草酸青霉突变株A2-13及其在制备生淀粉酶制剂与降解生淀粉中的应用

摘要

本发明公开了草酸青霉突变株A2‑13及其在制备生淀粉酶制剂与降解生淀粉中的应用。本发明提供了草酸青霉(Penicillium oxalicum)A2‑13，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2020319。本发明还提供了一种用草酸青霉A2‑13生产生淀粉酶或生淀粉酶制剂的方法，包括以下步骤：将上述的草酸青霉A2‑13在基本或优化的发酵培养基中培养一定时间，收集发酵产物，离心并收集上清液，得到生淀粉酶或生淀粉酶制剂。本发明的实验证明，本发明得到的草酸青霉A2‑13，可以生产生淀粉酶制剂，该制剂可以高效的水解生木薯淀粉和生玉米淀粉，并且水解终产物以葡萄糖为主。该制剂可以用于生产酒精。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株草酸青霉突变菌株A2-13，及其在制备生淀粉酶制剂与降解生淀粉中的应用。

背景技术

淀粉酶是商业酶市场上最主要的酶之一。根据作用方式的不同，主要分为α-淀粉酶(α-amylase)、糖化酶(glucoamylase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)和支链淀粉酶(starch debranching enzyme)。其中α-淀粉酶和糖化酶是淀粉加工的关键酶，α-淀粉酶随机切割淀粉分子链内部α-1,4-糖苷键，产生大量的低聚寡糖和少量麦芽糖和葡萄糖。糖化酶能水解α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键，从淀粉分子链非还原端依次释放葡萄糖。少数淀粉酶蛋白包含淀粉结合结构域(Starch-binding domain)，直接结合到生淀粉颗粒表面，促使淀粉酶在低于糊化温度以下对生淀粉进行水解，这类淀粉酶命名为生淀粉酶(Raw-starch-degrading enzymes；RSDEs)。自然界中，生淀粉酶主要产自曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)等。

生淀粉酶应用在淀粉加工产业中，减少了高温糊化和液化工序，节约成本，减少环境污染，具有广阔的应用前景。目前，微生物主要为青霉和曲霉的生淀粉酶尤其生淀粉糖化酶产量低，限制了其大规模的开发利用。

发明内容

本发明的目的是提供一株草酸青霉突变菌株A2-13，及其在制备生淀粉酶制剂与降解生淀粉中的应用。

第一方面，本发明要求保护一株草酸青霉突变菌株。

本发明所要求保护的草酸青霉突变菌株，具体为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)A2-13，该菌株是草酸青霉基因工程菌株OXPoxGA15A通过多轮常压常温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma；ARTP)和甲基磺酸乙酯(Ethyl methylsulfonate；EMS)随机诱变所获得的。

本发明所提供的草酸青霉突变株A2-13，已于2020年07月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020319。

第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明所要求保护的菌剂的活性成分为前文所述的草酸青霉A2-13。

