的比例很低，使其更具药用和保健价值。

具体的，本发明的第一个目的是提供一种富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯的制备方法，所述方法包括，

(1)取含有多不饱和脂肪酸的油脂、脂肪酶、醇和水加入到反应器中，在20～50℃下反应一定的时间后，得混合物，将混合物中的脂肪酶、醇、脂肪酸酯和游离脂肪酸进行脱除，得到富含多不饱和脂肪酸的甘油酯；其中，步骤(1)中所述脂肪酶包括来源于南极假丝酵母Candida antarctica的Candida antarctica lipase A和来源于曲霉Aspergillussp.的NovozymET2.0中的一种或多种；

(2)取步骤(1)得到的富含多不饱和脂肪酸的甘油酯、中链脂肪酸和脂肪酶于反应器中反应一定的时间，除去混合物中的中链脂肪酸，即可得到富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯；其中，步骤(2)中所述脂肪酶包括来源于根霉菌Rhizomucormiehei的LipozymeRM IM、来源于南极假丝酵母Candida antarcticalipase B的Novozym435和Lipozyme 435、来源于嗜热丝孢菌Thermomyceslanuginosus的Lipozyme TL IM、来源于米曲霉Aspergillus oryzae的NS 40086中的一种或者多种。

作为富含多不饱和脂肪酸中长链甘油三酯的制备方法的一种优选方案，所述含有多不饱和脂肪酸的油脂包括含有二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA)中的一种或者多种的油脂。

作为富含多不饱和脂肪酸中长链甘油三酯的制备方法的一种优选方案，所述含有多不饱和脂肪酸的油脂优选为鱼肉或者藻油。

作为富含多不饱和脂肪酸中长链甘油三酯的制备方法的一种优选方案，所述中链脂肪酸为碳链长度为8～12的脂肪酸；优选包括辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸中的一种或者多种。

作为富含多不饱和脂肪酸中长链甘油三酯的制备方法的一种优选方案，所述醇包括甲醇、乙醇和异丁醇中的一种或者多种。

作为富含多不饱和脂肪酸中长链甘油三酯的制备方法的一种优选方案，步骤(1)中，所述乙醇和含有多不饱和脂肪酸的油脂的质量比0.1～30:1；所述水醇质量比为1％～250％。

作为富含多不饱和脂肪酸中长链甘油三酯的制备方法的一种优选方案，步骤(1)中，所述反应的时间为4～48h，所述脂肪酶添加量为100～10000U/g油脂。

作为富含多不饱和脂肪酸中长链甘油三酯的制备方法的一种优选方案，步骤(2)中，所述富含多不饱和脂肪酸的甘油酯和中链脂肪酸的质量比1:0.2～10。

作为富含多不饱和脂肪酸中长链甘油三酯的制备方法的一种优选方案，步骤(2)中，所述反应时间为6～72h，反应温度为30～70℃；所述脂肪酶为添加量为50～8000U/g甘油脂。

本发明的第二个目的是提供上述方法在油脂加工领域的应用。

本发明有益效果：

(1)本发明提供一种富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯的制备方法，脂肪酶两步催化法：先利用脂肪酸特异性脂肪酶醇解掉油脂中饱和和单不饱和脂肪酸，得到高浓度PUFA的甘油酯；其次，将第一步产物与中链脂肪酸在脂肪酶催化下酯化成MLCT。与传统化学催化相比，酶法反应条件温和、副产物少、环保。

(2)本发明第一步醇解选用的两种脂肪酶在醇解速度方面，具有PUFA“歧视性”，尤其是对ARA、EPA和DHA效果更佳显著；此处选用的脂肪酶对含有饱和脂肪酸和低不饱和脂肪酸甘油三酯的醇解速率远高于对含有多不饱和脂肪酸的甘油三酯的醇解速率，利用此特性通过适度醇解来除去饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，而一般的脂肪酶在醇溶液中蛋白会变性，使脂肪酶失去反应活性，

(3)本发明采用两步法制备得到富含多不饱和脂肪酸的中长链甘油三酯，相比一步直接酯化法，本发明制备得到的产品中PUFA的损失更低，得率更高，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量大大降低；此外，相比一步酸解和酯酯交换，本发明第二步可能会发生的酸解作用，进一步降低产物中的饱和和单不饱和脂肪酸，最终使得产物中的饱和和单不饱和脂肪酸含量低于9％，最低可降低至4％，使其更具药用和保健价值。

