与聚泛素衔接物结合的线性多功能性多聚体生物分子及其用途

摘要

本发明提供如下的线性多聚体生物分子聚合物，即，通过从宿主细胞重组表达来获取与泛素C‑末端标签结合的生物分子，使其与参与泛素化的E1(活化酶(Activation enzyme))、E2(结合酶(Conjugation enzyme))、E3(连接酶(Ligase))蛋白及底物一同在体外(in vitro)进行聚泛素化，两个以上的泛素通过共价键合形成的聚泛素骨架与生物分子结合来形成。本发明的聚合物可用于生物分子的分离纯化、分离与上述生物分子结合的靶物质等。

说明书

技术领域

本发明涉及将包含蛋白质的生物分子制备为多聚体形态的聚合物的方法。具体地，本发明涉及利用泛素化系统将从宿主细胞重组表达的生物分子制备为线性多功能性多聚体生物分子聚合物的方法。

背景技术

将包含蛋白质(protein)、肽(peptide)、多肽(polypeptide)、抗体(antibody)、脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)的生物分子(biomolecules)和/或小分子化合物(smallmolecule chemical compounds)制备为多聚体形态(multimeric form)具有多种优点。例如，将两个以上的同种蛋白质或异种蛋白质融合(fusion)或使用交联剂(cross linker orcross-linking agent)来使两个以上的同种蛋白质或异种蛋白质连接，由此，可改善蛋白质的溶解性、凝胶化、热稳定性及pH值稳定性等物理化学特性。例如，当进行淀粉氧化时，通过交联剂多重连接来形成的虫漆酶(laccase)、交联酶凝聚体(CLEA，cross-linked enzymeaggregate)示出进一步得到提高的稳定性和性能，作为另一酶的腈水合酶(nitrilehydratase)的交联酶凝聚体在将丙烯腈(acrylonitrile)转换为丙烯酰胺(acrylamide)时呈现出优秀的活性增加，在利用36次的过程中没有失去活性。并且，许多蛋白质在细胞内形成复合物(complex)来执行复杂的功能，这是由于蛋白质的邻近效应(proximity effect)所致。例如，使用骨架(scaffold)将作为分解木质纤维素(lignocellulose)所需的酶的纤维素酶(cellulase)、β葡糖苷酶(β-glucosidase)、半纤维素酶(Hemicellulase)等制备为复合混合物形态的纤维素酶(Novozymes

作为分离和/或纯化所目的的蛋白质的方法，提出了使用泛素的方法。即，首先，从原核细胞(procaryotic cells)表达对与泛素结合的蛋白质进行编码(encoding)的基因来制备与泛素连接的融合蛋白，之后，利用泛素切割酶对其进行处理来有效地从泛素融合蛋白分离并纯化所目的的蛋白质。美国专利申请第10/504785号涉及重组基因的表达及纯化所表达的蛋白质，具体记述如下：制备对泛素类似蛋白质(Ubl)C-末端域进行编码的核苷酸与对所目的的蛋白质进行编码的核苷酸操作地(operatively)结合的融合蛋白，并在宿主细胞表达其。韩国专利申请第10-2005-0050824号提出在表达重组蛋白质的过程中，将泛素用作融合伙伴。并且，韩国专利申请第10-2015-0120852号涉及在蛋白质纯化过程中，利用泛素柱，在柱加载聚泛素链，利用包含E2的体外(in vitro)泛素化纯化蛋白质。并且，美国专利申请第12/249334号用于解决表达并制备重组蛋白质的过程中的问题，即，水溶性和折叠问题，为了容易表达及分离、纯化重组蛋白质并提高蛋白质的活性，利用具有被Ulp1蛋白酶(Ubl-specific protease 1)识别的切割部位的SUMO。但是，这些方法仅记述了在表达蛋白质的过程中利用泛素，未记述或教示制备多聚体形态的蛋白质，使得所要分离纯化的蛋白质随意地与泛素结合，因此，依然具有分离或分析效率上的局限。

由此，本发明人不断努力研发不抑制蛋白质的活性且具有高集成度的多聚体形态的蛋白质的制备方法。结果，从宿主细胞重组表达与泛素结合的生物分子，在体外使其与泛素化相关酶进行反应来形成与聚泛素骨架结合的线性多功能性多聚体生物分子聚合物，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

如上所述，本发明的目的在于，提供利用泛素C-末端标签(UCT，Ubiquitin C-terminal Tag)在体外固定或交联(cross-link)蛋白质等生物分子的方法。

本发明的再一目的在于，提供聚泛素骨架与目的生物分子结合的线性多功能性多聚体生物分子(linear multivalent multimeric biomolecules)及其制备方法。

