靶向沉默BRAF基因的shRNA序列及其用途

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及两种靶向沉默BRAF基因的shRNA序列及其用途。本发明设计并合成了针对BRAF基因的shRNA分子，并设计出构建shRNA的寡核苷酸序列，该分子与BRAF基因的mRNA结合，高效地干扰其转录，降低BRAF基因在IMR90细胞中的表达，从而抑制EGF诱导的人成纤维细胞衰老。对于衰老的预防/治疗具有十分重要的意义，将这些shRNA分子进一步开发成为临床治疗药物，在未来抗衰老的靶向基因药物研发和衰老相关疾病治疗中具有巨大的潜在价值，有望应用于制备高效、特异性强、副作用小的抗衰老药物。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及靶向沉默BRAF基因的shRNA序列及其用途。

背景技术

B-Raf 原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶(BRAF )基因，编码B-Raf蛋白，属于raf/mil家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调控Ras/Raf/MAP/ERKs信号通路，在细胞生长、分裂、分化等方面起重要作用。Ras/Raf/MAP/ERKs信号通路是细胞衰老及SASP因子诱导细胞衰老的关键信号通路。当细胞遇到外界刺激而过度激活Ras时，该信号通路被激活，进而激活下游的衰老信号通路诱导细胞衰老。BRaf作为该信号通路的关键蛋白，抑制BRaf能够有效的阻断该信号通路，从而抑制细胞衰老。

RNA干扰技术(RNAi)是物种在进化上的一种高度保守的基因防御机制，即一种依赖于双链RNA特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。目前实验室常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体与短发夹核糖核酸（shRNA）慢病毒质粒表达载体。siRNA是短的双链RNA，大小在19-29 nt左右，3´端有两个游离的碱基，可激活RNA的干扰，通过与目标mRNA互补序列结合，特异性地实现mRNA降解。但是siRNA在细胞中的表达是瞬时的，发挥作用的时间比较短。相对于siRNA， shRNA可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。但如何利用shRNA技术，研究出特异性针对细胞衰老的shRNA，为细胞衰老相关疾病的预防或治疗仍然是本需要探索的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供两种靶向性沉默BRAF基因的shRNA序列、寡核苷酸及其应用。本发明根据沉默BRAF基因对EGF诱导的细胞衰老情况的影响，判断沉默BRAF基因的shRNA序列的特异性，验证可沉默BRAF基因的shRNA序列对抗EGF诱导细胞衰老能力的作用。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了两种shRNA序列，其能靶向沉默BRAF基因表达，其为用于沉默BRAF基因的靶点序列BRAF-1或BRAF-2；其中，BRAF-1的靶点序列如SEQ ID NO.1所示，即： 5´-Tcggctgcggaccctgccatt-3´；BRAF-2的靶点序列如SEQ ID NO.2所示，即：5´-Atctccaggacctcagcgaga-3´。

本发明还提供了用于制备靶向上述BRAF-1的寡核苷酸序列，shBRAF-1的正义链shBRAF-1-F如SEQ ID NO.3所示，即： 5´-CCGGTcggctgcggaccctgccattCTCGAGaatggcagggtccgcagccgATTTTT-3´，反义链shBRAF-1-R如SEQ ID NO.4所示，即：5´-AATTAAAAATcggctgcggaccctgccattCTCGAGaatggcagggtccgcagccgA-3´；本发明还提供了用于制备靶向上述BRAF-2的寡核苷酸序列， shBRAF-2的正义链shBRAF-2-F如SEQ ID NO.5所示，即：5´-CCGGAtctccaggacctcagcgagaCTCGAGtctcgctgaggtcctggagaTTTTTTTG-3´，反义链shBRAF-2-R如SEQ ID NO.6所示，即：5´-AATTCAAAAAAAtctccaggacctcagcgagaCTCGAGtctcgctgaggtcctggagaT-3´。

在一些实施方案中，本发明提供了一种包含上述的靶向沉默BRAF基因表达的shRNA序列的慢病毒表达载体，所述载体为pLKO.1-TRC-shBRAF-1或pLKO.1-TRC-shBRAF-2。所述慢病毒表达载体由合成的所述shBRAF-1或shBRAF-2分别克隆到慢病毒表达载体pLKO.1-TRC中获得。

本发明还提供了靶向沉默BRAF基因的shRNA序列在制备抑制BRAF基因表达的药物中的应用。所述应用为制备治疗/预防衰老相关的药物。

本发明还提供了一种抗衰老的药物，所述药物包上述的靶向沉默BRAF基因表达的shRNA序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明设计并合成了针对BRAF基因的shRNA分子，并设计出构建shRNA的寡核苷酸序列，该分子与BRAF基因的mRNA结合，高效地干扰其转录，降低BRAF基因在IMR90细胞中的表达，从而抑制EGF诱导的人成纤维细胞衰老。对于衰老的预防/治疗具有十分重要的意义，将该shRNA分子进一步开发成为临床治疗药物，在未来抗衰老的靶向基因药物研发和衰老相关疾病治疗中具有巨大的潜在价值。有望应用于制备高效、特异性强、副作用小的抗衰老药物，其潜在的社会和经济效益十分巨大。