上述菌剂可为下述1)或2)所述菌剂：

1)用于降解生淀粉的菌剂；

2)用于降解含生淀粉物质的菌剂。

第三方面，本发明要求保护用于培养前文所述的草酸青霉A2-13的培养基。

本发明要求保护的培养可由有机碳源与盐溶液组成。其中，所述有机碳源与所述盐溶液的配比为5g:100mL；所述盐溶液由水、KH

进一步地，所述有机碳源可为农业有机废弃物，具体可选自如下中的任一种或多种：麦麸、结晶纤维素、玉米芯、甘蔗渣、稻杆、生木薯粉等。

进一步地，所述氮源为硝酸铵、酵母提取物、硫酸铵、尿素、蛋白胨、硝酸钠、和/或豆饼粉。

进一步地，所述培养基的pH值可为3.5-5.5(如4.5-5.5)。

进一步地，所述农业有机废弃物颗粒大小可为0.25mm以下(含水量均在5％以下)。

在本发明的一个优选实施方式中，所述农业有机废弃物具体为麦麸和结晶纤维素，所述培养基中麦麸和结晶纤维素的质量配比具体为2：3。

在本发明的具体实施方式中，所述结晶纤维素具体为结晶纤维素Avicel。

在本发明的一个优选实施方式中，所述培养基的pH值具体为5.5。

第四方面，本发明要求保护下述任一产品：

P1)、利用前文所述的草酸青霉A2-13制备的用于降解生淀粉的产品；

P2)、利用前文所述的菌剂制备的用于降解生淀粉的产品；

P3)、利用前文所述的草酸青霉A2-13制备的生淀粉酶；

P4)、利用前文所述的菌剂制备的生淀粉酶。

在P1)中，所述降解生淀粉的产品的活性成分具体为前文所述的草酸青霉A2-13。在P2)中，所述降解生淀粉的产品的活性成分具体为前文所述的菌剂。

进一步地，P1)所述降解生淀粉的产品可为生淀粉酶单一制剂或者组合制剂。

所述生淀粉酶单一制剂可按照包括如下步骤的方法制备得到：用前文所述培养基在20-32℃(如24-32℃，具体如28℃)下培养前文所述的草酸青霉A2-13，收集发酵产物，得到生淀粉酶单一制剂。

在本发明的一个优选实施方式中，培养所述草酸青霉A2-13的时间具体为6天。

在本发明的一个优选实施方式中，将所述草酸青霉A2-13接种到所述培养基中的孢子初始浓度具体为1×10

进一步地，收集所述发酵产物后还包括如下步骤：将所述发酵产物离心后收集上清液，所述上清液即为所述生淀粉酶单一制剂。

所述组合制剂由所述生淀粉酶单一制剂和α-淀粉酶组成。

进一步地，所述生淀粉酶单一制剂和所述α-淀粉酶的酶活配比可为1:1。

第五方面，本发明要求保护下述M1)或M2)或M3)的方法：

M1)降解生淀粉或含生淀粉物质的方法，可包括：将前文所述生淀粉酶单一制剂或者所述组合制剂与生淀粉或含生淀粉物质在40℃下于pH为4.5的环境中进行反应来降解生淀粉。

进一步地，进行所述反应时，所述生淀粉酶单一制剂或者所述组合制剂的用量为50-200U/g底物(如50-150U/g底物或者50-100U/g底物或者100-150U/g底物)。所述底物为生淀粉或含生淀粉物质。

进一步地，进行所述反应的时间为48-72h(如60-72h)。

上述方法中，所述pH为4.5的环境中可为pH为4.5的Na

M2)前文所述生淀粉酶单一制剂的制备方法。

M3)培养前文所述的草酸青霉A2-13产生淀粉酶的方法，包括用前文所述培养基在20-32℃(如24-32℃，具体如28℃)下培养前文所述的草酸青霉A2-13。

第六方面，本发明要求保护下述X1)、X2)或X3)所示应用：

X1)前文所述的草酸青霉A2-13或前文所述菌剂在下述a1)-a6)任一中的应用：

a1)降解生淀粉或含生淀粉物质；

a2)制备用于降解生淀粉或含生淀粉物质；

a3)制备生淀粉酶；

a4)制备用于生产生淀粉酶的产品；

a5)生产葡萄糖、麦芽糖或乙醇；

a6)制备用于生产葡萄糖、麦芽糖或乙醇产品。

X2)前文所述培养基在上述a2)、a4)或a6)中的应用。

X3)前文所述产品在上述a1)-a6)任一中的应用。

在上述各方面中，所述含生淀粉物质可选自如下中任一种或多种：木薯、玉米、小麦、水稻，或这些物质的生粉。

在本发明的具体实施方式中，所述含生淀粉物质具体为生木薯粉或生玉米粉。

本发明的实验证明草酸青霉A2-13经液体发酵培养后，其发酵液具有生淀粉酶活力。其与商业α-淀粉酶一起使用可以高效水解生玉米粉和生木薯粉产生葡萄糖，在生淀粉的转化和利用中具有应用潜力。