附图说明

图1为本发明实施例13中藻油反应前的甘油酯脂肪酸组成分析气相色谱图。

图2为本发明实施例13中藻油反应后的甘油酯脂肪酸组成分析气相色谱图。

图3为本发明实施例25中甘油酯和中链脂肪酸酯化后的甘油酯脂肪酸组成分析气相色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

检测方法：

(1)脂肪酸含量的测定方法

取50mg样品于10mL刻度管，加入2mL 0.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，65℃皂化30min，冷却后加入2mL 25％体积分数的三氟化硼-甲醇溶液，70℃水浴5min；加入2mL正己烷振荡3-4min提取脂肪酸甲酯，加入4mL饱和NaCl溶液，取上层溶液加入无水硫酸钠振荡(10000rpm离心5min)，注射器吸取过膜，利用气相色谱进行检测，其中，气相色谱检测的操作参数为：选用7890气相色谱仪，火焰离子化检测器(FID)；气相色谱柱为60m×0.32mm×2.5μm；氮气流速设定为1.0mL/min，进样器和检测器的温度设置为250℃。初始柱温保持在80℃下0.5min，然后以40℃/min的速率从80℃增加到165℃。以4℃/min的速率将柱温升高至230℃，并在230℃下保持4min。利用峰面积归一法计算脂肪酸含量。

本发明中脂肪酶Candida antarctica lipase A(6000LUN/g)、NovozymET2.0(1000LUN/g)、Novozym 435，(10000PLUN/g)、Lipozyme 435(10000UN/g)、NS 40086(275IUN/g)、Lipozyme RM IM(275IUN/g)、Lipozyme TL IM(250IUN/g)购自诺维信生物技术有限公司。AY"Amano"30SD，30000U/g，购自日本天野生物酶制剂有限公司。

本发明中所用油脂均为市售，其中鱼油中n-3PUFA含量为34.3％；藻油n-3PUFA含量为46.0％。其他试剂无特殊说明，均为市售。

实施例1

准确称取鱼油3.0g、无水乙醇1.5g、0.30g水和Candida antarctica lipase A脂肪酶1400U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温35℃，保持10h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的脂肪酸乙酯和游离脂肪酸，得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.3％提高到醇解后的56.6％，结果见表1。

实施例2～24的实验条件和结果见下表1，除了标注的条件外，其余操作参数和实施例1一致。

对比例1

准确称取鱼油3.0g、无水乙醇1.5g(醇油摩尔比48:1)、0.0.30g水和AY"Amano"30SD脂肪酶1400U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温35℃，保持10h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的脂肪酸乙酯和游离脂肪酸，得到富含n-3PUFAs的鱼油甘油酯。甘油酯产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs占比由原油的34.3％提高到醇解后的34.8％。

对比例2

同对比例1，但是改变反应体系中脂肪酶种类为Novozym 435，其余操作相同，所得甘油酯中n-3PUFAs含量如表1所示。

对比例3

同对比例1，但是改变反应体系中反应原料为藻油，其余操作相同，所得甘油酯中n-3PUFAs含量如表1所示。

对比例4

同对比例3，但是改变反应体系中脂肪酶种类为Novozym 435，其余操作相同，所得甘油酯中n-3PUFAs含量如表1所示。

实施例1～24和对比例1-4的反应条件和甘油酯产物中n-3PUFAs含量见表1。

表1实施例1～24和对比例1-4的反应条件和甘油酯中n-3PUFAs含量

通过表1可知，脂肪酶Candida antarctica lipase A和NovozymET2.0能够在乙醇中进行醇解葵油或鱼油，且使得甘油酯产物n-3PUFA得到了明显的富集，富集效果较醇解前达1.5倍以上。

实施例25

取实施例13得到的产物2g，加入癸酸(纯度≥99％)1.2g。再加入Lipozyme RM IM脂肪酶1000U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温40℃，保持12h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的游离脂肪酸，得到酯化产物，即富含n-3PUFAs的中长链甘油三酯。产品的脂肪酸组成中，n-3PUFAs含量为60.3％，中链脂肪酸含量为23.4％，饱和和单不饱和脂肪酸为4.7％。