附图说明

图1是shBRAF对BRAF的表达水平影响的Western blotting图；

图2是SA-β-gal染色法检测shBRAF对EGF诱导的IMR90细胞衰老能力的影响图；图中，A为shBRAF对EGF诱导的IMR90细胞衰老能力对比图；B为shBRAF对EGF诱导的IMR90细胞衰老能力影响统计图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变，以使其使用各种用途和条件。

以下实施例中，所用材料及试剂部分来源如下：慢病毒包装载体pLP1、pLP2、pLPSVG、慢病毒敲减质粒载体pLKO.1-TRC均购买于美国Addgene公司。本发明所用人胚肺成纤维细胞IMR90购自于美国菌种保藏中心American Type Culture Collection。

实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。

实施例1：慢病毒载体的构建

根据GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)获得BRAF基因(NM_004333.6)的mRNA序列，根据shRNA设计原理，选择靶点序列，这两段寡聚核苷酸链的序列分别记为BRAF-1，BRAF-2；其中，BRAF-1的靶点序列如SEQ ID NO.1所示，即： 5´-Tcggctgcggaccctgccatt-3´（其对应编码区为335-355核苷酸位点）；BRAF-2的靶点序列如SEQ ID NO.2所示，即：5´-AtctccaggacctcagCGAGA-3´（其对应编码区为1479-1499核苷酸位点）。

使用primer软件设计shRNA序列，并在NCBI网站上进行序列比对验证其特异性，根据靶序列BRAF-1，设计合成如下所示的寡核苷酸序列：shBRAF-1的正义链shBRAF-1-F如SEQID NO.3所示，即： 5´-CCGGTcggctgcggaccctgccattCTCGAGaatggcagggtccgcagccgATTTTT-3´，反义链shBRAF-1-R如SEQ ID NO.4所示，即：5´-AATTAAAAATcggctgcggaccctgccattCTCGAGaatggcagggtccgcagccgA-3´；根据靶序列BRAF-2，设计合成如下所示的寡核苷酸序列：shBRAF-2的正义链shBRAF-2-F如SEQ ID NO.5所示，即：5´-CCGGAtctccaggacctcagcgagaCTCGAGtctcgctgaggtcctggagaTTTTTTTG-3´，反义链shBRAF-2-R如SEQ ID NO.6所示，即：5´-AATTCAAAAAAAtctccaggacctcagcgagaCTCGAGtctcgctgaggtcctggagaT-3´。本发明中所述引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

将上述2对shRNA退火形成4条双链寡核苷酸短片段，连接到双酶切的慢病毒敲减质粒载体pLKO.1-TRC上。将连接产物通过热激法转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，置于含氨苄抗性的LB固体培养基上37 ℃培养16 h，挑取单个菌落于含氨苄抗性LB液体培养基中摇菌，37 ℃、220 rpm、16 h，收集菌体提质粒，酶切验证质粒，将酶切的阳性质粒送于华大基因进行测序验证。测序显示构建成功的慢病毒质粒用于后续实验。通过上述方法，构建得到含有目的质粒的慢病毒载体pLKO.1-TRC-shBRAF-1和pLKO.1-TRC-shBRAF-2。

实施例2：细胞慢病毒的制备及慢病毒转染细胞

参照Lipofectamine 2000试剂说明书包装慢病毒。分别以实施例1所制备的两种慢病毒载体转染细胞作为实验组，同时以pLKO.1-TRC慢病毒空载体转染细胞作为对照组；

将0.75 μg pLP1、0.35 μg pLP2、0.49 μg pLPSVG、0.61 μg慢病毒载体pLKO.1-TRC-shBRAF-1分别加入到0.5 mL的低血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育5 min，得到液A，待用。

取9 μL脂质体Lipofectmine 2000加到0.5 mL的OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，室温放置 5min得到液B，待用。

将液A与液B液按1:1的比例混匀得到混合液，室温孵育20 min；将293FT的细胞混悬液与混合液按1:1的比例轻柔充分混匀，并转移到培养皿中，轻轻摇晃，使混匀铺平底部。将培养皿放置在培养箱中孵育12 h后，给细胞换液，继续培养。培养两天后，用5 mL的灭菌注射器吸取细胞上清液，再经0.45 μm微孔滤膜过滤掉细胞上清杂质，收集病毒。

慢病毒载体pLKO.1-TRC-shBRAF-2和慢病毒空载体pLKO.1-TRC包装慢病毒的方法与上述慢病毒载体pLKO.1-TRC-shBRAF-1包装慢病毒的方法相同。

