一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种生物碳‑玫烟色虫草纳米粒子及其制备方法和应用。本发明提供了一种生物碳‑玫烟色虫草纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：S1.将玫烟色虫草的孢子悬浮液接种到发酵培养液中，震荡培养48～72h，得到菌丝体；S2.将步骤S1得到的菌丝体于灭菌蒸馏水中，震荡培养48～72h，得到分生孢子滤液；S3.在步骤S2所得分生孢子滤液加入生物碳，孵育24～96h，即得所述生物碳‑玫烟色虫草纳米粒子。该纳米粒子的纯度高，对粉虱科害虫有显著的防治效果，同时可减少玫烟色虫草的菌种使用量，兼具低毒、抗药性低的特点，有利于延缓粉虱科害虫抗药性的发生和发展，在粉虱科害虫的生物防治中具有非常强的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明属于生物农药防治技术领域。更具体地，涉及一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术

纳米技术的使用可以通过生产具有广泛应用范围的新产品/纳米粒子来改变农业和食品工业的未来。纳米粒子可能发生在不同的颗粒系统(单体、寡聚体或多聚体)中，具有特定的尺寸和独特的物理特性(例如均匀性和电导)，使它们可以作为生物科学研究的材料。纳米粒子已应用于农业部门，用于提高土壤肥力、控制杂草、保护植物免受昆虫和疾病的侵害等不同目的。纳米粒子有多种不同的使用方式，可以作为工具有效的害虫管理。将农药纳米封装到活性农药化合物的纳米分子中具有不同的优势，例如可以保护活性成分免于降解，提高功效并将农药施用量减少到至少比传统制剂减少10～15倍。

昆虫病原真菌被认为是一个多世纪以来作为生物防治不同昆虫的潜在制剂。玫烟色虫草是一种我们已知的昆虫病原，已被商业化用于防治不同的害虫。在有利条件下，玫烟色虫草菌可显著降低害虫种群数量；除了其防效好和较低的生产成本外，使用玫烟色虫草还具有其他优点，如杀虫活性、多样化的宿主范围以及对人类和其他非靶标生物安全性。然而，玫烟色虫草的杀虫周期长、受环境因素影响大。生物碳是在氧气供应减少的情况下，通过生物质热分解产生的丰富碳来源。生物炭的物理性质(多孔结构、高比表面积和丰富的含氧官能团，如羟基和羧基在其表面)以及低生产成本，使其成为生产纳米粒子的合适材料。

纳米技术是一种新技术，在不同的领域起着至关重要的作用，如医学、工程、电子、医药、农业和食品工业。纳米颗粒具高强度靶标特性，从农业角度来看，纳米技术的应用，特别是纳米材料的使用，在促进害虫管理方法发展方面有很大的潜在应用价值。纳米生物碳(nZVI)是粒径1～100nm的生物碳颗粒，具有极小的颗粒尺度以及由此产生的大比表面积，进而表现出了高的氧化-还原电位，可以还原多种卤代有机污染物、高价重金属离子、无机污染物(如硝酸/亚硝酸盐)等。目前，通常将纳米生物碳用于环境重金属修复和污染物降解等(如公开号为CN110468054A、公开日为2019年11月19日的中国发明专利)，尚未见将纳米生物碳用于生物防治的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子及其制备方法和应用。本发明有效地解决了玫烟色虫草杀虫速度慢且药效不明显的问题，生物碳和玫烟色虫草纳米粒子具有显著的协同增效作用，制备得到的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子纯度高、活性强，在降低了玫烟色虫草的使用量的同时显著提高了玫烟色虫草的防治效果和稳定性。

本发明的目的是提供一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备方法。

本发明另一目的是提供所述方法制备得到的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子。

本发明另一目的是提供所述生物碳-玫烟色虫草纳米粒子在防治粉虱科害虫或制备粉虱科害虫防治制剂中的应用。

本发明另一目的是提供一种粉虱科害虫防治制剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1.将玫烟色虫草的孢子悬浮液接种到发酵培养液中，震荡培养48～72h，得到菌丝体；

S2.将步骤S1得到的菌丝体于灭菌蒸馏水中，震荡培养48～72h，得到分生孢子滤液；

S3.在步骤S2所得分生孢子滤液加入生物碳，孵育24～96h，即得所述生物碳-玫烟色虫草纳米粒子。

优选地，所述玫烟色虫草为虫生真菌玫烟色棒束孢SP535，该菌株已于2018年12月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO:60514，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

