用于合成含精氨酸的肽的方法

摘要

提供了用于合成含精氨酸肽的方法。所述方法包括脱保护步骤，该脱保护步骤使来自裂解的基于磺酰基的侧链保护基的副产物从精氨酸到携带富电子侧链的氨基酸的转移最小化。

说明书

技术领域

提供了用于合成含精氨酸的肽的方法。新颖的方法包括脱保护步骤，该脱保护步骤使来自裂解的基于磺酰基的侧链保护基的副产物从精氨酸到携带富电子侧链的氨基酸的转移最小化。

背景技术

肽和用来合成肽的氨基酸往往具有反应性侧基。在肽的侧基处的不希望的反应产生不需要的副产物，有时具有相当大的量。从实践角度来看，这些副产物和反应可严重地损害产量或者甚至破坏正在合成的产物。为了使这些副反应最小化，因此常规做法是适当地掩蔽反应物的反应性侧基以帮助确保所期望的反应发生。在肽合成完成之后，然而，这些侧链保护基必须是可定量去除的，以免负面地影响肽质量或产量。

为了将精氨酸并入到肽中，通常使用甲氧基三甲基苯磺酰基-(Mtr)、2,2,5,7,8-五甲基-苯并吡喃-6-磺酰基-(Pmc-)或2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基-(Pbf-)保护的精氨酸。然而，已证明了如果最终肽还包含携带富电子侧链的氨基酸，诸如组氨酸和/或色氨酸，则来自精氨酸的裂解基于磺酰基的侧链保护基容易与其他残留物的富电子侧链起反应，从而导致大量有害的副产物。此外，以上提及的保护基的使用需要延长脱保护时间或更苛刻的最终脱保护条件，这也可能对肽的质量和/或产量产生负面影响。

为了避免与精氨酸侧链保护基相关联的问题，侧链未保护的、α氨基保护的精氨酸也可用于在肽合成中使用。然而，如以上所讨论的，在侧链基处的不希望的反应产生不合需要的副产物。在精氨酸的情况下，三官能胍基侧链是强亲核性的并且在其中任何一个侧链未保护的精氨酸在溶液中游离(未与新生肽偶联)或者与新生肽偶联的条件下可以为反应性的。因此，通常仍然优选使用侧链保护的精氨酸。

因此，持续需要一种用于在还包含携带富电子侧链的氨基酸的肽中使精氨酸的侧链保护基脱保护的高效且改进的方法。

令人惊讶地，人们现在已发现，制备包含侧链保护的精氨酸和携带富电子侧链的氨基酸的肽的某些预分散体、然后将所述预分散体与能够裂解Mtr-、Pmc-或Pbf-的酸混合显著地减少了副产物的形成。

发明内容

因此，在第一实施方式中本发明涉及一种用于使包含Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸和至少携带富电子芳族侧链的氨基酸的肽脱保护的方法，所述方法包括以下步骤：

a.)将肽增溶在以下项的混合物(在本文中也称为溶剂混合物)中：至少一种非质子有机溶剂、硫醇清除剂和要么质子溶剂要么不能够去除精氨酸保护基的酸或它们的混合物，然后

b.)将步骤a.)中获得的溶液与不能够去除精氨酸保护基的酸和能够去除精氨酸保护基的酸的混合物(在本文中也称为裂解混合物)混合，附带条件是步骤a.)和b.)中使用的不能够去除精氨酸保护基的酸的总量(按摩尔计)高于能够去除精氨酸保护基的酸的量。

应很好地理解，本发明包含肽作为光学纯异构体，诸如例如作为纯对映异构体或立体异构体，以及不同异构体的混合物，诸如例如作为外消旋体或非对映异构体的混合物。

如本文所使用的氨基酸的术语“侧链”通常是指氨基酸的附着到相应的氨基酸的公共

术语“不能够去除精氨酸保护基的酸”是指不能够在如在下面概述并在实施例中图示的给定反应条件下定量地去除(即多达95-100％)精氨酸保护基的酸(诸如特别是三氟乙酸、乙酸或甲酸)。

术语“能够去除精氨酸保护基的酸”是指能够在如如在下面概述并在实施例中图示的给定反应条件下定量地去除精氨酸保护基的酸(诸如特别是甲烷磺酸)。

在本发明的所有实施方式中，优选的富电子侧链是“芳基C

如本文所使用的术语“芳基C

术语“杂芳基C

芳基相应地杂芳基残基可以彼此独立地为未取代的或者被一个或多个取代基取代。在本发明的所有实施方式中，此类取代基优选地选自由以下项组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、C