实施例26

取实施例13得到的产物2g，加入辛酸(纯度≥99％)1.2g。再加入Novozym 435脂肪酶1000U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温40℃，保持12h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的游离脂肪酸，得到酯化产物，即富含n-3PUFAs的中长链甘油三酯。所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例27

同实施例25，但是改变反应体系中链脂肪酸为壬酸(纯度≥99％)，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例28

同实施例26，但是改变反应体系中链脂肪酸为月桂酸(纯度≥99％)，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例29

同实施例25，但是改变反应体系中脂肪酶为Lipozyme 435，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例30

同实施例25，但是改变反应体系中脂肪酶为Lipozyme TL IM，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例31

同实施例25，但是改变反应体系中脂肪酶为NS 40086，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例32

同实施例25，但是改变反应体系中中链脂肪酸质量为10g，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例33

同实施例25，但是改变反应体系中中链脂肪酸质量为0.6g，其余操作相同，所得甘油酯中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例34

取实施例13得到的产物2g，加入月桂酸(纯度≥99％)1.2g，。再加入Novozym 435脂肪酶1000U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温40℃，保持6h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的游离脂肪酸，得到富含n-3PUFAs的中长链甘油三酯。所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例35

同实施例34，但是改变反应体系中反应时间为48h，其余操作相同，所得甘油酯中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例36

取实施例13得到的产物2g，加入辛酸(纯度≥99％)1.2g，。再加入Lipozyme 435脂肪酶100U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温40℃，保持12h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的游离脂肪酸，得到富含n-3PUFAs的中长链甘油三酯。所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例37

同实施例36，但是改变反应体系中酶添加量为6000U，其余操作相同，所得甘油酯中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例38

同实施例25，但是改变反应体系中反应温度为25℃，其余操作相同，所得甘油酯中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例39

取实施例13得到的产物2g，加入辛酸(纯度≥99％)1.2g，。再加入Novozym 435脂肪酶1000U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温60℃，保持12h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的游离脂肪酸，得到富含n-3PUFAs的中长链甘油三酯。所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例40

取实施例1得到的产物2g，加入癸酸(纯度≥99％)1.2g，。再加入Lipozyme RM IM脂肪酶1000U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温40℃，保持12h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的游离脂肪酸，得到富含n-3PUFAs的中长链甘油三酯。所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例41

取实施例1得到的产物2g，加入辛酸(纯度≥99％)1.2g，。再加入Novozym 435脂肪酶1000U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温40℃，保持12h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的游离脂肪酸，得到富含n-3PUFAs的中长链甘油三酯。所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

对比例5

同实施例25，但是改变反应体系中脂肪酶为Candida antarctica lipase A，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

对比例6

同实施例25，但是改变反应体系中脂肪酶为AY"Amano"30SD，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

对比例7

取藻油2g，加入癸酸(纯度≥99％)1.2g。再加入Lipozyme RM IM脂肪酶1000U，加入到反应釜中，放入磁力转子，封口。将反应釜放在磁力搅拌器上，反应釜接入循环水，水温为恒温40℃，保持12h。反应结束后，分子蒸馏脱除混合物中的游离脂肪酸，得到中长链甘油三酯。所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

对比例8

同对比例7，但是改变反应体系中脂肪酶为Novozym 435，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

对比例9

同对比例7，但是改变反应体系中藻油为鱼油，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

对比例10

同对比例9，但是改变反应体系中脂肪酶为Novozym 435，其余操作相同，所得产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸含量如表2所示。

实施例25～41和对比例5～10的反应条件、产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸的含量见表2，其中实施例25～39和对比例5～6反应原料为实施例13的产物，实施例40～41反应原料为实施例1的产物。

表2实施例25～41和对比例5～10反应条件、产物中n-3PUFAs和中链脂肪酸的含量

其中，a表示产物中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的含量

通过表2的实施例25～41可知，本发明的两步法制备得到的中长链甘油三酯富含n-3PUFAs，且该酶解过程进一步提高了目标产物的含量，与一步酸解作用(对比例7～10)相比，本发明方法大大降低了产物中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的含量，提高了甘油三酯中PUFAs的含量，使得藻油非目标产物的含量降低至4.0％，远小于一步法的15.7％；鱼油非目标产物的含量降低至22.9％，远小于一步法的34.8％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。