绿僵菌的杀蚜潜力评价与球孢白僵菌、绿僵菌及玫烟色拟青霉的孢子疏水性相关特征的解析及利用

摘要

白僵菌、绿僵菌和拟青霉等常见丝孢类昆虫病原真菌是害虫微生物防治的重要资源。菌株分生孢子对靶标害虫的毒力以及孢子疏水特性是孢子制剂研制中要考虑的两个重要因素。前者决定真菌制剂的生防潜力，后者决定孢子对昆虫体壁的吸附，并影响孢子的水相分散效果。本研究评价了23株绿僵菌对桃蚜(Myzus Persicae)的生防潜力，筛选出一批高效杀蚜菌株；系统测定了球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、绿僵菌(Metarhizium spp.)和玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)的48个菌株的分生孢子疏水性，揭示了孢子大小、孢壁疏水蛋白含量与孢子疏水性之间的关系，提出了在孢子悬乳剂设计中根据孢子疏水性优化孢子制剂配方和应用效果的策略。主要内容和结果分述如下：
　　 绿僵菌对桃蚜的毒力测定挑选地理和寄主来源不同的23株绿僵菌株，包括金龟子绿僵菌M anisopliae，金龟子绿僵菌金龟子变种M anisopliae var. anisopliae，金龟子绿僵菌蝗变种M anisopliae var. acridum，金龟子绿僵菌大孢变种M anisopliae var。majus及黄绿绿僵菌小孢种M flavoviride var. minus，对桃蚜Myzus Persicae进行平均为11.5、99和1179个孢子/mm2的低、中、高剂量处理的生物测定，每处理3次重复，每重复为甘蓝叶片上的成蚜40～50头，对照为含0.02％吐温80。采用标准喷塔法接种，接种后的桃蚜饲养于培养箱(21±1℃，14L:10D)中逐日观察8天，所获数据经时间一剂量-死亡率模型模拟分析。结果表明，所有供试菌株对桃蚜都有致病性，高接种剂量下的累计死亡率为0.8～95.3％。其中的10株绿僵菌在高剂量下的死亡率超过50％。根据模型模拟产生的剂量效应和时间效应参数计算出这些菌株对桃蚜的致死中剂量LCso和致死中时LT50，有6株绿僵菌表现理想的杀蚜活性，第5天的LC50为23～189个孢子/mm2，第8天为8～93个孢子/mm2。各菌株对桃蚜的LT50随接种剂量增加而下降。在200个孢子/mm2的剂量下，6株高毒力菌株的LT50在5天以内；而在600个孢子/mm2的剂量下，各菌株的LT50收敛至4天以内。此外，对供试菌株蚜尸显症率的观察发现，此6株菌致死的蚜尸有80％以上都产生大量分生孢子，显示出较佳的流行潜力。这是关于绿僵菌对蚜虫生防潜力的首次评价。
　　 孢子疏水性与孢子大小的关联在改良的水/油分层体系中评价了48株绿僵菌、球孢白僵菌和玫烟色拟青霉的疏水率Hi，疏水率变化范围在59.7～92.2％，不同菌种或同一菌种的不同菌株间均存在显著差异。平均疏水率在绿僵菌高达83.3％，白僵菌为78.6％，拟青霉为72.5％。所有菌株的单孢表面积也存在极显著差异，7.9～25.3μm2不等。其中，绿僵菌的平均单孢表面积(Sa)为14.4±3.8μm2，显著大于球孢白僵菌的10.1±1.1μm2和玫烟色拟青霉的9.0±0.9μm2，而后两者之间差异不显著。相关性分析显示，48株菌的Hi与Sa之间显著正相关(r2=0.55)，说明不同菌株间孢子疏水率变异的55％可归因于其孢子大小的不同。孢子表面积与孢子密度之间呈显著的逆相关(r2=0.95)，表明等重的不同菌株孢子粉的含孢量因孢子大小而异，是孢子制剂设计中需要考虑的重要因素。
　　 孢子疏水性与三氟乙酸可溶孢壁蛋白含量的关联选择6株孢子大小和疏水率均具代表性的菌株，将其分生孢子分别用煮沸2％ SDS、甲酸(FA)冰浴和三氟乙酸(TFA)冰浴进行分步抽提。抽提物经SDS-PAGE电泳分析显示，TFA可溶蛋白组份明显有别于SDS和FA抽提且可溶的孢壁蛋白组份，其蛋白条带稀少，分子量为10～14 kDa。经扫描电镜观察和疏水率检测发现，孢壁表面疏水蛋白组成的短棒层的消失，仅发生在TFA抽提(绿僵菌)或FA抽提(白僵菌和拟青霉)之后，且孢壁短棒层的消失伴随着孢子疏水性的巨降。由于白僵菌和拟青霉孢子的FA抽提物中沉淀经TFA进一步处理后才溶于2％ SDS，且白僵菌的TFA解离物与其已知疏水蛋白Hydl(13.81 kDa)和Hyd2(11.98 kDa)的多克隆抗体呈阳性反应，由此推测三种菌的三氟乙酸可溶(TFAS)的孢壁蛋白组份就是孢壁疏水蛋白，而绿僵菌和玫烟色拟青霉的TFAS蛋白是未见报道的孢壁疏水蛋白。
　　 上述TFAS孢壁蛋白的含量在6株菌间差异极显著，范围为21.5～91.9μg/mg孢子，剔除孢子大小的影响，换算为2.7～44.8μg/107个孢子，菌株间差异也极显著。所测菌株的孢子疏水率与剔除孢子大小影响的TFAS蛋白含量显著正相关(r2=0.79)，显示孢子疏水率变异的79％归因于菌株TFAS蛋白即孢子疏水蛋白的含量不同。因此，孢壁疏水蛋白含量是决定孢子疏水率的关键因素。
　　 孢子悬乳剂的水相分散率与孢子疏水性的关联将6株孢子大小和疏水率不同的分生孢子粉悬浮于由2.0～5.5％乳化剂AE0-3和94.5～98.0％液体石蜡组成的乳油中，配成标准浓度为1×1010个孢子的悬乳剂，用水稀释100倍后，测定不同浓度乳化剂配方中的孢子水相分散力。结果显示，稀释液中各菌株的孢子分散力均呈现随乳化剂浓度的提高而上升的趋势。在同一乳化剂浓度下，不同菌株间的孢子分散力差异极显著。在高浓度乳化剂(5.5％)作用下，孢子疏水性偏低的菌株(Pf6032、Bb2860和Pf3076)在水相中的孢子分散力均超过50％，能满足田间害虫防治的常规喷雾需要。其中，Pf6032的孢子分散力最佳，几近100％；而一株金龟子绿僵菌大孢变种(Mam978)的孢子分散率最低，仅6.1％。
　　 各菌株不同配方悬乳剂的100倍稀释液中的孢子分散力随乳化剂浓度变化的趋势，很好地拟合逻辑斯蒂方程(0.93≤r2≤0.99，P<0.0001)。其中，拟合参数中的孢子分散速率rd与所测6株菌的孢子疏水率之间显著逆相关(r2=0.94)，说明疏水性的高低决定了孢子分散速率变化的94％。这一结果表明，疏水性越高的菌株，其悬乳剂的乳化效果越差，孢子越难被分散到水中，需要更高比例的乳化剂才能保证相间应用效果。
　　 综上所述，本研究的主要结果，一是筛选出了高效杀蚜的绿僵菌菌株，为重新认识绿僵菌对蚜虫的生防潜力提供了新的依据。二是建立了适合生防真菌的分生孢子疏水性测定方法，并发现孢子大小对其疏水性的关联性状。三是发现菌株TFAS孢壁蛋白的含量是决定其孢子疏水性的关键指标，可用于以孢子疏水性为目标的生防菌株筛选，根据所有研究结果推断这类蛋白就是孢壁疏水蛋白。四是首次从孢子悬乳剂配方优化的角度，证明利用孢子疏水性改进孢子制剂配方的重要意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1 生防真菌的分生孢子生物学研究及应用现状