在本发明的所有实施方式中，特别有利的芳基C

在本发明的所有实施方式中，最优选的杂芳基C

在所有实施方式中，携带富电子芳族侧链的最优选的氨基酸选自由以下项组成的组：D/L-组氨酸、D/L-色氨酸、6-氟-色氨酸、5-羟基-色氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-酪氨酸、D/L-m-硝基酪氨酸、D/L-O-乙基-酪氨酸、D/L-3-(2-萘基)-丙氨酸。携带富电子芳族侧链的特别有利的氨基酸选自由以下项组成的组：D/L-组氨酸、D/L-苯丙氨酸、D/L-酪氨酸和D/L-色氨酸以及O-C

在本发明的所有实施方式中，最优选地包含Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸的肽也含携带选自由以下项组成的组的富电子芳族侧链的至少一个氨基酸：D/L-组氨酸、D/L-色氨酸、酪氨酸、D/L-6-氟-色氨酸和D/L-5-羟基-色氨酸，因为然后粗产物的纯度改进以及因此在产物离析之后可实现的产量是特别显著的。

在本发明的所有实施方式中，特别优选的肽是包含Mtr-或Pbf-侧链保护的精氨酸、最优选为包含Pbf-侧链保护的精氨酸的肽。

在本发明的所有实施方式中，特别合适的非质子溶剂是在环境温度(即20℃)下为液体的芳族烃，或C

在本发明的所有实施方式中，特别优选的芳族烃液体是C

在本发明的所有实施方式中，特别优选的C

要根据本发明使用的另一种合适的非质子溶剂是乙腈，优选地与二氯甲烷混合。

在本发明的所有实施方式中，非质子溶剂的量被选择为使得要脱保护的肽能够被增溶在其中，优选地本身或至少在存在硫醇清除剂、质子溶剂和/或在-10℃至40℃、优选0℃至30℃、甚至更优选10℃至25℃的范围内选择的温度下不能够去除精氨酸保护基的酸的情况下增溶。另外优选的温度范围包括15℃至30℃、15℃至25℃、18℃至25℃和18℃至22℃的范围。甚至更优选地，非质子溶剂的(总)量是至少1ml/g肽(即，每克肽1ml溶剂)，优选至少2ml/g肽，最优选至少2.5ml/g肽。优选地，在本发明的所有实施方式中，在1ml/g肽至100ml/g肽的范围内、更优选地在2ml/g肽至10ml/g肽的范围内、最优选地在2.5ml/g肽至7ml/g肽的范围内选择非质子溶剂的量。

在本发明的所有实施方式中，特别合适的质子溶剂选自水和醇的组，优选地选自水和直链、支链或环状烷基醇，诸如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇和环己醇但不限于此。在本发明的所有实施方式中最优选地使用甲醇、乙醇和水及它们的混合物。

在本发明的所有实施方式中，特别合适的质子溶剂是水和C

如果存在，则基于使肽溶解所添加的溶液的总体积，优选地在0.01％(v/v)至7％(v/v)的范围内、更优选地在0.5％(v/v)至5％(v/v)的范围内、最优选地在1％(v/v)至5％(v/v)范围内选择质子溶剂的总量。术语(v/v)是指体积百分比(体积％)，即基于步骤a.)中溶剂混合物的总体积的质子溶剂的体积-％。

不能够去除精氨酸保护基的特别合适的酸是羧酸。在本发明的所有实施方式中不能够去除精氨酸保护基的特别优选的酸选自甲酸、乙酸和三氟乙酸及它们的任何混合物的组。在所有实施方式中最优选地使用乙酸和/或三氟乙酸，诸如特别是三氟乙酸。

如果存在，则在本发明的所有实施方式中，基于使肽溶解所添加的溶液的总体积(即基于溶剂混合物的总体积)，优选地在3％(v/v)至50％(v/v)的范围内、更优选地在5％至40％的范围内、最优选地在5％(v/v)至30％(v/v)的范围内例如在5％(v/v)至15％(v/v)的范围内或在7％(v/v)至12％(v/v)的范围内选择不能够在步骤a.)中去除精氨酸保护基的酸的总量。

在本发明的所有实施方式中，基于每个(单独)保护的精氨酸片段，优选地在3摩尔当量至25摩尔当量的范围内、更优选地在5摩尔当量至20摩尔当量的范围内、最优选地在5摩尔当量至15摩尔当量选择的范围内选择不能够在步骤a.)中去除精氨酸保护基的酸的总量。

此外优选的是，在步骤a.)中增溶肽的时间不超过1小时。更优选地，在5分钟至1小时的范围内、更优选地在10分钟至45分钟的范围内、最优选地在15分钟至30分钟的范围内选择在步骤a.)中增溶肽的时间。

附加地，在本发明的所有实施方式中，优选地在15℃至30℃的范围内、更优选地在15℃至25℃的范围内、最优选地在18℃至25℃的范围内例如在18℃至22℃的范围内选择步骤a.)中的反应温度。