用收集到的病毒分别转染IMR90细胞：第一天，种板，数细胞，调整细胞密度为6 cm培养皿底面积的三分之一；第二天，病毒感染，拿出6 cm培养皿，弃上清，病毒与IMR90细胞1：1混合，分别感染培养皿中的IMR90细胞，并加入8 mg/mL 聚凝胺（polybrene），放入培养箱，孵育8 h；弃上清，给细胞换液，继续放入培养箱培养两天；培养两天后，弃上清，用1000mg/mL 嘌呤霉素（puromycin）按1：1000稀释，筛选2-3天；重新种板：将筛选出的稳定感染慢病毒的细胞消化下来重新种回培养皿中，获得具有抗性的活细胞，用于后续实验。

实施例3：Western blotting检测BRAF基因在IMR90细胞中的蛋白表达水平。

收集病毒感染的IMR90细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，将蛋白变性之后跑胶转膜，5%脱脂牛奶封闭膜1 h之后，使用BRAF抗体和β-actin抗体过夜孵育，然后用连有辣根过氧化物酶的山羊抗鼠的抗体室温孵育1 h，抗体孵育过后，用TBS-T溶液室温洗膜3次，每次4min，最后将膜置于经过暗处理的暗匣中拿到暗室中曝光，曝光时将片固定在膜上，在发光液和显影液的作用下蛋白的条带会印迹在胶片上。收集puromycin筛选后实验组和对照组存活的IMR90细胞，分别提取细胞总蛋白，Western blotting检测不同组细胞中目的蛋白BRaf的表达情况。图1是shBRAF对BRAF基因的表达水平Western blotting图；图中，β-action为内参蛋白，Vector为用pLKO.1-TRC空载体感染的对照组，shBRAF-1和shBRAF-2为分别用pLKO.1-TRC-shBRAF-1和pLKO.1-TRC-shBRAF-2感染的实验组。由图1可见，与对照组Vector相比，shBRAF-1和shBRAF-2均能显著沉默IMR90细胞中BRaf蛋白的表达，对IMR90细胞中BRAF基因的表达有显著的沉默作用。

实施例4：SA-β-gal染色检测shBRAF对EGF诱导的IMR90细胞衰老能力的影响。

本实施例中以EGF诱导IMR90细胞衰老，通过SA-β-gal染色检测shBRAF对EGF所诱导的IMR90细胞衰老的影响，同时，以同体积的PBS作空白对照（Vehicle/Vector组）。

第一步：取圆形玻片浸泡于95%的乙醇中，点燃酒精灯灼烧玻片，将玻片放入24孔板中，静置放凉备用。分别消化转染过慢病毒shBRAF-1、shBRAF-2及pLKO.1-TRC空载体并经过嘌呤霉素筛选的IMR90细胞，弃原培养液，用2 mL PBS清洗，0.5 mL胰酶消化，加2 mL含10% 胎牛血清100U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM培养基吹打混匀，200 g离心5min，弃上清，加含10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的杜尔伯科改良伊格尔培养基吹打混匀，取0.5 ml到EP管，用枪吸取10 µL于细胞计数板上计数或稀释相应倍数后计数。IMR90每孔种4×10

图2是SA-β-gal染色法检测shBRAF对EGF诱导的IMR90细胞衰老能力的影响图；图中，A为shBRAF对EGF诱导的IMR90细胞衰老能力对比图；B为shBRAF对EGF诱导的IMR90细胞衰老能力影响统计图。**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，n=3。由图2可见， EGF/Vector组中SA-β-gal阳性细胞数量与Vehicle/Vector组相比明显增多，而EGF/shBRAF-1组和EGF/shBRAF-2组中的SA-β-gal阳性细胞数量与Vehicle/Vector组相比明显减少。经统计，Vehicle/Vector组阳性细胞比例为4.9%，EGF/Vector组SA-β-gal阳性细胞比例为28.43%，与Vehicle/Vector组相比，P=0.0002，存在显著性差异。而EGF/shBRAF-1组和EGF/shBRAF-2组中SA-β-gal阳性细胞比例分别为9.7%和8.7%，与EGF/Vector组相比，P值分别为0.0018和0.0012，存在显著性差异。可知，EGF处理可以诱导IMR90细胞的衰老，而shBRAF具有显著抑制EGF诱导的IMR90细胞衰老的能力，沉默BRAF基因表达对EGF诱导的IMR90细胞衰老能力具有明显的抑制作用。因此，本发明所设计的shBRAF分子可用于制备治疗或预防细胞衰老的药物，尤其制备治疗/预防因EGF所诱导的细胞衰老相关的药物。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 靶向沉默BRAF基因的shRNA序列及其用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

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tcggctgcgg accctgccat t 21

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<213> 人源(Homo sapiens)

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atctccagga cctcagcgag a 21

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<211> 57

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

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aattaaaaat cggctgcgga ccctgccatt ctcgagaatg gcagggtccg cagccga 57

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<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

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ccggatctcc aggacctcag cgagactcga gtctcgctga ggtcctggag atttttttg 59

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<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

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