本发明得到的草酸青霉A2-13，可以生产生淀粉酶制剂，该制剂可以高效地水解生玉米粉和生木薯粉。该制剂可以用于生产酒精。

保藏说明

分类命名：草酸青霉(Penicillium oxalicum)

菌株编号：A2-13

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心

保藏单位简称：CCTCC

保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，邮政编码：430072

保藏日期：2020年07月15日

保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 2020319

附图说明

图1为草酸青霉出发菌株OXPoxGA15A及诱变该菌株得到的各突变菌株在含生木薯粉的培养基平板上的水解圈。

图2为草酸青霉各菌株的生木薯淀粉酶产量。

图3为草酸青霉A2-13发酵培养基最适初始pH优化实验结果。

图4为草酸青霉A2-13最适培养温度优化实验结果。

图5为草酸青霉A2-13发酵培养基最佳碳源的优化实验结果。

图6为草酸青霉A2-13发酵培养基最佳组合碳源浓度的优化实验结果。

图7为草酸青霉A2-13发酵培养基最佳氮源的优化实验结果。

图8为草酸青霉A2-13发酵培养基最佳氮源硝酸铵的最佳浓度的优化实验结果。

图9为草酸青霉A2-13产生淀粉酶的接种孢子的最佳浓度的优化实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的麦麸、大豆饼粉、稻秆、玉米芯、甘蔗渣和生淀粉的含水量均在5％(质量百分含量)以下，这些物质的颗粒大小为0.25mm以下。

下述实施例中的生木薯粉为天然生木薯粉，制作步骤：在南宁市菜市场上买到的去皮生木薯片，放入60℃烘箱烘干；粉碎机粉碎，过80目筛网。

下面的葡萄糖标准曲线的绘制、生淀粉酶活力的测定均按照如下方法进行：

1、葡萄糖标准曲线的绘制

称取0.1g的恒重葡萄糖标准品，用去离子水配制浓度为1mg/mL的葡萄糖标准溶液。按表1的配方将各种试剂加入2mL离心管中，混匀，沸水浴10分钟显色后，取出样品冷却至室温。在12,000rpm条件下离心2分钟，吸取200μL上层溶液至96孔酶标板中，在540nm波长下测定其吸光值并绘制葡萄糖的标准曲线，得到的线性回归方程为Y＝3.3481X-0.0304，方差R

表1、葡萄糖标准曲线溶液的组分

表1中的缓冲液为pH为4.5的Na

2、生淀粉酶活力的测定

①取发酵体系，4℃离心，收集上清液，即为发酵上清。

②取发酵上清，用pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(即：0.2M Na

③向2mL离心管中加入450μL 1g/100mL生天然木薯粉溶液(溶剂为pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)，65℃预热10min；

④加入50μL待测酶液或50μL灭活酶液(阴性对照)，65℃静置反应30min，加入1mLDNS溶液终止反应，沸水煮10min，冷却至室温，12,000rpm离心10min收集上清液，然后吸取200μL至酶标板测定540nm波长处吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖浓度，一个酶活力单位(U)定义为在65℃、pH 4.5反应条件下，水解生天然木薯淀粉，每分钟产生1μmoL还原糖所需要的酶量。然后，根据稀释倍数换算得到发酵上清中的生木薯淀粉酶产量。