对于本领域的技术人员而言公知的是，如在上面概述并在实施例中图示的用于步骤a.)的酸的量和/或条件不足以定量地去除精氨酸保护基。

此外应很好地理解，在步骤a.)中，可能不存在能够去除精氨酸保护基的酸，诸如甲烷磺酸，因为这显著地增加烷基化或磺化副产物的形成，从而减小原油产物的纯度并因此相应地降低游离肽的离析产量。然而，混合物可以例如含如在下面定义的另外的清除剂。

然而如果在步骤a.)中将肽增溶在基本上由至少一种非质子有机溶剂、硫醇清除剂以及要么质子溶剂要么不能够去除精氨酸保护基的酸组成的溶剂混合物中则是特别有利的，其中所有定义和优选项如本文所给出的那样。

如根据本发明所使用的术语“基本上由...组成”意味着所列举的成分的总量理想地总计为100重量％。然而不排除可以存在少量杂质或添加剂，其前提是此类杂质或添加剂的总量优选地小于3重量％，更优选地小于2重量％，最优选地小于1重量％。

能够去除精氨酸保护基的特别合适的酸是磺酸，诸如甲烷磺酸(MSA)、三氟甲烷磺酸(三氟甲磺酸)、苯磺酸或对甲苯磺酸。最优选地，在本发明的所有实施方式中，能够去除精氨酸保护基的酸是MSA。

根据本发明的合适的硫醇清除剂是通常在肽合成中使用的所有硫醇清除剂。在本发明的所有实施方式中，特别优选的硫醇清除剂是脂族硫醇(烷基硫醇)，更优选十二烷硫醇。然而不排除可以将其他清除剂与硫醇清除剂一起添加到步骤a.)，例如特别是三烷基硅烷(更优选C

在本发明的所有实施方式中最优选地使用十二烷硫醇作为清除剂，任选地在存在附加清除剂的情况下，所述附加清除剂选自三烷基硅烷(更优选C

相对于要脱保护的肽中存在的精氨酸保护基的数目，优选地在0.1至100摩尔当量、优选1摩尔当量至20摩尔当量、甚至更优选2摩尔当量至10摩尔当量、最优选3摩尔当量至6摩尔当量的范围内选择清除剂的总量。

在特别有利的实施方式中，任选地在存在质子溶剂的情况下，在步骤a.)中使用不能够去除精氨酸保护基的酸，其中所有定义和优选项如本文所给出的那样。基于不能够去除精氨酸保护基的酸的量，优选地在0至20％(v/v)的范围内、优选地在0％(v/v)至15％(v/v)的范围内、最优选地在0％(v/v)至10％(v/v)的范围内例如在0％(v/v)至5％(v/v)的范围内选择质子溶剂的量。

在本发明的所有实施方式中，基于每个(单独)保护的精氨酸片段，优选地在75摩尔当量至250摩尔当量的范围内、更优选地在80摩尔当量至200摩尔当量的范围内、最优选地在90摩尔当量至175摩尔当量例如100摩尔当量至150摩尔当量的范围内选择不能够在步骤b.)中去除精氨酸保护基的酸(如优选甲酸、乙酸和/或三氟乙酸)的量。

在本发明的所有实施方式中，基于每个(单独)保护的精氨酸片段，优选地在1摩尔当量至20摩尔当量的范围内、更优选地在2摩尔当量至12摩尔当量的范围内、最优选地在3摩尔当量至10摩尔当量例如5摩尔当量至8摩尔当量的范围内选择能够在步骤b.)中去除精氨酸保护基的酸(如优选甲烷磺酸)的量。

附加地，在本发明的所有实施方式中，优选地在15℃至30℃的范围内、更优选地在15℃至20℃的范围内、最优选地在18℃至25℃的范围内、例如在18℃至22℃的范围内选择步骤b.)中的反应温度。

步骤b.)中的反应时间不是关键的。然而，优选的是步骤b.)中的反应时间不超过5小时。更优选地在15分钟至3小时的范围内、更优选地在30分钟至2.5小时的范围内、最优选地在45分钟至2小时的范围内选择反应时间。

有利地，在本发明的所有实施方式中，步骤b.)中使用的不能够去除精氨酸保护基的酸(诸如优选甲酸、乙酸和/或三氟乙酸)的量(摩尔)大于能够去除精氨酸保护基的酸(诸如优选甲烷磺酸)的量(摩尔)。甚至更有利地，不能够去除精氨酸保护基的酸(诸如优选甲酸、乙酸和/或三氟乙酸)与在步骤b.)中能够中去除精氨酸保护基的酸(诸如优选甲烷磺酸)的摩尔比在50:1至5:1的范围内、更优选地在30:1至10:1的范围内、最优选地在20:1至10:1的范围内选择。

