肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物

摘要

本发明涉及一种肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其包含由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽、所述多肽的化学修饰体或所述多肽的药学上允许的盐中的至少一种。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物。

背景技术

皮肤等的创伤(具体而言，切伤、擦伤、烧伤等急性创伤和褥疮等慢性创伤)的治愈过程，一般而言，分类为凝固止血期、炎症期、增殖期、组织重建期、成熟期这五个步骤。在增殖期中，成纤维细胞和毛细血管侵润创伤部位，会促进成纤维细胞的增殖和胶原纤维的生成。其结果是，在增殖期中，在创伤部位形成了肉芽组织。

在增殖期中所形成的肉芽组织在之后的组织重建期和成熟期中不久就会进行退缩，最终被治愈组织取代。但是，已知在增殖期中肉芽组织过度形成等在创伤的治愈过程中出现异常的情况下，形成肥厚性瘢痕(包括瘢痕疙瘩)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：小川令等“创伤治愈中的物理刺激的作用及其分子机理－机械生物学(Mechanobiology)和机械疗法(Mechanotherapy)－”，创伤，5(3)：102－107，2014

发明内容

发明所要解决的问题

出于皮肤的美观的观点或生活的质量(QOL：quality of life)的观点，研究了抑制肥厚性瘢痕的形成的方法。然而，对于上述的肉芽组织的形成，尚未充分掌握其机理。在以往的技术中，作为抑制肥厚性瘢痕的形成的方法，停留在创伤部位的静养、固定以及压迫等进行物理上的处置的已知方法(例如，创伤，5(3)：102－107，2014(非专利文献1))。因此，期望开发用于抑制肥厚性瘢痕的形成的组合物等。

本发明是鉴于上述状况而完成的，其目的在于，提供一种用于抑制肥厚性瘢痕的形成的组合物。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现具有特定的排列的多肽有效地抑制肥厚性瘢痕的形成，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。

[1]一种肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其包含由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种。

[2]根据[1]所述的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其用于抑制容易受到机械应力的影响的部位中的肥厚性瘢痕的形成。

[3]根据[2]所述的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其中，上述容易受到机械应力的影响的部位包括选自由腹部、胸部、上臂部、脸部以及软组织构成的组中的至少一个。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其中，上述多肽包含由2～20氨基酸残基的氨基酸序列构成的寡肽。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其中，上述多肽包含由Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的氨基酸序列构成的二肽。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其中，上述多肽为源自天然的胶原蛋白的多肽、重组多肽或合成的多肽。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其为口服给药剂、补充剂、食品或饮料。

[8]根据[1]～[6]中任一项所述的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，其为经皮给药剂、局部给药剂、静脉给药剂或化妆品。

[9]一种抑制肥厚性瘢痕的形成的方法，其包括：将由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种的有效量给药至需要这些物质的对象。

[10]一种使用，其将由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种用于制造肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物。

[11]用于抑制肥厚性瘢痕的形成的、由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种。

发明效果

根据本发明，能提供一种用于抑制肥厚性瘢痕的形成的组合物。

附图说明

图1是表示在实施例中所使用的腹壁切创模型的小鼠的照片。

图2是表示创伤部位的组织变化的照片。

图3是表示将Pro－Hyp的二肽进行了腹腔内给药或口服给药后的小鼠中的该二肽在血液内浓度的经时变化的曲线图。

图4是表示对小鼠的给药日程的示意图。

图5是表示创伤部位的组织变化的照片。

图6是表示肉芽组织中的胶原蛋白的分布的照片。

图7是表示腹壁切创模型的小鼠中的创伤部位治愈后的腹部的照片。

图8是表示腹壁切创模型的小鼠中的从腹壁侧观察到的创伤部位的经时变化的照片。

图9是表示肉芽组织中的胶原蛋白的分布的照片。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式(以下，也记为“本实施方式”。)进行说明，但本发明并不限定于这些。在此，在本说明书中“A～B”这样的形式的记载是指范围的上限下限(即A以上且B以下)，在A中无单位的记载，而仅在B中记载有单位的情况下，A的单位与B的单位相同。

此外，“Pro”、“Hyp”以及“Gly”分别是指脯氨酸、4－羟基脯氨酸以及甘氨酸。

《肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物》

本实施方式的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物包含由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽(以下，有时简称为“多肽”。)、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种。

上述多肽在其氨基酸序列中包含Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列。因此，例如若将上述多肽进行经皮给药或口服给药，则所述多肽在体内被分解，生成由Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的氨基酸序列构成的二肽。并且，本发明人等认为，所生成的该二肽从血液中到达创伤部位，由此能抑制肥厚性瘢痕的形成。

在本实施方式中“肥厚性瘢痕”是指，由于在外伤后试图修复伤口(以下，有时记载为“创伤部位”。)而形成的纤维组织过度产生而形成的隆起状的疤痕。特别地将肥厚性瘢痕之中扩展至正常的皮肤的瘢痕称为“瘢痕疙瘩”。

