基因组合的检测试剂在肺癌患者免疫治疗中的应用

摘要

本发明涉及基因组合的第一检测试剂在制备用于预测肺癌患者对免疫治疗敏感性或者预测免疫治疗效果的试剂盒中的应用，属于生物医学领域。所述基因组合包括基因CTLA4、CD8、B7‑H3、TIM3、PD‑1和CMTM4。发明采用联合检测的方法，在检测患者PD‑L1表达水平的同时，还可以兼顾其他药效影响因子，不仅可以对肿瘤患者PD‑L1表达水平进行评估，还可以进行免疫检查点抑制剂药效预测、用药期间药效评估及预测预后和复发。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体地，涉及基因组合的检测试剂在肺癌患者免疫治疗中的应用，更具体地，涉及基因组合的检测试剂在制备用于预测肺癌患者对免疫治疗敏感性或者预测免疫治疗效果的试剂盒中的应用。

背景技术

PD-L1(程序性死亡受体-配体1)是PD-1(程序性死亡受体1)的主要配体，广泛表达于树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、T细胞、B细胞、内皮细胞和上皮细胞等。近年来，科学家发现部分肿瘤细胞过度表达PD-L1，使得肿瘤细胞可以与免疫细胞表面的PD-1进行特异性结合，抑制免疫细胞活性，从而成功达到免疫逃逸的目的。基于此机理开发的免疫检查点抑制剂能够通过阻断PD-1/PD-L1通路阻止肿瘤细胞与免疫细胞结合，重新激活肿瘤患者体内的免疫细胞，利用人体自身免疫系统对抗肿瘤细胞，适用于多种癌症。

FDA批准的免疫检查点抑制剂Keytruda、Opdivo、Atezolizumab(MPDL3280A)等抗肿瘤药物的临床试验均以PD-L1表达水平作为主要入组标准，可见PD-L1表达水平对抗癌药物敏感人群筛选具有重要意义。然而，由于IHC检测使用的是肿瘤组织样本，瘤间及瘤内异质性可导致检测结果的偏差；且肿瘤组织样本的检测结果只能代表取样当时患者肿瘤组织的PD-L1的表达水平，无法实现整个病程PD-L1表达水平的动态监测；另外，IHC只能检测PD-L1表达水平，无法评估患者免疫状态及预测药效。另一方面，在PD-L1高水平表达患者中，PD-L1/PD-1抑制剂的应答率只有30％-40％，而在PD-L1表达阴性患者中由于PD-L1表达水平是动态变化的，也存在10％左右的应答率，因此单纯以PD-L1表达水平预测免疫检查点抑制剂药效以及筛选敏感人群并不准确。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

本发明提供了基因组合的第一检测试剂在制备用于预测肺癌患者对免疫治疗敏感性或者预测免疫治疗效果的试剂盒中的应用，所述基因组合包括基因CTLA4、CD8、B7-H3、TIM3、PD-1和CMTM4。

CTLA-4(CD152)(NCBI登录号：NM_005214.4)是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。基因重组的CTLA-4Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。

CD8(NCBI登录号：NM_001145873.1)是T淋巴细胞的一个亚群，在杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞起重要作用，CD8和其他类的T细胞一样起源于骨髓，在胸腺内成熟，成熟后在随着淋巴循环到达全身各处，相当一些CD8储存于脾脏、扁桃体和淋巴结等器官内。CD8表面含有两种特征分子，一类是T细胞受体(T-cell Receptor)分子，一类是MHCⅠ类分子，MHCⅡ(Major Histocompatibility ComplexⅡ)由一条α糖蛋白链和一条β糖蛋白链构成。CD8通过表面的MHCⅠ分子与CD4等其他免疫细胞的MHCⅡ分子结合，从而识别其他免疫细胞表面结合的抗原物质。

B7-H3(NCBI登录号：NM_001024736.1)，也称CD276，属于I型跨膜蛋白，胞外区包含两对相同的免疫球蛋白可变区和恒定区，胞内区很短，没有明确的信号基序。其mRNA水平的表达较为广泛，但蛋白表达相对局限在静息的成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、羊水干细胞等非免疫细胞，以及受诱导的抗原提呈细胞、NK细胞表面。许多研究揭示B7-H3在多种肿瘤中过表达，包括黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌及其它肿瘤等，表达水平与患者预后不良和临床转归差密切相关，推测其参与了肿瘤的免疫逃避。虽然其分子机制还不明确，但作为一种可能的免疫检查点分子，是一个有前景的肿瘤免疫治疗靶标。