此外有利的是，在100:1至10:1的范围内、优选地在50:1至12:1的范围内、更优选地在30:1至15:1的范围内、最优选地在25:1至18:1的范围内选择步骤a.)和b.)中使用的不能够去除精氨酸保护基的酸(诸如优选甲酸、乙酸和/或三氟乙酸)的量(总数)与步骤b.)中使用的能够去除精氨酸保护基的酸(诸如优选甲烷磺酸)的量的摩尔比。另外合适的范围包括25:1至12:1或20:1至15:1。

在一个特别有利的实施方式中，步骤a.)中的溶剂混合物由以下项组成：

i.)1ml至100ml、优选2ml至10ml、最优选2.5ml至7ml的非质子溶剂/每克肽，

ii.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为0.1摩尔当量至100摩尔当量、优选1摩尔当量至20摩尔当量、最优选2摩尔当量至10摩尔当量的清除剂，其中清除剂是十二烷硫醇或十二烷硫醇与三烷基硅烷和/或水的混合物，

iii.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为3摩尔当量至25摩尔当量、优选5摩尔当量至20摩尔当量、最优选5摩尔当量至15摩尔当量的甲酸、乙酸和/或三氟乙酸，以及

iv.)基于甲酸、乙酸和/或三氟乙酸的量为0体积％至15体积％、优选0体积％至10体积％、最优选0体积％至5体积％的质子溶剂。

甚至更优选地，步骤a.)中的溶剂混合物由以下项组成

i.)1ml至100ml、优选2ml至10ml、最优选2.5ml至7ml的苯、甲苯、二甲苯、二氯甲烷和/或乙腈/每克肽，

ii.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为0.1摩尔当量至100摩尔当量、优选1摩尔当量至20摩尔当量、最优选2摩尔当量至10摩尔当量的清除剂，其中清除剂是十二烷硫醇或十二烷硫醇与三乙基硅烷、三异丙基硅烷和/或水的混合物，

iii.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段，3至25摩尔当量、优选5至20摩尔当量、最优选5至15摩尔当量的乙酸和/或三氟乙酸，和

iv.)基于乙酸和/或三氟乙酸的量为0体积％至15体积％、优选0体积％至10体积％、最优选0体积％至5体积％的甲醇和/或乙醇。

最优选地，步骤a.)中的溶剂混合物由以下项组成

i.)1ml至100ml、优选2ml至10ml、最优选2.5ml至7ml的甲苯、二氯甲烷或二氯甲烷和乙腈的混合物/每克肽，

ii.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为0.1摩尔当量至100摩尔当量、优选1摩尔当量至20摩尔当量、最优选2摩尔当量至10摩尔当量的清除剂，其中清除剂是十二烷硫醇或十二烷硫醇与三异丙基硅烷和/或水的混合物，

iii.)基于乙酸和/或三氟乙酸的量为0体积％至15体积％、优选0体积％至10体积％、最优选0体积％至5体积％的甲醇和/或乙醇，以及

iv.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为3摩尔当量至25摩尔当量、优选5摩尔当量至20摩尔当量、最优选5摩尔当量至15摩尔当量的乙酸和/或三氟乙酸。

在本发明的所有实施方式中，步骤b.)中的裂解混合物优选地由以下项组成

i.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为75摩尔当量至250摩尔当量、优选80摩尔当量至200摩尔当量、更优选90摩尔当量至175摩尔当量、最优选100摩尔当量至150摩尔当量的甲酸、乙酸和/或三氟乙酸，以及

ii.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为1摩尔当量至20摩尔当量、优选2摩尔当量至12摩尔当量、更优选3摩尔当量至10摩尔当量、最优选5摩尔当量至8摩尔当量的磺酸、优选甲烷磺酸。

甚至更优选地，在本发明的所有实施方式中，步骤b.)中的裂解混合物由以下项组成

i.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为75摩尔当量至250摩尔当量、优选80摩尔当量至200摩尔当量、更优选90摩尔当量至175摩尔当量、最优选100摩尔当量至150摩尔当量的乙酸和/或三氟乙酸，以及

ii.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为1摩尔当量至20摩尔当量、优选2摩尔当量至12摩尔当量、更优选3摩尔当量至10摩尔当量、最优选5摩尔当量至8摩尔当量的甲烷磺酸。

最优选地，在本发明的所有实施方式中，步骤b.)中的裂解混合物由以下项组成

i.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为至多250摩尔当量、优选至多200摩尔当量、更优选至多175摩尔当量、最优选至多150摩尔当量的乙酸和/或三氟乙酸，以及

ii.)基于每个(单独)保护的精氨酸片段为1摩尔当量至20摩尔当量、优选2摩尔当量至12摩尔当量、更优选3摩尔当量至10摩尔当量、最优选5摩尔当量至8摩尔当量的甲烷磺酸，