在本实施方式中“肥厚性瘢痕的形成抑制”、“抑制肥厚性瘢痕的形成”是指，通过抑制创伤治愈过程的增殖期中的肉芽组织的过度增殖或胶原纤维的过度生成、促进创伤治愈过程的组织重建期和成熟期中的肉芽组织的退缩等来抑制肥厚性瘢痕的形成。在此，“创伤”是指，例如切伤、擦伤、烧伤等急性创伤或褥疮等慢性创伤等。

在本实施方式中“多肽”是指通过两个以上的氨基酸进行肽键结而形成的链状分子。在本实施方式中，将由2～20氨基酸残基的氨基酸序列构成的多肽称为“寡肽”。其中，将通过两个氨基酸进行肽键结而形成的寡肽称为“二肽”。将通过三个氨基酸进行肽键结而形成的寡肽称为“三肽”。

上述多肽在其氨基酸序列中具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列。上述多肽在其氨基酸序列中可以具有1～500个的Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列，也可以具有1～10个的Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列。

在本实施方式中，上述多肽优选包含由2～20氨基酸残基的氨基酸序列构成的寡肽，更优选包含由2～15氨基酸残基的氨基酸序列构成的寡肽。通过采用寡肽，例如在经皮给药或口服给药的情况下，会促进体内的分解和向体内的吸收，能高效地向创伤部位供给由Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的氨基酸序列构成的二肽。作为上述寡肽，例如，可列举出由以下的氨基酸序列构成的寡肽。

Gly－Pro－Hyp－Gly－Pro－Hyp－Gly－Ala－Ser－Gly－Pro－Gln(序列编号1)

在本实施方式的另一方案中，上述多肽优选包含由Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的氨基酸序列构成的二肽，更优选包含由Pro－Hyp所表示的氨基酸序列构成的二肽。通过设为二肽，除了经皮给药、口服给药等以外，即使进行局部给药也能高效地向创伤部位供给该二肽。

此外，就上述多肽而言，获取方法、制造方法没有特别限制，但例如可以为源自天然的胶原蛋白的多肽、重组多肽(recombinant polypeptide)或合成的多肽。

作为“天然的胶原蛋白”，例如，可列举出：源自牛、猪等哺乳动物、鸟类等的胶原蛋白；源自鲨鱼、鲷鱼、罗非鱼等鱼类的胶原蛋白；等。它们可以从上述哺乳动物、鸟类的骨、皮、腱等部分；上述鱼类的骨、皮、鳞部分等的结缔组织中得到。具体而言，对上述骨、皮、鳞等实施脱脂处理、脱钙处理或提取处理等以往公知的处理即可。

作为“源自天然的胶原蛋白的多肽”，例如，可列举出通过利用酶处理等将天然的胶原蛋白进行水解而得到的多肽。作为上述酶处理中所使用的酶，例如，可列举出胶原酶、巯基蛋白酶(thiol protease)、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶(metallo protease)等。就上述的酶而言，可以将它们单独使用或组合使用多种。作为上述巯基蛋白酶，可列举出：源自植物的木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶；源自动物的组织蛋白酶、钙依赖性蛋白酶等。此外，作为上述丝氨酸蛋白酶，可列举出胰蛋白酶、组织蛋白酶D等。作为上述酸性蛋白酶，可列举出胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。需要说明的是，作为所使用的酶，若考虑到将得到的多肽用于医药或特定保健用食品等，则优选使用源自病原性微生物的酶以外的酶(例如，源自非病原性的微生物的酶)。作为成为上述酶的来源的非病原性的微生物，可列举出地衣芽孢杆菌(Bacillus Iicheniforms)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、链霉菌(Streptomyces)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。上述酶可以使用一种源自上述非病原性的微生物的酶，也可以组合使用多种源自上述非病原性的微生物的酶。酶处理的具体的方法使用以往已知的方法即可。

此外，也可以使用非核糖体型肽合成酶等来合成肽。

“重组多肽”是指，以大肠杆菌、酵母、培养细胞等作为宿主，使用基因重组技术而人工制作出的多肽。作为重组多肽的制造方法，使用以往已知的方法即可。具体而言，例如可列举出以下的方法。首先，将具有对目标多肽进行编码的碱基序列的载体和具有对进行氨基酸的羟基化的酶(例如，顺式－4－氢氧化L－脯氨酸酶)进行编码的碱基序列的载体导入至作为宿主的大肠杆菌，进行转化。通过将转化后的大肠杆菌在规定的培养基中培养，使该大肠杆菌合成目标多肽。

此外，也可以为如下那样的方法。首先，使用基因重组技术制作具有肽键形成酶的大肠杆菌，使该大肠杆菌合成该酶后，进行离析。通过使离析出的上述酶与氨基酸反应，合成具有目标氨基酸序列的多肽。在氨基酸的羟基化中，也可以采用以往技术即使用了顺式－4－氢氧化L－脯氨酸酶的方法。

“合成的多肽”是指，通过使作为原料的氨基酸依次键结而生成的多肽。作为由氨基酸的合成方法，例如，可列举出固相合成法和液相合成法。作为固相合成法，例如，可列举出Fmoc法、Boc法等。本实施方式的多肽可以通过任意方法合成。