本发明的另一目的在于，提供固定上述线性多功能性多聚体生物分子的结构体及其制备方法。

本发明的还有一目的在于，提供利用上述线性多功能性多聚体生物分子来分离纯化所目的的物质的方法。

本发明的又一目的在于，提供利用上述线性多功能性多聚体生物分子分析与上述生物分子结合的靶物质或分离及纯化其的方法。

本发明的又一目的在于，提供将聚泛素用作衔接物来使两个以上的生物分子和/或小分子化合物进行位点特异性结合的方法。

本发明的又一目的在于，提供用于以位点特异性(site-specific)结合两个以上的生物分子和/或小分子化合物的聚泛素的用途。

本发明的又一目的在于，提供包含上述本发明的线性多功能性多聚体生物分子的药学组合物。

解决问题方法

为了实现上述目的，本发明提供一种线性多功能性多聚体生物分子(multivalentmultimeric biomolecule)制备方法，其特征在于，包括：(i)从包括原核细胞或真核细胞的宿主细胞重组表达生物分子，上述生物分子与泛素C-末端标签融合或通过衔接物与泛素C-末端标签结合，以及(ii)向上述宿主细胞的溶解物(cell lysates)添加用于泛素化的E1、E2及E3酶或者E1及E2酶并进行反应，包含对于互不相同的结合位点(binding sites)分别具有特异性的两个以上的结合部分(binding moieties)作为生物分子，上述生物分子与通过两个以上泛素的共价键合形成的聚泛素骨架(polyubiquitin scaffold)结合。由此，在本发明中，引发线性多功能性多聚体生物分子聚合物或复合物的形成的引发剂(initiator)可以为E3、E2、E1、游离泛素(free ubiquitin)或E3的目的底物(substrate)。其中，上述E2酶可与泛素的第48位赖氨酸或第63位赖氨酸结合，上述E2酶可以为E2-25K泛素结合(ubiquitin conjugating)酶或泛素结合酶复合物Ucb13-MMS2。

在与之相关的本发明的一实施例中，重组表达的上述生物分子通过从作为泛素C-末端标签的第76位氨基酸的甘氨酸的C-末端部延伸1～50个氨基酸而成，在(ii)的反应前或(ii)的反应后，向重组表达的上述生物分子还添加去泛素化酶(DUB，Deubiquitinatingenzyme)，例如，UH1、YUH2、UCH-L1、UCH-L2或UCH-L3。

在与之相关的本发明的一实施例中，上述生物分子具有与其他生物分子、低分子化合物或纳米粒子等特异性结合的活性部位(active sites)，可以为选自由酶、蛋白质、肽、多肽、抗体、脱氧核糖核酸以及核糖核酸组成的组中的一种以上，但并不限定于此，可向上述(ii)还添加ATP并进行反应。有利地，各个上述酶、蛋白质、肽、多肽、抗体、脱氧核糖核酸及核糖核酸可为同种或异种。即，构成本发明的线性多功能性多聚体复合物(complex)的单体分别可以为同种或异种蛋白质或者蛋白质和肽或者抗体，根据需求，多种生物分子的单体可形成为线性多功能性多聚体复合物。其中，上述生物分子可以为选自由蛋白A(protein A)、蛋白G(protein G)、溶素(lysin)、内溶素(endolysin)、蛋白酶(proteases)、水解酶(hydrolase)、氧化还原酶(oxidoreductase)、裂解酶(lyase)、亲和配体(affinityligand)以及受体(receptor)组成的组中的一种以上，但并不限定于此。并且，上述生物分子可为选自由胰岛素、胰岛素类似物、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-l等)、GLP-1/胰高血糖素双重激动剂、唾液素4(exendin-4)、唾液素4类似物、胰岛素分泌肽及其类似物、人生长激素(human growth hormone)、生长素释放激素(GHRH)、生长素释放肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、抗肥胖肽、G蛋白偶联受体(G-protein-coulped receptor)、瘦素、抑胃多肽(GIP，Gastric inhibitory polypeptide)、白细胞介素、白细胞介素受体、白细胞介素结合蛋白、干扰素、干扰素受体、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、过敏原抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素(EPO)、高糖链促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体活化肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、血液因子IX及血液因子XIII、胞浆素原活化因子、纤维蛋白-结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板源生长因子、上皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管生成抑制因子、血管紧张肽、骨形成生长因子、骨形成促进蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制剂、促卵泡激素(FSH)、黄体生成激素(LH)、黄体生成素释放激素(LHRH)、神经生长因子、甲状旁腺素(PTH)、松弛素、肠促胰液素、生长调节素、肾上腺皮质激素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质素释放因子、促甲状腺激素(TSH)、自毒素、乳铁蛋白、抑肌素、受体、受体拮抗物、纤维亚细胞生长因子(Fibroblast growth factor)、脂联素(Adiponectin)、白介素受体拮抗剂(interleukin receptor antagonist)、天门冬氨酸(aspartate)、6xHis、几丁质结合域(Chitin binding domain)、谷胱甘肽转移酶(GST)、凝血酶(Thrombin)、FLAG标签(tag)、细胞表面抗原、病毒源性疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体片段组成的组中的一种以上，但并不限定于此。