Tim-3(NCBI登录号：NM_032782.4)是一种I型膜表面蛋白分子，主要在Th1细胞表达，与天然型配体半乳糖凝集素9(galectin-9)反应参与适应性负性免疫调节。此外，Tim-3也在单核-巨噬细胞、自然杀伤细胞以及树突状细胞(DC)表达,参与免疫调节。Tim-3在肿瘤浸润DC高表达，并可与配体高迁移率族蛋白1(HMGB1)结合,通过阻断Toll样受体3(TLR3)、TLR7、TLR9及细胞质中DNA和RNA相关的免疫反应，来抑制核酸介导的固有免疫反应，导致肿瘤免疫逃逸，减弱DNA预防治疗及化疗的效果。

PD-1(CD279)(NCBI登录号：NM_005018.2)是CD28家族成员，其胞质区含有2个酪氨酸残基，靠近N端的1个位于免疫受体酪氨酸抑制基序中，靠近C端的一个位于免疫受体酪氨酸转化基序中。PD-1主要表达在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞表面。在正常情况下，PD-1能够抑制T淋巴细胞的功能，促进自身免疫性疾病的发生。

进一步地，所述第一检测试剂为第一引物对组合。

进一步地，所述第一检测试剂还包括与所述第一引物组合对应的第一探针组合。

更进一步地，

用于扩增所述CTLA4的引物对分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；

用于扩增所述CD8的引物对分别具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；

用于扩增所述B7-H3的引物对分别具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列；

用于扩增所述TIM3的引物对分别具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:12所示核苷酸序列；

用于扩增所述PD-1的引物对分别具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:15所示核苷酸序列；

用于扩增所述CMTM4的引物对分别具有SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列。

进一步地，所述第一检测试剂与内参基因组合的第二检测试剂一起用于制备所述试剂盒。

更进一步地，所述内参基因组合包括ACTB、GAPDH、HPRT1和RPLP0。

优选地，所述第二检测试剂为第二引物对组合。

更优选地，所述第二检测试剂还包括与所述第二引物组合对应的第二探针组合。

更进一步地，

用于扩增所述CTLA4的引物对分别具有SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:21所示核苷酸序列；

用于扩增所述CD8的引物对分别具有SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:24所示核苷酸序列；

用于扩增所述B7-H3的引物对分别具有SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:27所示核苷酸序列；

用于扩增所述TIM3的引物对分别具有SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列，探针具有SEQ ID NO:30所示核苷酸序列。

进一步地，所述探针可以用标签标记。

更进一步地，利用放射性同位素、荧光素、生物素、酶(例如碱性磷酸酶)、酶底物、配体和抗体进行标记。

再进一步地，与所述基因杂交的探针利用FAM荧光标记；与内参基因杂交的探针利用VIC荧光标记。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，优选地，所述PCR扩增试剂包括dNTP、聚合酶、缓冲液。

在本发明中，所述肺癌为非小细胞肺癌。

本发明的有益效果

(1)本发明所采用的临床样本为肿瘤患者外周血，可以排除肿瘤异质性带来的结果偏差；且不需要手术或者穿刺取样，能够减少患者的痛苦。

(2)在不同时期采集患者外周血，可以实现对肿瘤患者整个病程中PD-L1表达水平的动态监测；

(3)本发明采用荧光定量PCR技术，通过确定阈值判定样本PD-L1表达水平，方法简便、容易操作、定量准确且重复性好；

(4)不受任何主观因素的影响；

(5)本发明采用联合检测的方法，在检测患者PD-L1表达水平的同时，还可以兼顾其他药效影响因子，不仅可以对肿瘤患者PD-L1表达水平进行评估，还可以进行免疫检查点抑制剂药效预测、用药期间药效评估及预测预后和复发。

在本申请中，术语“关于”被用于表示一些数值包括检测或定量方法的内在误差。

在与术语“包括”连接用词“一”或“一个”可能表示的“一”，但也可能表示‘一或更多’，‘至少一’，或者‘一及一以上’。

用词“包括”(任何形式的包括，例如“包含”和“涵盖”)，“有”(任何形式的有，例如“含”，“涵”)，“包含”(任何形式的包含，例如“涉及”，“包括”)或者“包涵”(和任何形式的包涵，例如“包涵”，“涵盖”)都是涵盖其中或者是无限制的，不排除另外未详尽的因素或方式步骤。