例如，上述多肽可以通过将脯氨酸固定于载体聚苯乙烯，将芴基－甲氧基－羰基(fluorenyl－methoxy－carbonyl基)(Fmoc基)或叔丁氧羰基(tert－Butyl Oxy Carbonyl基)(Boc基)用作氨基的保护的公知的固相合成法来合成。即，通过将用氨基修饰了表面的直径0.1mm左右的聚苯乙烯高分子凝胶的珠(beads)用作固相、将二异丙基碳二亚胺(DIC)用作缩合剂的脱水反应，使利用Fmoc基保护了氨基的脯氨酸键结(肽键结)羟基脯氨酸。之后，用溶剂充分清洗上述固相，去除残留的羟基脯氨酸等。之后，通过将与固相键结的脯氨酸的保护基(脱保护)去除，能合成包含Pro－Hyp序列的二肽。接着，通过同样的方法，使该二肽的羟基脯氨酸残基中的氨基键结(肽键结)甘氨酸，由此能得到包含Pro－Hyp－Gly序列的三肽。如此，通过将氨基酸依次键结，能合成目标多肽。

在本实施方式中多肽的“化学修饰体”是指，对构成该多肽的氨基酸残基中的氨基、羧基或羟基进行化学修饰而得的多肽。经过化学修饰的多肽可以改变在水中的溶解性、等电点等。具体而言，对于羟基脯氨酸残基的羟基，可列举出O－乙酰化等化学修饰。对于甘氨酸残基的α－羧基，可列举出酯化、酰胺化等化学修饰。对于脯氨酸残基的α－氨基，可列举出多肽基化、琥珀酰化、马来酰化、乙酰化、脱氨基化、苯甲酰化、烷基磺酰化、烯丙基磺酰化、二硝基苯基化、三硝基苯基化、氨基甲酰化、苯基氨基甲酰化、巯基化等化学修饰。此外，通过进行亚乙基二胺化、精胺化等，也能使特定的肽成为碱性。

多肽的化学修饰的具体的方法和处理条件应用了通常的多肽的化学修饰技术。对于羟基脯氨酸残基的羟基的化学修饰，例如，O－乙酰化可以通过在水溶剂中或非水溶剂中使无水乙酸发挥作用等来进行。对于甘氨酸残基的α－羧基的化学修饰，例如，酯化可以通过在甲醇中的悬浮后通入干燥氯化氢气体等来进行。对于甘氨酸残基的α－羧基的化学修饰，酰胺化可以通过使碳二亚胺等发挥作用来进行。

在本实施方式中多肽的“药学上允许的盐”是指，具有药学上允许的、具有原始的多肽的所期望的药理活性(肥厚性瘢痕的形成抑制性)的盐。作为药学上允许的盐，例如，可列举出：盐酸盐、硫酸盐，磷酸盐以及氢溴酸盐等无机酸盐；乙酸盐、甲基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯基磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、富马酸盐以及马来酸盐等有机酸盐；钠盐、钾盐以及钙盐等无机碱基盐；三乙基铵盐等有机碱基盐等。按照常规方法，能将特定的肽制成药学上允许的盐。

本实施方式中的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物包含上述多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种。即，上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物可以包含单一的上述多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐、以及构成该组合物的其他成分(例如，后述的赋形剂、粘合剂、溶剂等)。此外，上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物也可以包含上述多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐的多种。需要说明的是，在上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物包含多种上述多肽、其化学修饰体或其药学上允许的盐时，上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物还可以进一步包含上述的其他成分。

例如，上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物可以包含第一多肽、和第二多肽的化学修饰体。上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物也可以包含第一多肽、第二多肽的化学修饰体以及第三多肽的药学上允许的盐。此外，上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物也可以为包含多种多肽的多肽混合物。有时将作为上述多肽混合物的通过将胶原蛋白水解而得到的多肽混合物称为“胶原蛋白的水解物”。

上述多肽混合物可以使用被市售的物质。作为市售品，例如，可列举出新田明胶株式会社制的イクオスHDL－50SP(商品名)、SCP－5200(商品名)、コラペプJB(商品名)以及イクオスHDL－12SP(商品名)、TYPE－S(商品名)、コラペプPU(商品名)等，但不限定于此。

就上述多肽混合物而言，其重均分子量优选为130～7000，更优选为150～6500。上述重均分子量例如可以通过凝胶过滤色谱法来求出。

具体而言，可以在以下的条件下进行通过凝胶过滤色谱法实现的测定来求出重均分子量。

移动相：含0.1％三氟乙酸的45％乙腈(55％水)固定相：TSK－Gel－2000SWXL色谱柱(TOSOH制)

流速：1.0ml/min

色谱柱温度：40℃

分析时间：15分钟

进样量：10μl

检测波长：214nm

上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物优选用于抑制容易受到机械应力(mechanical stress)的影响的部位中的肥厚性瘢痕的形成。在此，“机械应力”是指，在皮肤、软组织等中，以自然的状态产生的物理上的力。作为该物理上的力，例如，可列举出压力、张力、剪切应力、流体静压、渗透压等。在此，“软组织”是指，除了骨骼以外的支承组织，例如，可列举出腱、韧带、筋膜、脂肪组织、血管、肌肉等(例如，横纹肌、平滑肌)。