优选地，步骤S1所述玫烟色虫草的孢子悬浮液的浓度为1×10

更优选地，步骤S1所述玫烟色虫草的孢子悬浮液的浓度为1×10

优选地，步骤S3所述生物碳为纳米碳粉。

优选地，所述纳米碳粉的粒径为60～80nm。

优选地，步骤S3所述分生孢子滤液和生物碳的质量体积比为0.1g：50～100mL。

更优选地，步骤S3所述分生孢子滤液和生物碳的质量体积比为0.1g：50mL。

优选地，步骤S1和步骤S2所述震荡培养的条件为：温度24℃～26℃，转速120～180rpm/min。

更优选地，步骤S1和步骤S2所述震荡培养的条件为：温度25℃，转速150rpm/min。

更优选地，步骤S1和步骤S2所述震荡培养的时间为60h。

优选地，步骤S3所述孵育的时间为24～72h。孵育的时间可以为24h、36h、48h、60h、72h等。

更优选地，步骤S3所述孵育的时间为72h。

优选地，步骤S1所述发酵培养液为沙氏琼脂培养基。

更优选地，所述沙氏琼脂培养基的制备方法为：葡萄糖20g，蛋白胨5g，加蒸馏水定容至1L，121℃高温灭菌15min。

优选地，步骤S1所述玫烟色虫草的孢子悬浮液的制备方法为：挑取玫烟色虫草的成熟孢子在PDA平板上培养，24℃～26℃活化7～10d；将孢子冲洗下来，用力震荡3～5min，即得。

更优选地，步骤S1所述玫烟色虫草的孢子悬浮液的制备方法为：挑取玫烟色虫草的成熟孢子在PDA平板上培养，25℃活化8d；将孢子冲洗下来，用力震荡4min，即得。

本发明研究发现，生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱等粉虱科害虫的二龄幼虫、三龄幼虫和蛹均显示出较高的致病性；因此，所述方法制备得到的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子，及其在防治粉虱科害虫或制备粉虱科害虫防治制剂中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述粉虱科害虫为烟粉虱。

本发明还提供了一种粉虱科害虫防治制剂，包括所述生物碳-玫烟色虫草纳米粒子。

在所述防治制剂中，起杀虫作用的主要是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子，可以根据需要配以辅剂进行制备。

本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地采用生物碳与玫烟色虫草联合制备得到生物碳-玫烟色虫草纳米粒子，玫烟色虫草在生物碳离子的介导作用下形成高效、绿色环保的纳米粒子生物农药，产生了显著的协同增效作用，其中的玫烟色虫草作为一种活体生物农药，具有对环境无污染、无残留等特点；与传统的真菌孢子粉相比，本发明制备得到的纳米粒子生物农药具有更高效，孢子在环境中存活时间更长、更稳定，对环境更友好等特点，经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，该生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对粉虱科害虫有显著的防治效果，在粉虱科害虫的生物防治中具有非常强的应用潜力。

本发明制备的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的粒径为350～400nm，纯度高、活性强，且制备方法简便快速，对粉虱科害虫尤其是烟粉虱的防治效果好，同时可减少玫烟色虫草的菌种使用量，兼具低毒、抗药性低的特点，适应了有机食品生产的需求，对环境无污染、无残留，有利于延缓粉虱科害虫抗药性的发生和发展。

附图说明

图1是玫烟色棒束孢SP535的系统发育树。

图2是不同波长下生物碳-玫烟色虫草纳米粒子吸收光谱变化的紫外可视化图。

图3是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的SEM图。

图4是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的EDX光谱分析结果图。

图5是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的XRD图。

图6是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的FTIR图。

图7是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱卵孵化和幼虫死亡率的影响结果图。

图8是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱若虫的致病性结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1玫烟色虫草的孢子悬浮液的制备

玫烟色虫草为虫生真菌玫烟色棒束孢SP535，保存于华南农业大学教育部生物防治工程研究中心，最初由被侵染的蝽象属虫体上分离而来，于2018年12月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO:60514，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

(1)菌种的鉴定：已纯化的菌种用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取其DNA，用PCR仪扩增其核糖体内转录间隔区基因(ITS)，得到的基因在NCBI中比对到Cordycepsfumosorosea，用MEGA7采用邻接法构建系统发育树。