附带条件是，在100:1至10:1的范围内、优选地在50:1至12:1的范围内、更优选地在30:1至15:1的范围内、最优选地在25:1至18:1的范围内选择步骤a.)和b.)中使用的乙酸和/或三氟乙酸的量与步骤b.)中使用的甲烷磺酸的量的摩尔比。

应很好地理解，在步骤b.)中使用的酸(即不能够去除精氨酸保护基的酸诸如特别是甲酸、乙酸和/或三氟乙酸以及能够去除精氨酸保护基的酸诸如特别是甲烷磺酸)可与来自步骤a.)的溶液分开地混合。然而，优选地，这些酸在与来自步骤a.)的溶液混合之前被混合。最优选地，在本发明的所有实施方式中，裂解混合物是由乙酸和/或三氟乙酸和甲烷磺酸组成的裂解溶液，其中所有定义和优选项如本文所给出的那样。

在本发明的所有实施方式中，包含Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸和至少携带富电子芳族侧链的氨基酸的肽是二至六肽，即二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。

在另一个优选的实施方式中，Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸和至少携带富电子芳族侧链的氨基酸被至多3个氨基酸、优选被至多两个氨基酸并且更优选被至多一个氨基酸分开。然而在本发明的所有实施方式中，富电子氨基酸最优选地与Mtr-、Pmc-或Pbf-侧链保护的精氨酸直接相邻。

甚至更优选地，在本发明的所有实施方式中肽是包含至少一个Pbf保护的精氨酸片段和选自由酪氨酸、组氨酸和/或色氨酸组成的组的至少一个氨基酸片段的肽，其中组氨酸、酪氨酸、色氨酸片段相应地优选地被至多两个，更优选地被至多一个，诸如特别地与保护的精氨酸片段直接相邻。特别优选的酪氨酸、组氨酸和/或色氨酸氨基酸是组氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-羟基-色氨酸和6-氟-色氨酸及它们的混合物。应很好地理解，如以上所提及的，Pbf保护的精氨酸片段以及氨基酸片段可以是L-或D-构型的或者是两种构型的混合物(在肽内)。

在本发明的所有实施方式中，优选的肽是包含至少一种Pbf-保护的精氨酸和选自由以下项组成的组的至少一种氨基酸的肽：组氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-羟基-色氨酸和6-氟-色氨酸及它们的混合物，更优选地为包含一种Pbf保护的精氨酸和选自由以下项组成的组的至少一种氨基酸的肽：组氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-羟基-色氨酸和6-氟-色氨酸及它们的混合物，诸如特别是三肽至六肽。

根据本发明的特别优选的肽是Boc-Trp-Arg(Pbf)-OH、Ac-Arg(Pbf)-His(Trt)-Phe-OH、TFA*H-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-OH,Boc-rac-6FTrp-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH、Boc-Tyr(Et)-Arg(Pbf)-Ala-Phe-OH、Ac-5-(OH)Trp-Ala-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Phe-OH、Boc-Arg(Mtr)-Tyr(tBu)-Phe-OH、Boc-2Nal-Leu-Arg(Pbf)-Phe-OH、Ac-Arg(Pbf)-Met-m(NO

具体实施方式

参考以下非限制性实施例进一步图示本发明，其中除非另外指定，否则所有百分比都基于总重量按重量计。

一般信息

本申请中使用的缩写词

2 Nal 3-(2-萘基)-丙氨酸

5(OH)Trp 5-羟基-色氨酸

6FTrp 6-氟-色氨酸

Ac 乙酰基

AcOEt 乙酸乙酯

AcOH 乙酸

Ala 丙氨酸

Arg 精氨酸

Boc 叔丁氧羰基

tBu 叔丁基

Bz 苯甲酰基

calcd 计算出的

DCM 二氯甲烷

DDCT 十二烷硫醇

DMSO 二甲基亚砜

Et 乙基

EtOH 乙醇

Glu 谷氨酸

Hex 正己烷

Leu 亮氨酸

MeCN 乙腈

MeOH 甲醇

Met 蛋氨酸

min 分钟

MS 质谱

MSA 甲烷磺酸

MTBE 甲基叔丁基醚

Mtr 4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基

m(NO

OtBu 叔丁酯

Pbf 2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基

PDA 光电二极管阵列

Phe 苯丙氨酸

PhMe 甲苯

PhSMe 硫代苯甲醚(甲基苯硫醚)

Pr 丙基

Pro 脯氨酸

rac 外消旋体

rpm 每分钟转数

Ser 丝氨酸

TFA 三氟乙酸(≥99％)