作为容易受到上述的机械应力的影响的部位，优选在皮肤或软组织中容易产生伸缩的部位。

在本实施方式中，容易受到机械应力的影响的部位优选包含选自由腹部、胸部、上臂部、脸部以及软组织构成的组中的至少一个。

在此，以腹部的创伤为例子，对容易受到机械应力的影响的部位中的创伤治愈的过程进行说明。由于对腹部施加了张力等机械应力，因此若在腹部形成有创伤时，创伤部位因张力而扩展。为了治愈因张力等机械应力的影响而扩展的创伤部位，以下方面变得重要：(1)通过肉芽组织填补创伤部位和(2)使因机械应力的影响而扩展的创伤部位抵抗该机械应力而收缩。在这样的情况下，通常，首先肉芽组织增殖，覆盖创伤部位。接着，产生创伤部位的收缩和伴随于此的肉芽组织的退缩，最终创伤得到治愈。此时，若肉芽组织的增殖变得过度，则组织重建期和成熟期中的肉芽组织的退缩不充分进行而形成肥厚性瘢痕。

以往，作为抑制肥厚性瘢痕的形成的方法，仅已知创伤部位的静养、固定以及压迫等进行物理上的处置的方法。但是，若使用本实施方式的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物，则作为有效成分的上述二肽等首先促进因机械应力的影响而扩展的创伤部位的收缩。其结果是，覆盖创伤部位的肉芽组织的量少即可，因此结果上抑制了肉芽组织的增殖。最终，本发明人等认为在组织重建期和成熟期中肉芽组织的退缩充分进行而肥厚性瘢痕的形成得到抑制。

上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物也可以为口服给药剂、补充剂(supplement)、食品或饮料。

作为口服给药剂的剂型，例如，可列举出锭剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、粉剂、液剂。

作为用于口服给药剂的医药载体，例如，可列举出赋形剂(结晶性纤维素、乳糖、砂糖、玉米淀粉、磷酸钾、山梨糖醇、甘氨酸等)、粘合剂(糖浆、阿拉伯树胶、山梨糖醇、黄芪胶、聚乙烯基吡咯烷酮等)、润滑剂(硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅等)、崩解剂(马铃薯淀粉等)以及湿润剂(月桂基硫酸钠等)等惯用的载体。

作为补充剂，例如，可列举出锭剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、粉剂、液剂。

作为食品，例如，可列举出：糖果、口香糖、压片点心以及零食(snack)等糖果糕点类；冰激凌和冰冻果子露(sherbet)等冷冻甜食类；糯米和速食米饭等米饭类；乌冬面、拉面以及意面等面类；即食汤和浓汤等汤类。此外，该食品也可以为特定保健用食品。

作为饮料，例如，可列举出水果饮料、茶系饮料、咖啡饮料、清凉饮料水、乳饮料、乳酸菌饮料、碳酸饮料、营养饮料等。

在本实施方式中的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物为口服给药剂、补充剂、食品或饮料的情况下，上述多肽的含有比例以肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物的整体为基准优选为0.0001～100质量％，更优选为0.001～80质量％。在用于口服摄取用补充剂的情况下，上述多肽的含有比例在锭剂中优选0.001～80质量％，在颗粒剂中优选0.001～80质量％，在胶囊剂中优选0.1～30质量％，在散剂和粉剂中优选0.001～100质量％，在液剂中优选0.1～30质量％。此外，在用于食品的情况下，上述多肽的含有比例在糖果和口香糖中优选0.001～30质量％，在压片点心中优选为0.001～80质量％，在零食类、冷冻甜食类以及米饭类中优选0.0001～30质量％，在面类中优选0.0001～20质量％，在汤类中优选0.0001～50质量％。而且，在用于饮料的情况下，上述多肽的含有比例在水果饮料、茶系饮料、咖啡饮料、清凉饮料水、乳饮料、乳酸菌饮料以及营养补给饮料中优选0.0001～50质量％。

此外，上述肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物也可以为经皮给药剂、局部给药剂、静脉给药剂或化妆品。

作为经皮给药剂或局部给药剂的剂型，例如，可列举出乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、液剂、涂布剂、乳剂、喷雾剂、滴剂、贴合剂、敷(dressing)剂、注射剂等。上述经皮给药剂可以根据需要添加适当的赋形剂。赋形剂只要是通常用于医药品、医疗用设备、医药部外品等的物质就不限定种类。作为赋形剂，例如，可列举出聚乙烯醇、甘油、壳聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、聚丙二醇等。

作为静脉给药剂的剂型，例如，可列举出注射剂、点滴剂等。就注射剂和点滴剂而言，包括溶液、悬浮液、乳浊液以及必要时溶解或悬浮于溶剂而使用的固体药剂。上述静脉给药剂可以使上述多肽溶解、悬浮或乳化于溶剂而使用。作为溶剂，例如，可列举出：注射用蒸馏水；生理盐水；植物油；丙二醇、聚乙二醇、乙醇这样的醇类等；以及它们的组合。而且，上述静脉给药剂还可以包含稳定剂、溶解辅助剂(谷氨酸、天冬酰胺酸、聚山梨酸酯80(注册商标)等)、悬浮化剂、乳化剂、无痛化剂、缓冲剂、保存剂等。