实施例1、草酸青霉A2-13的筛选

草酸青霉A2-13是从本申请的发明人实验室原有的真菌菌株中，经过多轮物理化学随机诱变后筛选得到产生淀粉酶活力更高的菌株。以草酸青霉(Penicillium oxalicum)基因工程菌株OXPoxGA15A(CCTCC NO：M 2017794；参见中国专利申请号CN201810816723.7)为出发菌株，采用3轮甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，EMS)诱变，得到了一株生淀粉酶活力较出发菌株OXPoxGA15A提高的突变株E3-16。再将E3-16进行常压常温等离子体(诱变，得到一株更高生淀粉酶活力的菌株A1-2。再将菌株A1-2进行ARTP和EMS复合诱变和筛选，最终得到突变株A2-13。

一、孢子悬浮液的制备

1、将PDA固体培养基121℃灭菌30min，制作PDA平板。

2、用0.1％(v/v)吐温80水溶液洗下在PDA平板上培养5天的草酸青霉OXPoxGA15A孢子，制备浓度为1×10

二、EMS诱变

将菌株OXPoxGA15A进行EMS诱变时，选择致死率为93.6％对应剂量下的孢子悬浮液，进行大规模分离与筛选，具体步骤为：

1、取PBS缓冲液悬浮的新鲜孢子5mL，孢子浓度为10

2、加入等体积1.2％EMS试剂，震荡混匀，置于28℃、180rpm摇床中8h。

3、取1mL诱变的孢子悬液于2mL EP管中，加入1mL 5％Na

4、将孢子液稀释10

5、28℃恒温培养8d，通过比较菌落水解圈与菌落直径比的大小，筛选突变菌株。

6、重复以上步骤3次。

7、获得突变菌株E3-16。

三、ARTP诱变

将菌株E3-16进行ARTP诱变时，选择致死率为95.1％对应剂量下的孢子悬浮液，进行大规模的突变株的分离与筛选，具体步骤为：

1、取5％甘油悬浮的新鲜孢子5mL，浓度10

2、取10μL孢子液均匀涂布于灭菌的载片表面。

3、将装有样品载片的培养皿放入ARTP诱变仪操作室内。设置仪器功率为130w，气量为10SLM，处理时间500s。用无菌的镊子将载片移至装有1mL无菌水的EP管中。

4、将EP管置于涡旋振荡仪上，震荡2min，制成新的孢子悬液。

5、将重悬的孢子液稀释10

6.28℃恒温培养8d，通过比较菌落水解圈与菌落直接比的大小，筛选突变菌株。

7.获得突变菌株A1-2。

四、ARTP-EMS复合诱变

选择ARTP-EMS组合处理菌株A1-2后致死率在90％以上的处理时间，按照上述方法进行EMS诱变，终止反应后，得到的孢子悬液用5％甘油重悬，按照上述方法进行ARTP诱变，得到的孢子液适当稀释后，进行大量涂板，28℃恒温培养8d，通过比较菌落水解圈与菌落直接比的大小，筛选突变菌株。

结果表明：通过3轮EMS诱变共分离到1616个单菌落(表2)。其中突变菌株E3-16的水解圈和菌落直径比最大，为1.75(图1)，继而对其进行ARTP诱变，分离得到1120个单菌落，通过比较菌落水解圈直径比的大小，得到突变菌株A1-2直径比为1.78(图1)。最后，对菌株A1-2进行ARTP-EMS复合诱变，分离得到796个单菌落，其中突变菌株A2-13的直径比最大，为2.0(图1)。

表2、高通量平板初筛所得到的诱变菌株及数量

将每轮诱变得到的生淀粉酶活力较高的突变体菌株接种于液体产酶培养基中，培养6d，测定其生木薯淀粉酶活力，如图2所示，每一轮诱变后得到的突变菌株的生木薯淀粉酶活力逐渐上升，其中A2-13最高，为162.7±1.44U/mL。

草酸青霉A2-13已于2020年07月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心登记入册编号：CCTCC NO:M 2020319。