THF 四氢呋喃

TIS 三异丙基硅烷

Trt 三苯甲基

Tyr 酪氨酸

UPLC 超高效液相色谱

材料和方法

在使用之前使分析级甲苯在硫酸钠上变干。使用了MilliQ水。所有其他溶剂和试剂都是分析级或更高级的并原样使用。

在配备有Acquity HSS T3

在配备有Acquity HSS T3

Eppendorf 5415C离心机被用于离心作用。

一般程序

含有保护精氨酸的肽由溶液相方法或由固相方法制备并且在不去除侧和N末端保护基的情况下从树脂中裂解，必要时提纯并在使用之前在干燥箱中干燥。通过UPLC确定起始材料的纯度。

在最终脱保护方法的描述中，在不另外陈述的情况下，摩尔当量和溶剂体积是指考虑到其如通过UPLC所测量的纯度的含有保护精氨酸的肽的量。

为了比较用不同的脱保护方法获得的结果，反应混合物(5-10μL)的探针在相同的反应时间之后被采样，稀释在1mL冰冷的1:1MTBE/Hex中，所得悬浮液被以10000-14000rpm离心达5分钟，然后倾析，在1mL冰冷的1:1MTBE/Hex中形成颗粒，摇匀，以10000-14000rpm离心(一次或两次)达5分钟，所得颗粒被溶解于1mL合适的溶剂(甲醇、10％乙腈水溶液或90％乙腈水溶液，取决于脱保护肽的极性)中并通过UPLC来分析。重复此程序直到从标准品中取样探针，并且经改进的脱保护混合物显示保护肽的峰完全消失并且含Arg(Pbf)的脱保护中间体≤1％。

对于所测试的每个肽序列，通过UPLC-MS来分析至少一个探针以确认主峰对应于所期望的脱保护肽。

标准一步(参考)和改进的两步(发明)的比较

对于以下实施例1-8中提及的每种保护肽，用标准品且用改进的程序处理相同量的材料，均在下面进行描述。

标准(参考)方法：将保护肽和搅拌器放在玻璃烧瓶或小瓶中。通过混合PhMe(2.8mL/g)、TFA(127eq)、DDCT(4eq)、MSA(7.1eq)来制备裂解混合物。将裂解溶液立即添加到保护肽，在室温(22℃)下搅拌。将相应的裂解混合物搅拌达实施例中给出的时间。

根据本发明的方法：将保护肽和搅拌器放在玻璃烧瓶或小瓶中。将PhMe(2.5mL/g)、TFA(7.2eq)和DDCT(4eq)混合并在搅拌下给予给肽。搅拌混合物直至得到溶液为止；如果在搅拌几分钟并进行短超声处理之后，仍有未溶解的材料，则在搅拌下在少量部分中添加增加量的TFA和/或PhMe，直至完全溶解(肽溶液)为止。

通过在圆底烧瓶中混合TFA(120eq)和MSA(7.1eq)来制备裂解溶液。在搅拌下用注射器将肽溶液逐滴添加到裂解溶液；将肽溶液的容器用PhMe(0.28mL/g)冲洗，并且将冲洗溶液逐滴添加到裂解溶液。搅拌所得混合物达实施例中给出的时间。

通过UPLC来评价所得反应混合物中期望游离肽的量(并表达为面积％)。通过UPLC-MS来确认所有产物(参考和发明)的身份。

实施例1.Boc-Trp-Arg(Pbf)-OH到H-Trp-Arg-OH的脱保护

起始材料：每次测试142mg肽(96％UPLC纯度，0.185mmol)。

裂解时间：90分钟。

参考：31.7％。

发明：68.0％(完全溶解需要附加0.08mL PhMe和50μL TFA，总共13.7eq TFA)。

UPLC-MS：针对[M+H]

实施例2.Ac-Arg(Pbf)-His(Trt)-Phe-OH到Ac-Arg-His-Phe-OH的脱保护

起始材料：每次测试369mg肽(60％UPLC纯度，0.222mmol)，180分钟

裂解时间：180分钟

参考：65.3％。

发明：70.2％(完全溶解需要附加17μL TFA，总共8.2eq TFA)。

UPLC-MS：针对[M+H]

实施例3.Boc-Arg(Mtr)-Tyr(tBu)-Phe-OH到H-Arg-Tyr-Phe-OH的脱保护

起始材料：每次测试234mg(98％UPLC纯度，0.260mmol)。

裂解时间：90分钟。

发明：84.8％。

发明：94.5％(完全溶解需要附加0.12mL PhMe和20μL TFA，总共8.2eq TFA)。

UPLC-MS：针对[M+H]