在与之相关的本发明的一实施例中，用于体外泛素化的E1、E2及E3可选择并使用任意组合。例如，在E2为UBCH5A(UBE2D1)的情况下，可选自由RSP5(UniProt ID.P39940)、DTX2(UniProt ID.Q86UW9)、DTX3(UniProt ID.Q8N9I9)、MID1(UniProt ID.O15344)、RING1(UniProt ID.Q06587)、RNF11(UniProt ID.Q9Y3C5)、RNF111(UniProt ID.Q6ZNA4)、RNF126(UniProt ID.Q9BV68)、RNF115(UniProt ID.Q9Y4L5)、RNF14(UniProt ID.Q9UBS8)、RNF185(UniProt ID.Q96GF1)、RNF2(UniProt ID.Q99496)、RNF5(UniProt ID.Q99942)、TRAF6(UniProt ID.Q9Y4K3)、TRIM8(UniProt ID.Q9BZR9)、ZNRF1(UniProt ID.Q8ND25)、XIAP(UniProt ID.P98170)以及TRIM39(UniProt ID.Q9HCM9)组成的组中。并且，在E2为UBC7的情况下，E3可以为DOA10(UniProt ID.P40318)、UFD4(UniProt ID.P33202)、HRD1(UniProtID.Q08109)或HRD3(UniProt ID.Q05787)，在E2为UBE2W(UBC16)的情况下，可利用MARCH5(UniProt ID.Q9NX47)或RNF5(UniProt ID.Q99942)作为与其相互作用的E3，但并不限定于此。

在与之相关的本发明的再一实施例中，有利地，上述泛素C-末端标签的从此泛素的N-末端开始第48位赖氨酸或第63位赖氨酸被丙氨酸取代，或者，更有利地，除其任意位置的一个赖氨酸之外的其他赖氨酸均被删除或被不是赖氨酸的其他氨基酸取代。并且，除从泛素N-末端Met1开始第11位、第48位或第63位赖氨酸之外的泛素的所有赖氨酸可被精氨酸取代。并且，上述泛素C-末端标签的两个以上的泛素能够以头接尾(head-to-tail)形态反复连接。在此情况下，以头接尾形态连接的上述泛素的从N-末端开始第75位及第76位甘氨酸被包括缬氨酸在内的其他氨基酸取代或者第73位亮氨酸可被脯氨酸取代。

在与之相关的本发明的另一实施例中，上述(ii)的反应在具有用于泛素的固定化的底物或基质、或者小珠(bead)的情况下执行，在上述生物分子的一末端可附着有E3结合酶(ligase)。

并且，本发明提供由聚泛素骨架以及生物分子构成的线性多聚体生物分子聚合物，在上述聚泛素中，骨架的两个以上的泛素通过如共价键合连接来形成，上述生物分子分别与上述泛素结合。优选地，上述生物分子分别与上述泛素的N-末端结合。引发线性多聚体生物分子聚合物的形成的引发剂可以为E3、E2、E1、游离泛素或底物。并且，上述线性多聚体生物分子聚合物可由两个至二十个生物分子构成。

在与之相关的本发明的一实施例中，上述生物分子可以为选自由酶、蛋白质、肽、多肽、抗体、脱氧核糖核酸及核糖核酸、微核糖核酸(miRNA)、小干扰核糖核酸(siRNA)以及小分子化合物组成的组中的一种以上。有利地，各个上述蛋白质、肽、多肽、抗体、脱氧核糖核酸以及核糖核酸可以为互不相同的种类。

在与之相关的本发明的还有一实施例中，上述线性多功能性多聚体生物分子复合物或聚合物可以由E3、E2、E1、游离泛素、或底物引发，上述E3为Rsp5、WWP1、nedd4或XIAP或者其最小催化域(minimal catalytic domain)，上述E2可以为Ubc7、Ubch5a、E2-25K(GenBank ID-U58522.1)、Ubc13-MMS2(Unipot ID-P52490)复合物或其最小催化域。

在与之相关的本发明的又一实施例中，上述泛素的从其N-末端开始第48位或第63位赖氨酸被丙氨酸取代，或者，更有利地，除其任意位置的一个赖氨酸之外的其他赖氨酸被删除或被不是赖氨酸的其他氨基酸取代。并且，上述游离泛素的除其任意位置的一个赖氨酸之外的其他赖氨酸被删除或被不是赖氨酸的其他氨基酸取代，除从N末端开始第11位、第48位或第63位赖氨酸之外的所有赖氨酸可被精氨酸取代。并且，可从上述游离泛素的N-末端开始第76位甘氨酸的C-末端部延伸1～50个氨基酸而成，上述氨基酸可以为天门冬氨酸、6xHis标签或谷胱甘肽转移酶标签，上述蛋白质可对于Rsp5或Nedd4-1，2具有PPPY。上述生物分子可与上述游离泛素的N-末端Met1连接，可在上述生物分子的一末端附着引发剂，例如，E3、E2、E1、游离泛素或底物。并且，上述底物可以为包含识别E3结合酶的氨基酸序列且包含一个以上的可与泛素结合的赖氨酸的蛋白质。