实施例2、草酸青霉A2-13液体发酵产生淀粉酶条件的优化

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

一、孢子悬浮液的制备

1、将PDA固体培养基121℃灭菌30min，制作PDA平板。

2、用0.1％(v/v)吐温80水溶液洗下在PDA平板上培养5天的草酸青霉A2-13孢子，制备浓度为1×10

二、培养基初始pH的优化

1、配制不同pH的发酵培养基

配制基本培养基：基本培养基由麦麸、结晶纤维素Avicel(PH-101,Sigma-Aldrich#11365)与盐溶液组成。其中，麦麸、结晶纤维素Avicel与盐溶液的配比为4.0g:1.0g:100mL。盐溶液由水、KH

用5M HCl水溶液或NaOH水溶液调节基本培养基的pH，使其pH分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5和7.5，121℃高压灭菌30min，分别得到pH为2.5的培养基、pH为3.5的培养基、pH为4.5的培养基、pH为5.5的培养基、pH为6.5的培养基和pH为7.5的培养基。

2、发酵培养

将步骤一的孢子悬浮液按1％(v/v)分别接种至上述不同pH的培养基中，28℃，180rpm培养6天，得到发酵产物；离心(12,000rpm离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

3.酶活力测定

收集粗酶液，对不同pH的培养基得到的粗酶液分别进行生淀粉酶活力的测定。

结果见图3，草酸青霉A2-13的生淀粉酶活力的最适初始pH为5.5。

三、培养温度的优化

1、利用步骤二的pH为5.5的培养基优化培养温度。

2、将步骤一的孢子悬浮液按1％(v/v)接种至上述步骤二的pH为5.5的培养基中，分别置于不同温度(20、24、28、32和36℃)的恒温培养箱中180rpm培养6天，得到发酵产物；离心(12,000rpm离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

3、收集粗酶液，分别对不同温度下培养得到的粗酶液进行生淀粉酶活力的测定。

结果见图4，草酸青霉A2-13的生淀粉酶活力的最适温度为28℃。

四、培养基最佳碳源的确定

1、配制不同碳源的发酵培养基

不同碳源的培养基pH均为5.5，121℃高压灭菌30min，其中，麦麸加结晶纤维素培养基的各组分及含量与步骤二的基本培养基相同。麦麸加甘蔗渣培养基由麦麸加甘蔗渣与步骤二的盐溶液组成，其中，麦麸、甘蔗渣与盐溶液的配比为4.0g:1.0g:100mL。麦麸加生木薯粉培养基由麦麸加生木薯粉与步骤二的盐溶液组成，其中，麦麸、生木薯粉与盐溶液的配比为4.0g:1.0g:100mL。麦麸加豆饼粉培养基由麦麸加豆饼粉与步骤二的盐溶液组成，其中，麦麸、豆饼粉与盐溶液的配比为4.0g:1.0g:100mL。麦麸加稻秆培养基由麦麸加稻秆与步骤二的盐溶液组成，其中，麦麸、稻秆与盐溶液的配比为4.0g:1.0g:100mL。麦麸加玉米芯培养基由麦麸加玉米芯与步骤二的盐溶液组成，其中，麦麸、玉米芯与盐溶液的配比为4.0g:1.0g:100mL。

2、发酵培养

将步骤一的孢子悬浮液按1％(v/v)接种至上述步骤1的不同碳源的培养基中，置于28℃恒温培养箱中180rpm培养6天，得到发酵产物；离心(12,000rpm离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