实施例4.Boc-2Nal-Leu-Arg(Pbf)-Phe-OH到H-2Nal-Leu-Arg-Phe-OH的脱保护

起始材料：每次测试364mg(UPLC纯度87％，0.322mmol)。

裂解时间：110分钟。

参考：89.7％。

发明：90.5％(完全溶解需要附加24μLTFA，总共8.2eq TFA)。

UPLC-MS：针对[M+H]

实施例5.Ac-Arg(Pbf)-Met-m(NO

起始材料：每次测试85mg(96％UPLC纯度，0.089mmol)。

裂解时间：90分钟。

参考：93.6％。

发明：95.3％(要完全溶解需要附加0.02mL PhMe和35μL TFA，总共12.4eq TFA)。

UPLC-MS：针对[M+H]

实施例6.Boc-rac-6FTrp-Gly-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-OH到H-rac-6FTrp-Gly-Arg-Glu-OH的脱保护

起始材料：每次测试126mg HPLC纯化的肽(97％UPLC纯度，0.122mmol)。

裂解时间：90分钟。

参考：59.0％。

发明：86.8％(完全溶解需要附加0.08ml PhMe和35μLTFA，总计12.4eq TFA)。

UPLC-MS：针对[M+H]

实施例7.Boc-Tyr(Et)-Arg(Pbf)-Ala-Phe-OH到H-Tyr(Et)-Arg-Ala-Phe-OH的脱保护

起始材料：每次测试376mg粗制肽(92％UPLC纯度，0.361mmol)。

裂解时间：90分钟。

参考：86.6％。

发明：87.0％(完全溶解需要附加0.10mL PhMe和135μL TFA，总共12eq TFA)。

实施例8.Ac-5(OH)Trp-Ala-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Phe-OH到Ac-5(OH)Trp-Ala-Arg-Ser-Leu-Phe-OH的最终脱保护

起始材料：每次测试262mg(96％UPLC纯度，0.217mmol)。

裂解时间：85分钟。

参考：39.3％。

发明：62.9％(完全溶解需要附加0.14mL PhMe和272μL TFA，总共24.1eq TFA)。

UPLC-MS：针对[M+H]

比较例C1.在步骤a.)中采用MSA来溶解肽的Boc-Tyr(Et)-Arg(Pbf)-Ala-Phe-OH到H-Tyr-Arg-Ala-Phe-OH的脱保护

起始材料：每次测试351mg(93％UPLC纯度，0.309mmol)。

裂解时间：110分钟。

参考：75.8％。

两步法：75.0％UPLC-MS：针对[M+H]

如能够从此比较例中检索到的，未获得产量的改进。

实施例9.具有变化参数的Bz-Gly-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-D-Trp-N(Pr)

实施例9A1.改进的两步脱保护

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶于0.63mlPhMe、0.09ml TFA(7.1当量)和0.163ml DDCT(4当量)的混合物中；将肽溶液滴加到1.51mlTFA(120eq)和0.078ml MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07ml PhMe冲洗，并将冲洗溶液添加到反应瓶中并搅拌140分钟。结果：90.4％。

实施例9A2.改进的两步脱保护，反向添加

将受保护的肽(0.168mmol，纯度为93％)放在装有搅拌器的圆底烧瓶中，并溶解在0.70mL PhMe、0.09mL TFA(7.1eq)和0.163mL DDCT(4eq)的混合物中。向肽溶液中逐滴加入1.51mL TFA(120eq)和0.078mL MSA(7.1eq)的混合物，并搅拌140分钟。结果：90.8％。

实施例9A3.改进的两步脱保护：使用95％TFA(aq)

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶解在0.63mlPhMe、0.09ml 95％TFA(aq)(6.8eq)和0.163ml DDCT(4eq)的混合物中；将肽溶液滴加到1.58ml 95％TFA(aq)(120eq)和0.078ml MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07ml PhMe冲洗并将冲洗液添加到反应烧瓶中，搅拌140分钟。结果：89.6％。

实施例9A4.改进的两步脱保护：溶于30％TFA(aq)

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶于0.63mlPhMe、0.25ml 30％TFA(aq)(20eq)和0.163ml DDCT(4eq)的混合物中；将肽溶液滴加到30％1.35ml TFA(aq)(107eq)和0.078mL MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07ml PhMe冲洗并将冲洗溶液添加到反应烧瓶中，搅拌140分钟。结果：90.7％。

实施例9A5.改进的两步脱保护基：用二氯甲烷代替甲苯

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶解在0.63mLDCM、0.09mL TFA(7.1eq)和0.163mL DDCT(4eq)的混合物中。将肽溶液滴加到1.51ml TFA(120eq)和0.078ml MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07ml DCM冲洗，然后将冲洗溶液添加到反应烧瓶中并搅拌140分钟。结果：91.3％。