在与之相关的本发明的又一实施例中，本发明还提供如下的方法：包括：(i)从包括原核细胞、真核细胞或动物细胞的宿主细胞重组表达生物分子，上述生物分子与泛素C-末端标签融合或通过衔接物与泛素C-末端标签结合；(ii)向上述宿主细胞的溶解物添加用于泛素化的E1、E2及E3蛋白并进行反应，由此，形成通过两个以上泛素的共价键合形成的聚泛素骨架与所要分离及纯化的生物分子结合的线性多功能性多聚体生物分子复合物；以及(iii)分离上述线性多聚体生物分子复合物，由此，在体外分离从宿主细胞表达的生物分子。

在与之相关的本发明的一实施例中，上述生物分子为选自由蛋白质、肽、多肽、抗体、脱氧核糖核酸以及核糖核酸组成的组中的一种以上，向上述(ii)还添加ATP并进行反应。有利地，各个上述蛋白质、肽、多肽、抗体、脱氧核糖核酸以及核糖核酸可以为互不相同的种类。

在与之相关的本发明的又一实施例中，有利地，上述泛素C-末端标签的第48位赖氨酸或第63位赖氨酸被丙氨酸取代，或者，更有利地，除其任意位置的一个赖氨酸之外的其他赖氨酸均被删除或被不是赖氨酸的其他氨基酸取代。

在与之相关的本发明的又一实施例中，上述(ii)的反应在具有用于固定泛素的底物、基质或小珠的情况下执行，可在上述生物分子的一末端附着E3结合酶。

本发明提供包含线性多功能性多聚体生物分子复合物的分离柱(separationcolumn)。在与之相关的一实施例中，上述生物分子可以为蛋白质或抗体。在本发明中，衔接物可以为由3～50个氨基酸构成的肽，但并不限定于此。

在本发明的另一实施例中，本发明提供线性多功能性多聚体生物分子，包含对于由聚泛素骨架及生物分子构成的互不相同的结合位点具有特异性的两个以上的结合部分，其中，上述聚泛素骨架的两个以上的泛素通过共价键合连接来形成，上述生物分子具有与其他生物分子、低分子化合物或纳米粒子等特异性结合的活性部位，分别与上述泛素的N-末端、C-末端或N-末端及C-末端两者结合。其中，上述生物分子聚合物可由两个至四个生物分子构成，上述生物分子可通过衔接物与上述泛素的N-末端、C-末端或N-末端及C-末端两者结合。上述衔接物可通过反复组合一个至六个GGGGS或EAAAK而成。在此情况下，与上述泛素的N-末端结合的生物分子为上述线性多聚体生物分子聚合物的远端(distal end)，与上述泛素的C-末端或N-末端或N-末端及C-末端两者结合的生物分子为线性多聚体生物分子聚合物的近端(proximal end)。在与之相关的本发明的又一实施例中，可通过共价键合连接泛素的所有赖氨酸被精氨酸取代的供体泛素与除第11位、第48位或第63位赖氨酸之外的泛素的所有赖氨酸被精氨酸取代的受体泛素来形成上述聚泛素骨架，上述泛素的从N末端开始第73位亮氨酸可被脯氨酸取代。

在与之相关的本发明的又一实施例中，上述线性多功能性多聚体生物分子聚合物可由两个至二十个生物分子构成。

在与之相关的本发明的又一实施例中，上述生物分子可选自由酶、蛋白质、肽、多肽、抗体、抗体片段、脱氧核糖核酸以及核糖核酸组成的组中的一种以上，可为选自由蛋白A、蛋白G、溶素、内溶素、蛋白酶、水解酶、氧化还原酶、裂解酶、亲和配体以及受体组成的组中的一种以上。并且，上述生物分子可为选自由胰岛素、胰岛素类似物、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-l等)、GLP-1/胰高血糖素双重激动剂、唾液素4、唾液素4类似物、胰岛素分泌肽及其类似物、人生长激素、生长素释放激素、生长素释放肽、粒细胞集落刺激因子、抗肥胖肽、G蛋白偶联受体、瘦素、抑胃多肽、白细胞介素、白细胞介素受体、白细胞介素结合蛋白、干扰素、干扰素受体、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、过敏原抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高糖链促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体活化肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、血液因子IX及血液因子XIII、胞浆素原活化因子、纤维蛋白-结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板源生长因子、上皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管生成抑制因子、血管紧张肽、骨形成生长因子、骨形成促进蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制剂、促卵泡激素、黄体生成激素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺素、松弛素、肠促胰液素、生长调节素、肾上腺皮质激素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质素释放因子、促甲状腺激素、自毒素、乳铁蛋白、抑肌素、受体、受体拮抗物、纤维亚细胞生长因子、脂联素、白介素受体拮抗剂、细胞表面抗原、病毒源性疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体片段组成的组中。