3、收集粗酶液，分别对不同碳源培养基下培养得到的粗酶液进行生淀粉酶活力的测定。

结果见图5，麦麸加结晶纤维素Avicel是草酸青霉A2-13产生淀粉酶的最佳碳源。

五、培养基组合碳源最佳浓度的确定

1、配制各种碳源组合浓度的培养基：

不同麦麸和结晶纤维素Avicel质量比的培养基均由麦麸、结晶纤维素Avicel和步骤二的盐溶液组成，pH均为5.5，121℃高压灭菌30min。麦麸和结晶纤维素Avicel质量比设置如下：1:2,2:2,3:2,1:4,2:3,1:3,3:1,2:1,4:1。麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为1:2的培养基中麦麸、结晶纤维素Avicel和盐溶液的配比为麦麸1.7g:3.3g:100mL，麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为2:2的培养基中麦麸、结晶纤维素Avicel和盐溶液的配比为麦麸2.5g:2.5g:100mL，麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为3:2的培养基中麦麸、结晶纤维素Avicel和盐溶液的配比为麦麸3g:2g:100mL，麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为1:4的培养基中麦麸、结晶纤维素Avicel和盐溶液的配比为麦麸1g:4g:100mL，麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为2:3的培养基中麦麸、结晶纤维素Avicel和盐溶液的配比为麦麸2g:3g:100mL，麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为1:3的培养基中麦麸、结晶纤维素Avicel和盐溶液的配比为麦麸1.25g:3.75g:100mL，麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为3:1的培养基中麦麸、结晶纤维素Avicel和盐溶液的配比为麦麸3.75g:1.25g:100mL，麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为2:1的培养基中麦麸、稻秆和盐溶液的配比为麦麸3.3g:1.7g:100mL；麦麸和结晶纤维素Avicel质量比为4:1的培养基中麦麸、结晶纤维素Avicel和盐溶液的配比为麦麸4g:1g:100mL。

2、发酵培养

将步骤一的孢子悬浮液按1％(v/v)接种至上述步骤1的不同碳源组合浓度的培养基中，置于28℃恒温培养箱中180rpm培养6天，得到发酵产物；离心(12,000rpm离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

3、收集粗酶液，分别对不同碳源组合浓度培养基下培养得到的粗酶液进行生淀粉酶活力的测定。

结果见图6，麦麸与结晶纤维素Avicel质量比为2:3是草酸青霉A2-13产生淀粉酶的最佳组合碳源浓度。

六、培养基最佳氮源的确定

1、配制含不同氮源的培养基：

不同氮源的培养基pH均为5.5，121℃高压灭菌30min，其中，硫酸铵培养基中碳源为麦麸加结晶纤维素，质量比为2:3，盐溶液组分及含量与步骤二的基本培养基相同，作为对照培养基。尿素培养基为将硫酸铵培养基中的(NH

2、发酵培养

将步骤一的孢子悬浮液按1％(v/v)接种至上述步骤1的含不同氮源的培养基中，置于28℃恒温培养箱中180rpm培养6天，得到发酵产物；离心(12,000rpm离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

3、收集粗酶液，分别对不同氮源下培养得到的粗酶液进行生淀粉酶活力的测定。

结果图7表明，硝酸铵是草酸青霉A2-13产生淀粉酶的最佳氮源。

七、最佳氮源浓度的确定

1、配制不同浓度的氮源培养基：

不同浓度的氮源培养基其中，碳源为麦麸加结晶纤维素Avicel，质量比为2:3，盐溶液组分及含量与步骤二的基本培养基相同，氮源是硝酸铵，pH均为5.5，121℃高压灭菌30min。硝酸铵浓度设置为：1，2，3，4，5，6，7和8g/L。

2、发酵培养

将步骤一的孢子悬浮液按1％(v/v)分别接种至上述步骤1的不同浓度氮源的培养基中，28℃，180rpm培养6天，得到发酵产物；离心(12,000rpm离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

3、酶活力测定

收集粗酶液，对不同浓度氮源的培养基得到的粗酶液分别进行生淀粉酶活力的测定。

结果见图8，草酸青霉A2-13产生淀粉酶的最佳氮源硝酸铵的最佳浓度为5g/L。

八、最佳孢子接种浓度的确定

1、配制不同浓度的孢子悬浮液

将步骤一所得的孢子制成浓度为1×10

2、发酵培养

将上述所配制的不同浓度的孢子悬浮液按1％(v/v)分别接种至100mL步骤七所得最佳培养基中，28℃，180rpm培养6天，得到发酵产物；离心(12,000rpm离心15min)，收集上清液，该上清液即为粗酶液。