实施例9A6.改进的两步脱保护：溶于二氯甲烷/水中

将受保护的肽(0.168mmol，纯度为93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶解在1.30ml DCM、24μLH

实施例9A7.改进的两步脱保护：溶于含甲醇的二氯甲烷中

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中溶解在1.10mlDCM、0.10ml MeCN、0.05ml MeOH(7.3eq)、0.163ml DDCT(4eq)和0.138ml TIS(4eq)的混合物中；向肽溶液中逐滴加入1.60mL TFA(127eq)和0.078mL MSA(7.1eq)的混合物，并搅拌140分钟。结果：90.2％。

比较例C2A1.使用TIS代替DDCT作为清除剂的两步脱保护

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶于0.63mlPhMe、0.09ml TFA(7.1当量)和0.140ml TIS(4当量)的混合物中；将肽溶液滴加到1.51mlTFA(120eq)和0.078ml MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07ml PhMe冲洗，将冲洗溶液添加到反应瓶中并搅拌140分钟。结果：76.4％。

比较例C2A2.使用PhSMe代替DDCT作为清除剂的两步脱保护

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶解在0.63mlPhMe、0.09ml TFA(7.1eq)和0.080ml PhSMe(4eq)的混合物中；将肽溶液滴加到1.51ml TFA(120eq)和0.078ml MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07ml PhMe冲洗，将冲洗溶液添加到反应瓶中并搅拌140分钟。结果：35.1％。

比较例C2A3.单独使用H

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶解在0.63mlPhMe、0.18ml TFA(14.2eq)和0.060ml H

比较例C2A4.溶解于THF而不是PhMe中的两步脱保护

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶解在0.63mlTHF、0.09ml TFA(7.1eq)和0.163ml DDCT(4eq)的混合物中；将肽溶液滴加到1.51ml TFA(120eq)和0.078ml MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07ml THF冲洗，将冲洗溶液添加到反应瓶中并搅拌140分钟。结果：31.7％。

比较例C2A5.溶解于DMSO而不是PhMe中的两步脱保护

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)放在装有搅拌器的小瓶中，并溶解在0.63mlDMSO、0.09ml TFA(7.1eq)和0.163ml DDCT(4eq)的混合物中；将肽溶液滴加到1.51ml TFA(120eq)和0.078ml MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07ml DMSO冲洗，将冲洗溶液添加到反应瓶中并搅拌140分钟。结果：2.9％。

比较例C2A6.溶解于AcOEt而不是PhMe中的两步脱保护

将受保护的肽(0.168mmol，纯度为93％)放在装有搅拌器的圆底烧瓶中，并溶解在0.70mL AcOEt、0.09mL TFA(7.1eq)和0.163mL DDCT(4eq)的混合物中。将肽溶液滴加到1.51ml TFA(120eq)和0.078ml MSA(7.1eq)的混合物中，将装有肽溶液的小瓶用0.07mlAcOEt冲洗，将冲洗溶液添加到反应瓶中并搅拌140分钟。结果：61.8％。

比较例C2A7.使用纯MSA对裂解液进行两步脱保护

将受保护的肽(0.168mmol，纯度93％)在配有搅拌器的圆底烧瓶中溶解于0.75mlPhMe、0.40ml 95％TFA(aq)(30eq)和0.163ml DDCT的混合物中(4eq)；向肽溶液中滴加0.22mL MSA(20eq)，将得到的混合物搅拌140分钟。结果：38.8％。

实施例9A8.改进的两步脱保护：在肽溶液中用乙酸作为酸改善了

将受保护的肽(0.173mmol，96％纯度)放在配备有搅拌器的小瓶中，并溶解在0.63mL PhMe、0.072mL AcOH(7.2eq)和0.167mL DDCT(4eq)的混合物中。在搅拌下将肽溶液逐滴加入到1.56mL TFA(120eq)和0.081mL MSA(7.1eq)的混合物中；用0.07mL PhMe冲洗装有肽溶液的小瓶，将冲洗溶液添加至反应烧瓶中并搅拌140分钟。结果：92.0％。

实施例9A9.改进的两步脱保护：使用乙醇作为质子助溶剂

将受保护的肽(0.173mmol，纯度96％)放在配备有搅拌器的圆底烧瓶中，并溶解在1.1mL PhMe、0.10mL EtOH和0.167mL DDCT(4eq)的混合物中。在搅拌下向该肽溶液中逐滴加入1.65mL TFA(127eq)和0.081mL MSA(7.1eq)的混合物，并搅拌140分钟。结果：90.8％。

比较例C2A8.两步脱保护-无非质子惰性溶剂

将受保护的肽(0.173mmol，纯度96％)在配有搅拌器的小瓶中溶解于0.63ml AcOH(63eq)、25μLH