在与之相关的本发明的又一实施例中，上述线性多功能性多聚体生物分子聚合物可由E3、E2、E1、游离泛素或底物引发，上述E3为Rsp5、WWP1、nedd4或XIAP或者其的最小催化域，上述E2可以为Ubc7、Ubch5a、E2-25K、Ubc13-MMS2复合物或者其的最小催化域。其中，上述游离泛素的除其任意位置的一个赖氨酸之外的其他赖氨酸被删除或被不是赖氨酸的其他氨基酸取代。并且，上述游离泛素的除从其N末端开始第11位、第48位或第63位赖氨酸之外的所有赖氨酸被精氨酸取代，从其N末端开始第76位甘氨酸的C-末端部延伸1～50个氨基酸，或者被天门冬氨酸、6xHis标签或谷胱甘肽转移酶标签延伸，或者其的N-末端Met1与生物分子连接。在与之相关的本发明的又一实施例中，可在上述生物分子的一末端附着E3、E2、E1、游离泛素或底物作为引发剂，上述底物可以为包含识别E3结合酶的氨基酸序列且包含一个以上的可与泛素结合的赖氨酸的蛋白质，上述蛋白质可对于Rsp5或Nedd4-1，2包含PPPY。在与之相关的本发明的又一实施例中，上述泛素的除其任意位置的一个赖氨酸之外的其他赖氨酸被删除或被不是赖氨酸的其他氨基酸取代。

在本发明的另一实施方式中，提供药学组合物，上述组合物包含本发明的线性多功能性多聚体生物分子以及药剂学上可接受的载体，使得生物体内稳定性增加。本发明的药学组合物可通过口服、经皮、皮下、静脉或肌肉等多种途径向体内给药。并且，本发明的药学组合物可通过使用该领域周知的方法进行剂型化。剂型可以为片剂、丸剂、粉剂、小袋剂(sachet)、酏剂(elixir)、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌注射液、无菌粉剂等形态。作为适合制剂化的载体、赋形剂及稀释剂的例，可使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁以及矿物油等。制剂还可包含填充剂、抗凝聚剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂、防腐剂等。根据要治疗的疾病、给药途径、患者年龄、性别、体重及疾病的严重程度等的诸多相关因子和作为活性成分的生理活性多肽的种类确定本发明的生物分子的实际给药量。

本发明中使用的术语“多功能性(mutivalent)”与“多重功能性(multifunctional)”或“多价”混用，应理解为，在本发明中具有相同含义。

本发明中使用的术语“多功能性多聚体生物分子(multivalent multermerbiomolecule)”被定义为包含对于互不相同的结合位点分别具有特异性的两个以上的结合部分的生物分子。

本发明中使用的术语“复合物(complex)”、“聚合物(polymer)”、“缀合物(conjugate)”及“结构体(construct)”在这些术语意味着通过衔接物与聚泛素结合的本发明的线性多功能性多聚体生物分子时，在本说明书中以相同含义混用。

本发明中使用的术语“泛素C末端标签”可理解为在形成聚泛素的过程中形成起点的泛素。

发明的效果

根据本发明，通过泛素C-末端标签使线性多功能性多聚体生物分子聚合物或多个复合物之间连接，因此，通过泛素C-末端标签的连接形成的聚泛素可作用为维持与泛素C-末端标签结合的多个生物分子之间的间隔和方向性的坚固骨架(rigid scaffold)或衔接物(linker)。并且，在使泛素C-末端标签之间结合时使用酶反应(enzymatic reaction)(E1-E2-E3)，因此，可在没有额外的分离和纯化步骤的情况下，容易以细胞溶解物(celllysate mixture)形态利用在宿主细胞中表达的生物分子-泛素C-末端标签。并且，本发明的生物分子可以为选自由蛋白质、肽、多肽、抗体、抗体片段、脱氧核糖核酸以及核糖核酸组成的组中的一种以上，例如，可使用异种蛋白质来向线性多功能性多聚体聚合物赋予模块化的功能性。通过酶邻近效应(enzyme proximity effects)制备为线性聚合物的酶在催化剂功能性和稳定性方面呈现出得到进一步提高的效果。若以线性多聚体结构制备构成连接反应(coupled reaction)的异种酶，则相比于通过沟道效应(channeling effect)在块混合的状态，呈现出总反应效率得到提高的协同效果。并且，可通过酶反应将目的生物分子-泛素C-末端标签粘结在固定相，因此，无需纯化并分离生物分子-泛素C-末端标签。因此，在如细胞溶解物或培养基(culture media)的包含生物分子-泛素C-末端标签的粗混合物(crude-mixture)合成并固定线性多聚体结构。因此，可经济性地制备固定化酶。