作为化妆品，例如，可列举出化妆水、乳液、美容液、面膜(pack)、粉底(foundation)等。

在本实施方式中的肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物为经皮给药剂、局部给药剂、静脉给药剂或化妆品的情况下，上述多肽的含有比例以肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物的整体为基准优选为0.000001～100质量％，更优选为0.001～20质量％。在经皮给药或局部给药的情况下，上述多肽的含有比例在乳膏剂、凝胶剂以及软膏剂中优选0.0001～10质量％，在液剂、乳剂、喷射剂以及贴合剂中优选0.0001～20质量％，在敷剂中优选0.01～5质量％，在注射剂中优选0.0001～0.5质量％。此外，在静脉给药的情况下，上述多肽的含有比例在注射剂和点滴剂中优选0.0001～0.5质量％。在用于化妆品的情况下，上述多肽的含有比例在化妆水和乳液中优选0.0001～5质量％，在美容液和面膜中优选0.0001～100质量％，在粉底等化妆商品中优选0.000001～1质量％。

《抑制肥厚性瘢痕的形成的方法》

本实施方式的抑制肥厚性瘢痕的形成的方法包括：将由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种的有效量给药至需要这些物质的对象。

在此，“有效量”是指，用于抑制肥厚性瘢痕的形成所需要的上述多肽、上述多肽的化学修饰体以及上述多肽的药学上允许的盐的合计量。

作为上述对象，例如，可列举出小鼠、大鼠、兔、猫、狗、牛、马、猴以及人等哺乳动物。上述对象优选为人。

上述多肽的给药途径例如可列举出口服给药、经皮给药、局部给药、静脉给药、腹腔内给药等。

上述多肽的给药量根据对象的年龄、性别、体重、感受性差异、给药方法、给药间隔、有效成分的种类、制剂的种类等而不同。在将上述多肽进行口服给药的情况下，该给药量例如成人每天优选为0.01～50000mg/kg，更优选为1～500mg/kg。

此外，在上述多肽为由Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的氨基酸序列构成的二肽且使用其他给药单位的情况下，基于口服给药的给药量例如成人每天可以为0.0001～70000μmol/kg，也可以为0.01～700μmol/kg。

在将上述多肽进行经皮给药、局部给药、静脉给药或腹腔内给药的情况下，该给药量例如成人每天优选为0.01～150mg/kg，更优选为1～15mg/kg。

此外，在上述多肽为由Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的氨基酸序列构成的二肽且使用其他给药单元的情况下，基于经皮给药、局部给药、静脉给药或腹腔内给药的给药量例如成人每天可以为0.01～6000μmol/kg，也可以为1～60μmol/kg。

上述多肽的给药的频率没有特别限制，但例如可以为一周一次，也可以为三天一次，也可以为一天一次。

本实施方式的抑制肥厚性瘢痕的形成的方法可以与将上述多肽等的有效量向对象进行给药一起实施其他处置。作为该其他处置，可列举出创伤部位的缝合、创伤部位的压迫、湿润疗法等。

《其他实施方案》

作为本实施方式的另一方案，可列举出：一种使用，其将由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种用于制造肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物。

作为本实施方式的再一方案，可列举出：用于抑制肥厚性瘢痕的形成的、由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽、上述多肽的化学修饰体或上述多肽的药学上允许的盐中的至少一种。

实施例

以下，示出实施例对本发明进一步进行详细地说明，但本发明不受这些实施例限定。

《使用了腹壁正中切开模型(模型－1)的小鼠的实验》

＜模型－1的小鼠的制作＞

使用了8－10周龄的雌性C57 BL/6N小鼠。对每一只小鼠将200μL(0.065mg/体重1g)的麻醉药戊巴比妥钠(Somnopentil)(Shering－Plough制)给药至腹腔内。接着，使用手术用剪刀将小鼠腹部的皮肤正中切开1.5cm(创伤部位的形成)。在此，该腹部为容易发生皮肤的伸缩的部位，为容易受到机械应力的影响的部位。切开后为了解除皮肤的张力，将切开后的皮肤(以下，有时称为“创伤部位”。)的距上端0.25cm的部分和距下端0.25cm的部分缝合(图1的上侧)。之后，用3M公司制的Tegaterm(テガターム，商品名，商标)将皮肤覆盖外包，进一步为了防止创伤部位的自伤，装接了短裤型的硅保护装置。使用这样制作出的模型－1的小鼠来进行以下的实验。

＜预备实验＞

(1)创伤部位的组织变化的观察

使用模型－1的小鼠，在创伤部位的形成后不进行任何给药，观察该创伤部位的组织变化。具体而言，分别在模型－1的小鼠(N＝4)形成创伤部位后第3、5、7以及10天使小鼠在麻醉下脱血死亡。摘出包含创伤部位的腹壁组织，使其伸展后，在5％甲醛溶液中浸渍一晩，由此进行固定。将固定后的组织按照常规方法用石蜡包埋后，利用切片机(microtome)制作出组织切片。之后，对制作出的组织切片实施了Masson三色染色(Masson trichromestain)。通过该染色，细胞质被染为红色，胶原蛋白纤维被染为蓝色。将染色后的组织切片在显微镜下进行了观察。在创伤部位的形成后第3天，创伤部位中的组织的结合不完全，不适合观察(未图示)。但是，在创伤部位的形成后第5天以后，表皮的接合、由肉芽组织进行的创伤部位中的组织的愈合得以进行(图2)。创伤部位的痊愈约为第2周以后，因此判断为创伤部位的组织变化(肉芽组织的变化)的观察在创伤部位的形成后第5、7、10天是适当的。