注：Ryan M.Kepler等2017年基于系统发育将虫草科(Cordycipitaceae)重新归类、命名，将Isaria fumosorosea归类于虫草科，命名为Cordyceps fumosorosea。

玫烟色棒束孢SP535的系统发育树如图1所示，经过对上述玫烟色棒束孢SP535的形态学特征、生理生化特性及ITS基因序列的鉴定及分析，证实该菌株属于玫烟色虫草(Cordyceps fumosorosea)。

(2)菌种的活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PDA平板上培养，25±1℃活化7～10d，用灭菌蒸馏水加入平板中，将孢子冲洗下来，用力震荡3～5min，制成玫烟色虫草的孢子悬浮液(种子)，血球计数法计算孢子浓度，待用。

发酵培养液(沙氏琼脂培养基)为：葡萄糖20g，蛋白胨5g，加蒸馏水定容至1L，121℃高温灭菌15min。

实施例2生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备

一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1.将5mL浓度为1×10

S2.摇床结束后，收集菌丝体，将菌丝体加入到100mL灭菌蒸馏水中，摇床转速150rpm/min，25℃条件下培养72h；

S3.摇床结束后，收集分生孢子滤液，向50mL分生孢子滤液中加入0.1g纳米碳粉(粒径为70nm)，孵育72h后收取样品，得到生物碳-玫烟色虫草纳米粒子；

其中，步骤S1中玫烟色虫草的孢子悬浮液的制备方法为：挑取玫烟色虫草的成熟孢子在PDA平板上培养，25℃活化8d；将孢子冲洗下来，用力震荡4min，即得。

实施例3生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备

一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1.将5mL浓度为1×10

S2.摇床结束后，收集菌丝体，将菌丝体加入到100mL灭菌蒸馏水中，摇床转速180rpm/min，26℃条件下培养72h；

S3.摇床结束后，收集分生孢子滤液，向50mL分生孢子滤液中加入0.1g纳米碳粉(粒径为60nm)，孵育24h后收取样品，得到生物碳-玫烟色虫草纳米粒子；

其中，步骤S1中玫烟色虫草的孢子悬浮液的制备方法为：挑取玫烟色虫草的成熟孢子在PDA平板上培养，26℃活化7d；将孢子冲洗下来，用力震荡3min，即得。

实施例4生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备

一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1.将5mL浓度为1×10

S2.摇床结束后，收集菌丝体，将菌丝体加入到100mL灭菌蒸馏水中，摇床转速120rpm/min，24℃条件下培养48h；

S3.摇床结束后，收集分生孢子滤液，向100mL分生孢子滤液中加入0.1g纳米碳粉(粒径为80nm)，孵育42h后收取样品，得到生物碳-玫烟色虫草纳米粒子；

其中，步骤S1中玫烟色虫草的孢子悬浮液的制备方法为：挑取玫烟色虫草的成熟孢子在PDA平板上培养，24℃活化7d；将孢子冲洗下来，用力震荡3min，即得。

实施例5生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备

一种生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1.将5mL浓度为1×10

S2.摇床结束后，收集菌丝体，将菌丝体加入到100mL灭菌蒸馏水中，摇床转速180rpm/min，26℃条件下培养72h；

S3.摇床结束后，收集分生孢子滤液，向50mL分生孢子滤液中加入0.1g纳米碳粉(粒径为60nm)，孵育96h后收取样品，得到生物碳-玫烟色虫草纳米粒子；

其中，步骤S1中玫烟色虫草的孢子悬浮液的制备方法为：挑取玫烟色虫草的成熟孢子在PDA平板上培养，26℃活化10d；将孢子冲洗下来，用力震荡5min，即得。

实施例6生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的表观形状

1、实验方法

测试本发明实施例2制备得到的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子在200nm、300nm、400nm、500nm、600nm处的吸光值，并对生物碳-玫烟色虫草纳米粒子进行扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)、EDX光谱分析、傅氏转换红外线光谱分析(FTIR)。

2、实验结果

不同波长下生物碳-玫烟色虫草纳米粒子吸收光谱变化的紫外可视化图如图2所示，可以看出，在不同时间间隔内得到的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的紫外吸收光谱有一个恒定的还原，其比表面等离子体吸收带在350～400nm范围内。