附图说明

图1简要示出制备本发明的线性多功能性多聚体融合蛋白质(Ubstac)的过程。

图2及图3示出确认通过本发明的线性多功能性多聚体融合蛋白质反应形成的多聚体形态的泛素C-末端标签融合蛋白质的结果。

图4简要示出本发明的线性多功能性多聚体融合蛋白质的制备及使其固定化并利用的过程。

图5示出仅利用E1-E2的线性多功能性多聚体融合蛋白质制备结果。

图6简要示出本发明的线性多功能性多聚体融合蛋白质的制备及使其固定化并利用的过程。

图7简要示出头接尾(Head-to-tail)泛素C-末端标签及线性多功能性多聚体融合蛋白质方法。

图8为利用凝胶渗透色谱(GPC，Gel Permeation Chromatography)纯化根据本发明制备的木糖还原酶(Xylose Reductase，XR)后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认的结果。

图9为利用凝胶渗透色谱纯化根据本发明制备的草酰乙酸脱羧酶(Oxaloacetatedecarboxylase，OAC)后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认的结果。

图10为利用凝胶渗透色谱纯化根据本发明制备的木糖醇脱氢酶(Xylitoldehydrogenase，XDH)后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认的结果。

图11为利用凝胶渗透色谱纯化根据本发明制备的磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomerase，TIM)后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认的结果。

图12为利用凝胶渗透色谱纯化根据本发明制备的丁醛醇酶(Aldolase，ALD)后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认的结果。

图13为利用凝胶渗透色谱纯化根据本发明制备的果糖1,6-二磷酸酶(Fructose1,6-bisphosphatase，FBP)后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认的结果。

图14利用凝胶渗透色谱纯化根据本发明制备的丙酮酸氧化酶(Pyruvateoxidase，POPG)后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认的结果。

图15为分析木糖还原酶活性的结果。

图16为分析木糖还原酶稳定性的结果。

图17为分析草酰乙酸脱羧酶活性的结果。

图18为分析草酰乙酸脱羧酶稳定性的结果。

图19为分析木糖醇脱氢酶活性的结果。

图20为分析木糖醇脱氢酶稳定性的结果。

图21为分析丙酮酸氧化酶活性的结果。

图22示出三个酶，即，磷酸丙糖异构酶、丁醛醇酶以及果糖1,6-二磷酸酶结合的结构的线性多功能性多聚体融合蛋白质产物。

图23示出通过磷酸丙糖异构酶、丁醛醇酶以及果糖1,6-二磷酸酶的协同效果。

图24示出制备蛋白G(Protein A)及蛋白G线性多功能性多聚体复合物并确认其的结果。

图25为制备在泛素C-末端标签的76甘氨酸的c-末端部延伸天门冬氨酸的生长激素(hGH)并确认其的结果。

图26为制备由E3引发的聚合物并确认其的结果。

图27为制备由在以头接尾形态反复连接的泛素C-末端标签的C-末端以延伸为天门冬氨酸的形态表达的生长激素的聚合物并确认其的结果。

图28示出相比于固定蛋白A单体的小珠，对于固定蛋白A聚合物的小珠的人源免疫球蛋白G(IgG)的结合活性得到增加。

图29简要示出分别与泛素的N-末端、C-末端或N-末端及C-末端两者结合的线性多功能性多聚体生物分子聚合物结构的图。

具体实施方式

在本发明的一实施例中，提供一种线性多功能性多聚体生物分子制备方法，其中，包括：(i)从包括原核细胞或真核细胞的宿主细胞重组表达生物分子，上述生物分子与泛素C-末端标签融合或通过衔接物与泛素C-末端标签结合，以及(ii)向上述宿主细胞的溶解物添加用于泛素化的E1、E2及E3酶或者E1及E2酶并进行反应，包含对于互不相同的结合位点分别具有特异性的两个以上的结合部分作为生物分子，上述生物分子与通过两个以上泛素的共价键合形成的聚泛素骨架结合。由此，在本发明中，引发线性多功能性多聚体生物分子聚合物或复合物的形成的引发剂可以为E3、E2、E1、游离泛素或E3的目的底物。其中，上述E2酶可与泛素的第48位或第63位赖氨酸结合，上述E2酶可以为E2-25K泛素结合酶或泛素结合酶复合物Ucb13-MMS2。