(2)Pro－Hyp的给药后的血液内转移

对未形成创伤部位的C57 BL/6N小鼠(8－10周龄，雌性)(各组N＝4)通过注射将由Pro－Hyp的氨基酸序列构成的二肽(以下，有时简记为“Pro－Hyp”。)的生理盐水溶液(500nmol/200μL)进行腹腔内给药(单次给药)，或使用探针将Pro－Hyp的生理盐水溶液(2500nmol/200μL)进行口服给药(单次给药)。给药后，经时地进行采血，通过LC－MS/MS法测定血液内所出现的Pro－Hyp。LC－MS/MS法的测定条件如下所述。

LC－MS/MS法的测定条件

用生理盐水将采取到的血液稀释2倍后，在20℃、500×g、15分钟的条件下进行离心分离。向进行了离心分离后所回收到的上清液中加入3倍量的100％乙醇。在20℃下以13000rpm对加入了100％乙醇的上述上清液进行15分钟离心分离，进行除蛋白质处理。接着，用50mM碳酸氢铵将进行了除蛋白质处理的试样稀释至10倍，供于LC－MS/MS分析。作为LC的条件，将CAPCELL PAK C1 UG120 10mm×I.D.2.0mm(OSAKA SODA)用作保护柱，使用Hypersil Gold PFP 150mm×I.D.2.1mm，5μm(Thermo制)的色谱柱进行了分析。分析条件为移动相A MeOH、移动相B 2mM含乙酸铵的2％甲酸水溶液、进样量5μL，梯度(gradient)如下述表1那样进行。

[表1]

作为MS/MS条件，使用串联式质量分析装置(TSQ Vantage：三重四极杆液质联用仪(Thermo制))，在如下条件下进行，离子化法：Positive ESI、喷雾电压：3000V、汽化器(vaporizer)：300℃、鞘气(sheath gas)：30、辅助气(Aux gas)：15、毛细管(Capillary)温度：250℃、MRM(multiple reaction monitoring：质谱多反应监测)条件：母离子质量(Parent Mass)229.1、子离子质量(Product Mass)70、碰撞能量(Collision Energy)：29ev，S－Lens：68。

将测定结果示于图3。根据图3的结果明显可知，腹腔内给药组和口服给药组均在给药后15分钟Pro－Hyp的血中浓度迎来峰值，但在从给药开始1小时后Pro－Hyp的血中浓度减少，在从给药开始3小时后Pro－Hyp的血中浓度减少至基线水平。此外，就腹腔内给药而言，进行血中转移而不借助消化管吸收，因此达到了非常高的浓度。另一方面，就口服给药而言，虽然血中转移量与腹腔内给药相比较少，但是显示出确实进行血中转移。根据该结果推测出：不仅腹腔内给药，通过口服给药也借助循环血液而二肽向创伤部位转移。在该实验中，虽然使用了未形成创伤部位的C57 BL/6N小鼠，但可认为：在由同系统的小鼠制作出的模型－1的小鼠和模型－2的小鼠中也会得到同样的结果。

＜肥厚性瘢痕的形成抑制试验＞

(1)创伤部位中的肉芽组织的经过观察

将Pro－Hyp的生理盐水水溶液(500nmol/200μL)或不包含Pro－Hyp的生理盐水给药至形成有创伤部位的模型－1的小鼠(各组N＝5)的腹腔内。包括手术日(形成创伤部位日，第0天)在内，对每一只小鼠进行7天每天一次给药200μL各溶液(图4)。分别在创伤部位的形成后第5、7以及10天使小鼠在麻醉下脱血死亡。摘出包含创伤部位的腹壁组织，使其伸展。之后，在5％甲醛溶液中浸渍一晚，由此进行固定。将固定后的组织按照常规方法用石蜡包埋后，利用切片制作出组织切片。之后，对制作出的组织切片实施了Masson三色染色。通过该染色，细胞质被染为红色，胶原蛋白纤维被染为蓝色。将染色后的组织切片在显微镜下进行了观察。

将结果示于图5。当到达创伤部位的形成后第5天时，表皮的治愈大致完成，但腹腔侧的治愈尚在进行中。整体而言，在对照组(生理盐水给药组、比较例)中，创伤部位的肉芽组织大(图5的椭圆所示的部分)，成为创伤部位的离开的指标的腹直肌间的距离(图5的粗线的长度)宽。另一方面，在Pro-Hyp给药组(实施例)中，肉芽组织小，腹直肌间的距离变短。根据该结果显示出：通过给药Pro-Hyp，抑制了创伤部位中的肉芽组织的增殖。