生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的SEM图如图3所示，可以看出，生物碳颗粒在玫烟色棒束孢SP535分生孢子表面具有明确的粘附，说明生物碳-玫烟色虫草纳米粒子已经成功合成。

生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的EDX光谱分析结果图如图4所示，可以看出，特征峰为0.2KeV和0.6KeV。

生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的XRD图如图5所示，可以看出，衍射强度记录在2θ角为10°至80°，目标是波长为

生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的FTIR图如图6所示，可以看出，该生物碳-玫烟色虫草纳米粒子在3429.01、1703.14、1621.85、1384.29、1101.87、798.96、559.71、468.96处均有吸收峰位，区域为4000到400cm

综上所述，玫烟色虫草在生物碳离子的介导作用下形成的高效、绿色环保的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的纯度高，与传统的真菌孢子粉相比，本发明制备得到的纳米粒子生物农药具有更高效，孢子在环境中存活时间更长更稳定，对环境更友好等特点。

实施例7生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对粉虱科害虫的防治效果测定

1、实验方法

(1)利用实施例2中孵育72h后制备得到的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子、实施例2中制备的玫烟色虫草的孢子悬浮液、0.01％吐温80配制出T1～T7试剂(T1～T7试剂及其孢子浓度如表1所示)。

表1 T1～T7试剂及其孢子浓度(ppm)

(2)把T1～T5试剂设为试验组，T6试剂作为阳性对照组，T7试剂作为空白对照组；室内毒力测定时，以茄子作为供试植物，其盆栽苗育于养虫笼中，将烟粉虱成虫接入养虫笼，待其产卵一天后将其全部赶出，笼内保持26℃的温度和14：10的光照，待茄子叶片上的烟粉虱发育至二龄、三龄若虫和蛹时，采用浸渍法进行毒力测验，重复3次，每个重复包含4个叶片，每个叶片50头粉虱若虫，每天记录烟粉虱死亡情况。

(3)连续观察7天烟粉虱虫卵的孵化率及孵化后幼虫的死亡状况和二龄、三龄、蛹的死亡率，计算校正死亡率、致死中浓度(LC50)和最高浓度500ppm下致死中时间(LT50)。

2、实验结果

(1)生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱卵孵化和幼虫死亡率的影响

生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱卵孵化和幼虫死亡率的影响结果如图7所示，其中，(A)图是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱卵孵化的影响结果，由(A)图可以看出，对烟粉虱施用7天后，不同处理和对照的卵孵化率(％)有显著差异(F6，14＝36.64；p<0.001)，在T7(对照)下，烟粉虱的卵孵化率最高(％)，而在T5(生物碳-玫烟色虫草纳米粒子50ppm)下，卵孵化率最低(％)；(B)图是生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱幼虫死亡率的影响结果，由(B)图可以看出，不同处理的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱施用7天后幼虫死亡率有显著影响(F6，14＝32.81；P<0.001)，幼虫死亡率在T5(生物碳-玫烟色虫草纳米粒子50ppm)浓度下最高，而T7(对照)的幼虫死亡率(％)最低，并且T5(10ppm)生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对孵化幼虫的毒力已经显著高于T6(100ppm)玫烟色棒束孢SP535的孢子悬浮液。

(2)生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱的致病性

生物碳-玫烟色虫草纳米粒子对烟粉虱若虫的致病性结果如图8所示，可以看出，烟粉虱(2龄若虫、3龄若虫和蛹)的死亡率呈剂量依赖性增加，二龄若虫死亡率最高(96.84％)，最高浓度的生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的二龄、三龄和蛹期累积死亡率分别为96.84％、93.27％和82.74(50ppm)，第二龄、第三龄和蛹期7天后最低纳米粒子浓度(5.0ppm)的累积死亡率分别为20.49％、19.87％和12.16％，且生物碳-玫烟色虫草纳米粒子的毒力显著高于玫烟色虫草的孢子悬浮液，说明生物碳和玫烟色棒束孢SP535在防治烟粉虱中具有显著的协同增效作用。

生物碳-玫烟色虫草纳米粒子处理烟粉虱若虫的LC

表2生物碳-玫烟色虫草纳米粒子处理烟粉虱若虫的LC

生物碳-玫烟色虫草纳米粒子(50ppm)处理烟粉虱的LT

表3生物碳-玫烟色虫草纳米粒子(50ppm)处理烟粉虱的LT50值

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。