在本发明的再一实施例中，提供一种线性多功能性多聚体生物分子聚合物，由聚泛素骨架及生物分子构成，其中，在上述聚泛素骨架中，两个以上的泛素通过如共价键合连接来形成，上述生物分子分别与上述泛素结合。优选地，上述生物分子分别与上述泛素的N-末端结合。引发线性多聚体生物分子聚合物的形成的引发剂可以为E3、E2、E1、游离泛素或底物。并且，上述线性多聚体生物分子聚合物可由两个至二十个生物分子构成。

以下，通过实施例更加详细地说明本发明。这些实施例仅用于具体说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对本领域普通技术人员而言是显而易见的。

实施方式

委托Genscript Inc.公司制备在本发明的实施例中使用的对泛素C-末端标签(Ubiquitin C-terminal Tag)(序列：1)蛋白质融合体进行编码的基因。

为了制备在C-末端不包含泛素标签的Ub out基因结构物，使用快速克隆系统(fast cloning system)(Li C,Wen A,Shen B,Lu J,Huang Y,Chang Y(2011).Fastcloning:a highly simplified,purification-free,sequence-and ligation-independent PCR cloning method.BMC Biotechnol 11,92.)。该方法为如下的技术：在没有限制酶及结合酶的条件下，若对聚合酶链式反应(PCR)产物直接仅处理Dpn1，则Dpn1与聚合酶一同通过目前未查明的机制起到限制酶及结合酶的作用来可连接基因(插入、去除或取代)。在此方法中，使用以两末端与融合聚合酶(Phusion polymerase，Thermo FisherScientific)重叠的方式设计的引物，在除所要删除的区域之外的所有载体上，执行聚合酶链式反应(95℃的温度条件下3分钟，95℃的温度条件下15秒钟，-55℃的温度条件下1分钟，-72℃的温度条件下1分钟/kb，反复18次，72℃的温度条件下5分钟，12℃的温度条件下20分钟)。之后，在37℃的温度条件下对聚合酶链式反应产物进行1小时的Dpn1处理，在大肠杆菌(E.coli)DH5α(Novagen)转化后获取所要的质粒。通过商业脱氧核糖核酸测序确认所有基因构成物。

为了与泛素C-末端标签融合蛋白质表达，在大肠杆菌BL21 DE3(Novagen)(木糖还原酶、磷酸丙糖异构酶、丁醛醇酶)、Rosetta pLysS DE3(Novagen)(木糖醇脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶)、Origami2 DE3(Novagen)(果糖1,6-二磷酸酶)菌株转化各个基因构成物。在37℃的温度条件下，在LB培养基(Miller)培养包含蛋白质表达质粒(pET21a，Genscript)的细胞。若OD

表1

在本发明中，将用于制备线性多功能性多聚体形态的融合蛋白质的反应分别命名为线性多功能性多聚体融合蛋白质反应。在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES(Sigma-aldrich)，pH值为7.5，50mM的NaCl,，4mM的MgCl

表2

在室温条件下摇动1小时来执行线性多功能性多聚体融合蛋白质反应。图1简要示出本发明的线性多功能性多聚体融合蛋白质反应，图2及图3示出确认通过线性多功能性多聚体融合蛋白质反应形成的多聚体形态的泛素C-末端标签融合蛋白质的结果。

在图4中，第一图为简要示出如图1所示，使标记泛素C末端的酶与线性多功能性多聚体融合蛋白质混合物进行反应后，进行过滤(filtration)来制备线性多功能性多聚体融合蛋白质线性酶聚合物的过程的图。第二图为示出所包含标记在泛素C末端的酶与线性多功能性多聚体融合蛋白质混合物进行反应后，与交联剂(crosslinker)一同沉淀(precipitation)来制备线性多功能性多聚体融合蛋白质酶凝聚体(aggregate)的过程的图。第三图为简要示出将标记在泛素C末端的蛋白质固定在基质或小珠上的过程的图。

利用E2-25K(GenBank ID-U58522.1)(人(human)E2)、Ucb13(酵母(yeast)E2)-MMS2(GenBank ID-U66724.1)(酵母泛素结合酶变体(yeast ubiquitin-conjugatingenzyme variant))(GenBank ID-U66724.1)来制备E2-线性多功能性多聚体融合蛋白质。委托Genscript公司合成重组脱氧核糖核酸质粒(plasmid)。在E2-线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(50mM的Tris，pH值为8.0，5mM的MgCl

在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES，pH值为7.5，50mM的NaCl，4mM的MgCl

在添加还原型辅酶Ⅰ及木糖来开始进行反应之前，在指定的pH值条件下，对木糖还原酶单体及线性多功能性多聚体融合蛋白质聚合物两者均进行30分钟的处理。如图16所示，在pH值为5.5及6.5的条件下，相比于没有泛素-标签的单体木糖还原酶，木糖还原酶线性多功能性多聚体融合蛋白质聚合物示出显著提高的稳定性。结果表示三次实验的平均值。