(2)腹直肌间的距离的计测

根据Masson三色染色像，根据病理学的观点，将伴随治愈的腹直肌间的背离部作为腹直肌间的距离并使用图像分析软件(商品名：BZ-analyzer：Keyence公司制)进行计测。将结果示于表2。表2中的腹直肌间的距离表示以各组5只小鼠所求出的平均值。腹直肌间的距离(例如图5)在对照组中，经过实验期间未发生大的变动。另一方面，Pro-Hyp给药组中的腹直肌间的距离随着时间缩短，创伤部位的形成后第7天、第10天相对于对照组均确认有显著的差异。

[表2]

*p＜0.05、**p＜0.01(student’s t-检验)

(3)肉芽组织的面积的计测

根据上述的Masson三色染色像，根据病理学的观点，使用图像解析软件(商品名：BZ-analyzer：Keyence公司制)对治愈过程中所形成的肉芽组织的面积进行计测。将结果示于表3。表3中的肉芽组织的面积表示以各组5只的小鼠所求出的平均值。对照组中的肉芽组织的面积在创伤部位的形成后第7天迎来峰值，之后减少，相对于此，在Pro-Hyp组中确认到肉芽组织的面积随着时间减少。Pro-Hyp组在创伤部位的形成后第7天、第10天相对于对照组确认有显著的差异。

[表3]

*p＜0.05、**p＜0.01(student’s t-检验)

(4)肉芽组织内的胶原蛋白的分布

使用按照上述(1)所记载的方法而制作出的组织切片，实施利用天狼星红(Picro-Sirius Red)进行的染色。由此，能将肉芽组织内的胶原蛋白纤维染为红色。染色后，进行了组织切片中的肉芽组织的照片拍摄。将结果示于图6。

创伤部位的形成后第5天的初期的肉芽组织内的胶原蛋白细，呈细网纤维状分布，之后，随着时间经过而染色性变强，在创伤部位的形成后第10天形成了粗的胶原蛋白束。根据该结果显示出：随着创伤治愈的进行，成为肉芽组织内的细胞的锚定点(足場)的胶原蛋白纤维从脆弱且细的胶原蛋白(III型胶原蛋白)变化为粗且成熟后的胶原蛋白(I型胶原蛋白)。

(5)肉芽组织内的胶原蛋白的面积

使用图像处理软件(商品名：Image J，美国国立卫生研究所制)将天狼星红染色图像进行二值化。将被浓染至颜色阈值(≥150)的纤维性胶原蛋白作为成熟胶原蛋白(I型胶原蛋白)来测定其分布面积，以肉芽组织内的每单位面积的成熟胶原蛋白的分布面积的形式来计算出。将结果示于表4。表4中的胶原蛋白分布密度表示以各组5只的小鼠所求出的平均值。实验期间中，对照组的肉芽组织内的胶原蛋白密度未发生大的变动。另一方面，在Pro-Hyp组中确认到胶原蛋白分布密度随着时间增加，肉芽组织内的胶原蛋白的成熟在Pro-Hyp组中显著地进行。

[表4]

*p＜0.05(student’s t-检)

(6)Pro-Hyp给药后的通过目视进行的从腹壁侧观察到的创伤部位的观察

将Pro-Hyp给药后的通过目视得到的创伤部位的观察图像与对照组进行比较(图7)。对创伤部位的形成后10天后的小鼠进行了观察。在对照组中，切开后的组织修复部较粗地残留有曲折的白色调的肉芽(图7的左侧的照片中的箭头所示的部分)。另一方面，Pro-Hyp给药组显示出平滑的直线，实施了肉芽组织少的治疗方法(图7的右侧的照片中的箭头所示的部分)。即，显示出：通过给药由具有Pro-Hyp所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽(二肽)，能抑制肥厚性瘢痕的形成。

《使用了腹壁圆形切除模型(模型-2)的小鼠的实验》

<模型-2的小鼠的制作>

在腹壁正中切开模型(模型-1)中，在创伤部位中的皮肤组织和腹直肌组织中观察到肉芽组织的形成，有时难以区分源自哪个组织。在本实施例中，出于对形成于张力所施加的腹膜层的肉芽组织进行研究的目的，按以下的顺序制作出来自皮肤层的治愈反应的影响为最小限度且形成于受到肌肉的张力直接的影响的腹膜层间的肉芽组织形成的新型模型(模型-2)。使用8-10周龄的雌性C57 BL/6N小鼠。对每一只小鼠通过将200μL(0.065mg/体重1g)的麻醉药戊巴比妥钠(Shering－Plough制)进行腹腔内给药来导入麻醉。导入了麻醉后，使用手术用剪刀将腹部的皮肤正中切开1.5cm。在此，该腹部为容易发生皮肤的伸缩的部位，为容易受到机械应力的影响的部位。之后，用外径3mm的圆头镊子夹住提起腹壁中央部分，用弯头极小手术剪刀将腹壁中央部分的组织完全切除为圆形(图1的下侧)。切开后为了解除皮肤的张力，将切开后的皮肤(创伤部位)的距上端0.25cm的部分和距下端0.25cm的部分缝合。之后，用Tegaterm将皮肤覆盖外包，进一步为了防止创伤部位的自伤，装接了短裤型的硅保护装置。使用这样制作出的模型－2的小鼠来进行以下的实验。