这些组合物和方法用于“包含”，“基本上含有”，或“包括”任何在说明书中公开的处方和步骤。这些组合物和方法“基本含有”的任何一种公开的处方或步骤，限制实质上不影响发明权利的实用性和新颖性的，指定材料或者步骤的权利要求范围。

通过结合下面附图对本发明进行的详细描述，本发明的前述和其它优点和特征以及其实现方式将变得更加显而易见。

附图说明

图1显示了肺癌患者和正常对照血液样品中CTLA4的表达水平。

图2显示了肺癌患者和正常对照血液样品中CD8的表达水平。

图3显示了肺癌患者和正常对照血液样品中B7-H3的表达水平。

图4显示了肺癌患者和正常对照血液样品中TIM3的表达水平。

图5显示了肺癌患者和正常对照血液样品中PD-1的表达水平。

图6显示了肺癌患者和正常对照血液样品中CMTM4的表达水平。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例

样本来源：肿瘤样本来自非小细胞肺癌患者血液。

mRNA提取：

血液核酸提取试剂盒：XTRAKT blood Kit(Stratifyer,Cat.No.#XTKB1.3-48)。具体提取步骤参照制造商说明书。

一步法RT-qPCR(反应体系、条件)：

引物：

反应体系：

RT-qPCR一步法试剂：Hotstart One-step RT-PCR Mix(深圳市菲鹏生物股份有限公司，货号MD027)。

引物浓度范围：200nM-800nM

FAM或VIC探针：100nM-400nM

RNA模板：25uL体系中模板总量应大于50ng。

反应条件：

RT-PCR步骤：50℃15min；95℃10min；

qPCR步骤：95℃10sec；60℃34sec；45个循环。

数据分析：

免疫治疗相关基因和内参基因分别使用FAM和VIC两种不同类型的荧光探针，两两组合，构建二重RT-qPCR反应体系；

在RT-qPCR反应结果中设置不同的阈值，就会获得相对应的CT值，计算ΔCT；

ΔCT＝CT

其中，CT

分别比较6个基因在肺癌患者和正常人样本的表达情况(ΔCT)，发现各个基因上在不同样本中具有不同的表达水平，如图1-6所示。

检测结果不仅可以直接反映患者肿瘤细胞表达PD-L1在mRNA水平上的高低，通过检测PD-L1蛋白调控因子的表达水平，间接反映出PD-L1的蛋白水平；另一方面，还可以通过检测上下游免疫调节因子的表达水平评估患者免疫T细胞的活化程度及表面抗原水平，通过对肿瘤细胞及免疫细胞的全面评估从而预测患者对免疫治疗的敏感性或免疫治疗的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 漯河医学高等专科学校

<120> 基因组合的检测试剂在肺癌患者免疫治疗中的应用

<130> JIA-2020-1-W-028

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctgcaaggt ggagctcatg t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcacggttct ggatcaatta ca 22

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accgccatac tacctgg 17

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccctgagca actccatcat 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcttcgctgg caggaagac 19

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttcagccac ttcgtg 16

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctccaagac agccctgc 18

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcaggctat ttcttgtcca tcatct 26

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctctgaaac actctgac 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtcatcaaa ccagccaagg t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttggaaaggc tgcagtgaag t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttggaaaggc tgcagtgaag t 21

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtcctggccg tcatctgct 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgaggggtcc tccttcagg 19

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acaataggag ccaggcg 17

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacagtcgcc ctgagatcca 20

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtgatttttt ccttactgtt acgtttgt 28

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctggacactt tttcctactc 20

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aaggccaacc gcgagaa 17

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acagcctgga tagcaacgta ca 22

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgacccagat catgttt 17

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccacatcgct cagacaccat 20

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtgaccaggc gcccaat 17

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agtcaacgga tttggtc 17

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ccttggtcag gcagtataat cca 23

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggtccttttc accagcaagc t 21

<210> 27

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agatggtcaa ggtcg 15

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tggaagtgac atcgtcttta aacc 24

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctgtcttccc tgggcatca 19

<210> 30

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cgtggcaatc cctgac 16