参与葡萄醣生成作用(gluconeogenesis)的草酰乙酸脱羧酶与谷丙转氨酶(AST)-谷草转氨酶(ALT)一同用于检查肝损伤。在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES，pH值为7.5，50mM的NaCl，4mM的MgCl

在添加还原型辅酶Ⅰ及草酰乙酸(oxaloacetate)来开始进行反应之前，在指定的pH值条件下，对草酰乙酸脱羧酶单体及线性多功能性多聚体融合蛋白质聚合物两者均进行30分钟的处理。如图18所示，在pH值为4.5～6.5的低pH的条件下，相比于没有泛素-标签的单体草酰乙酸脱羧酶(OAC Ub out)，草酰乙酸脱羧酶线性多功能性多聚体融合蛋白质聚合物示出显著提高的pH稳定性。结果表示三次实验的平均值。

木糖醇脱氢酶为属于D-木糖分解代谢(D-Xylose catabolism)途径的酶，以使用NAD

在添加NAD

丙酮酸氧化酶为通过检测如作为参与葡萄醣生成作用的酶的谷丙转氨酶-谷草转氨酶的酶来检测肝损伤而周知。为了分析丙酮酸氧化酶活性，首先，在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES，pH值为7.5，50mM的NaCl，4mM的MgCl

磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase，TIM)、丁醛醇酶(fructosebisphosphate aldolase，ALD+及果糖1,6-二磷酸酶(fructose bisphosphatase，FBP)以形成串联反应而周知，上述串联反应从二氢丙酮磷酸(DHAP，dihydroxyacetone phosphate)生成6-磷酸果糖(F6P)作为最终产物。通过测定6-磷酸果糖(Fructose-6-Phosphate，F6P)、磷酸丙糖异构酶生成物、丁醛醇酶及果糖1,6-二磷酸酶复合物来分析线性多功能性多聚体融合蛋白质酶协同效果。6-磷酸果糖通过磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase，PGI)异构化为6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-phosphate，G6P)，作为底物相同量的NAD

首先，根据本发明的制备例，合成了标记泛素C末端的生物分子。之后，使包含羟胺(hydroxylamine)的聚合物(聚乙二醇(polyethylene glycol))与上述生物分子进行反应。结果，经确认，聚合物通过肟键(oxime linkage)被泛素标记(未示出结果)。

在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES，pH值为7.5，50mM的NaCl，4mM的MgCl

为了泛素C-末端标签融合医药品用蛋白质的过表达，在大肠杆菌BL21DE3(Novagen)菌株转化各个基因构成物。在本实施例中，利用生长激素(序列：18)作为蛋白质。在37℃的温度条件下，在LB培养基(Miller)培养包含蛋白质表达质粒(pET21a，Genscript)的细胞。若OD

在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES，pH值为7.5，50mM的NaCl，4mM的MgCl

如图27所示，在去泛素化酶一同存在的条件和去除去泛素化酶的条件下，对生长激素(序列：18)的线性多功能性多聚体融合蛋白质反应进行比较。在此情况下所使用的生长激素在C-末端以头接尾形态反复连接两个泛素标签，其泛素标签的C-末端呈延伸为天门冬氨酸的形态。因此，若不利用去泛素化酶切割泛素标签C-末端的天门冬氨酸，则不发生线性多功能性多聚体融合蛋白质反应。在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES，pH值为7.5，50mM的NaCl，4mM的MgCl

在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES，pH值为7.5，50mM值为NaCl，4mM值为MgCl

利用N-末端与生长激素(序列：18)结合的供体泛素以及N-末端与生长激素(图29的(a)部分)、C-末端与生长激素(图29的(b)部分)、N-末端及C-末端分别与sumo(序列：19)和生长激素结合的(图29的(c)部分)受体泛素来确认线性多功能性多聚体融合蛋白质二聚体(dimer)的形成。使用的受体泛素为第73位亮氨酸被脯氨酸取代且除第48位(图29的(c)部分)或第63位(图29的(a)部分、(b)部分)赖氨酸之外的剩余赖氨酸被精氨酸取代的形态，C-末端延伸为天门冬氨酸或生物分子(生长激素)的形态。在线性多功能性多聚体融合蛋白质缓冲液(25mM的HEPES，pH值为7.5，50mM的NaCl，4mM的MgCl

产业上的可利用性

本发明涉及利用参与生物体内泛素-蛋白酶体蛋白质降解的E1-E2-E3系统来制备在体外以泛素C-末端标签(UCT)-生物分子为单位的线性多聚体生物分子聚合物的方法及通过这种方法制备的线性多聚体生物分子聚合物。如上所述，本发明的线性多聚体生物分子聚合物及制备其的方法可在固定化蛋白质的生产、需要物质的分离纯化及分析的产业领域及医疗领域广泛利用。