＜创伤部位的收缩的评价实验＞

在模型－2的小鼠(各组N＝5)中，在腹壁形成了创伤部位(圆形缺损创伤)后，以与图4相同的给药时刻表进行7天的Pro－Hyp的生理盐水溶液(500nmol/200μL)的给药。此时，对对照组给药不包含二肽的生理盐水。包括手术日(形成创伤部位日，第0天)在内，对每一只小鼠进行7天每天一次腹腔内给药200μL各溶液(图4)。在对象组中同样地给药生理盐水200μL(图4)。将从形成创伤部位之日起第10天的从腹壁侧观察到的创伤部位进行比较。将结果示于图8。与对照组相比，在Pro－Hyp组中创伤部位缩小、大多成为平坦的，治愈得以进行。当测定残留的创伤部位的面积时，与对照组相比，创伤部位的收缩显著地得以进行(表5)。需要说明的是，表5中的创伤部位的面积表示以各组5只的小鼠所求出的平均值。

[表5]

*p＜0.05(student’s t-检验)

《使用了源自小鼠胎儿的皮肤成纤维细胞的实验》

<胶原蛋白凝胶的收缩程度的评价>

将成纤维细胞用胶原蛋白凝胶包埋培养，测定出胶原蛋白凝胶的收缩程度。使用包含10％FBS(牛胎儿血清；GIBCO制)的达尔伯克氏(Dulbecco)改良伊格尔(Eagle)培养基(D-MEM)(High-Glucose：高糖)(WAKO制)，在37℃、5％CO

[表6]

＜基于各种多肽给药的肉芽组织的形成＞

在本实验中，使用了腹壁圆形切除模型(模型－2)的小鼠。使用表7所记载的各种多肽的生理盐水溶液，进行7天一天一次腹腔内给药(图4)，对肉芽组织的形态进行比较。此外，胶原蛋白水解物所包含的多肽的重均分子量通过利用以下的条件进行的凝胶过滤色谱法来计算出。

(凝胶过滤色谱法的测定条件)

移动相：含0.1％三氟乙酸的45％乙腈(55％水)

固定相：TSK－Gel－2000SWXL色谱柱(TOSOH制)

流速：1.0ml/min

色谱柱温度：40℃

分析时间：15分钟

进样量：10μl

检测波长：214nm

对创伤部位的形成后第7天的创伤部位中的组织的薄切切片进行Masson三色染色，观察了肉芽组织。将结果示于图9。显示出：在对照组(生理盐水)中肉芽组织的形成轻微且胶原蛋白纤维的分布稀疏，相对于此，在Pro－Hyp、Hyp－Gly、各胶原蛋白水解物的给药组中，均胶原蛋白纤维密集且可能会作为组织进行成熟。即，通过该实验显示出：不仅是Pro－Hyp、Hyp－Gly等二肽，只要给药由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽，在因张力等机械应力而扩展的创伤部位中，借助成纤维细胞的胶原蛋白纤维的收缩被诱导，结果上促进了创伤部位的收缩。

[表7]

根据上述一系列的实验结果，显示出通过如下所述的机理来抑制肥厚性瘢痕的形成。

(1)首先，当给药由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽(例如，Pro－Hyp的二肽)时，在因机械应力(张力等)而扩展的创伤部位中，借助成纤维细胞的胶原蛋白纤维的收缩被诱导，结果上促进了创伤部位的收缩(表6和图9)。

(2)收缩的创伤部位可以通过少量的肉芽组织进行覆盖，因此结果上抑制了肉芽组织的增殖(图8)。

(3)其结果是，肉芽组织不过度增殖，最终，在修复过程中肉芽组织的退缩充分进行，肥厚性瘢痕的形成得到抑制(图7)。

以往认为，在创伤的治愈中，肉芽组织的增殖是必须的。但是，本发明人等首次发现，如果是能促进创伤部位的收缩的“质量被改善的肉芽组织”，则抑制肉芽组织的增殖(即，抑制肥厚性瘢痕的形成)，并且创伤的治愈得以进行。进而，本发明人等首次发现，为了改善肉芽组织的质量、抑制肥厚性瘢痕的形成，给药由具有Pro－Hyp或Hyp－Gly所表示的二肽序列的氨基酸序列构成的多肽(例如，Pro－Hyp的二肽)。本发明人等认为，通过使用该多肽来抑制肥厚性瘢痕的形成这样优异的效果在以往的技术常识中无法预测，并且为极其性质不同的效果。

如上所述对本发明的实施方式和实施例进行了说明，但从最初开始也预定将上述的各实施方式和各实施例的构成适当组合。

应该认为本次公开的实施方式和实施例在所有方面为例示，而不是限制性的。本发明的范围不是由上述的实施方式和实施例表示，而是由权利要求书表示，意图包括与权利要求书等同的意思和在范围内的所有变更。

SEQUENCE LISTING

<110> 学校法人福冈大学

新田明胶株式会社

<120> 肥厚性瘢痕的形成抑制用组合物

<130> 9190135WO01

<150> JP2018110374

<151> 2018-06-08

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胶原蛋白的部分肽

<400> 1

Gly Pro 4Hyp Gly Pro 4Hyp Gly Ala Ser Gly Pro Gln

1 5 10