3.酶活力测定

收集粗酶液，对不同孢子接种浓度得到的粗酶液分别进行生淀粉酶活力的测定。

结果见图9，草酸青霉A2-13产生淀粉酶的孢子接种的最佳浓度为1×10

实施例3、利用草酸青霉A2-13制备生淀粉酶制剂

1、配制发酵培养基

配制实施例2步骤七的最佳培养基。

2、孢子液的制备

配制实施例2步骤一的浓度为1×10

3、生淀粉酶制剂的制备

将步骤2已接种的草酸青霉A2-13孢子悬浮液的发酵培养基置于28℃恒温培养箱静置培养6天，得到发酵产物；离心(12,000rpm离心15min)，收集上清液，该上清液即为生淀粉酶制剂。

4、测定生淀粉酶制剂的生淀粉酶活力。

结果如下：生淀粉酶制剂的生淀粉酶活力为191.0±1.5U/mL。

对比文献报道的和本课题组的青霉属产生淀粉酶活力如表3，表明草酸青霉A2-13在实施例2步骤七最佳培养基和步骤八最佳孢子接种浓度的条件下，产最高酶活力的生淀粉酶。

表3、青霉属菌株发酵产生淀粉酶活力对比

参考文献：Lin HJ,Xian L,Zhang QJ,et al.2011.Production of raw cassavastarch-degrading enzyme by Penicillium and its use in conversion of rawcassava flour to ethanol.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.38,733-742.

实施例4、利用生淀粉酶制剂水解生淀粉

一、生淀粉酶制剂单独水解生淀粉

1、生淀粉的制备：

将在农贸市场(南宁)买的去皮生木薯片和碎玉米粒，60℃烘干，粉碎，过80目筛网。

2、生淀粉水解

反应体系为100mL，底物(生木薯粉或生玉米粉)浓度设置为100g/L，生淀粉酶制剂上样量设置为50U/g底物。

反应体系具体制备方法为：向pH 4.5Na

反应条件为40℃，180rpm，反应72小时。分别在反应0、6、12、24、36、48和72h取样，检测反应体系中还原糖的含量，生淀粉转化率。

生淀粉转化率＝还原糖的重量*0.9*100/生木薯粉或玉米粉中生淀粉的重量。

结果见表4，表明酶添加量为50U/g时，在反应72小时时，生玉米和生木薯淀粉转化率分别为87.6％和62.5％。

表4、草酸青霉A2-13产生淀粉酶制剂水解生淀粉的转化率(％)

二、生淀粉酶制剂与商业α-淀粉酶协同水解生淀粉

1、生淀粉的制备：

如步骤一。

2、生淀粉水解

反应体系为100mL，底物(生木薯粉或生玉米粉)浓度设置为100g/L，生淀粉酶制剂上样量设置为50、100、150和200U/g底物四个梯度

反应体系具体制备方法为：向pH 4.5Na

反应条件为40℃，180rpm，共反应72小时。分别在反应0、12、24、36、48、60和72h取样，检测反应体系中还原糖的含量，生淀粉转化率。

生淀粉转化率＝还原糖的重量*0.9*100/生木薯粉或玉米粉中生淀粉的重量。

结果见表5，表明酶添加量为100U/g时，在反应60小时时，生玉米淀粉转化率达到了水解完全。

表5、草酸青霉A2-13产生淀粉酶制剂与商业α-淀粉酶协同水解生玉米粉的淀粉转化率(％)

结果见表6，表明酶添加量为150U/g时，在反应60小时时，生木薯淀粉转化率达到了水解完全。

表6、草酸青霉A2-13产生淀粉酶制剂与商业α-淀粉酶协同水解生木薯粉的淀粉转化率(％)

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。