1.1生防真菌制剂防治刺吸式口器害虫的现状

1.2丝孢类生防真菌的剂型生物学

1.2.1分生孢子粉生产

1.2.2分生孢子剂型

1.2.3孢子制剂的生防效果评价

1.3丝孢类真菌孢壁疏水性研究

1.3.1真菌疏水性

1.3.2疏水性测定

1.4真菌胞壁疏水蛋白

1.4.1疏水蛋白概况

1.4.2疏水蛋白结构生物学

1.4.3疏水蛋白分子生物学

1.4.4疏水蛋白的自动装配

1.4.5疏水蛋白的生物学功能

1.4.6丝孢类生防真菌的疏水蛋白

1.5展望

2 不同寄主及地理来源的绿僵菌株对桃蚜的毒力比较

2.1材料与方法

2.1.1菌种来源

2.1.2孢子粉生产

2.1.3供试桃蚜

2.1.4生物测定

2.1.5数据分析

2.2结果与分析

2.2.1生测概况

2.2.2时间-剂量-死亡率模型模拟

2.2.3半致死剂量LC50和致死中时LT50

2.3讨论

3生防真菌孢壁疏水性与孢子表面积以及毒力的关联分析

3.1材料与方法

3.1.1菌种来源及孢子粉制备

3.1.2分生孢子疏水性测定

3.1.3分生孢子大小测定

3.1.4分生孢子密度测定

3.1.5数据分析

3.2结果与分析

3.2.1不同菌株孢子的疏水率

3.2.2不同菌株的孢子大小

3.2.3孢子大小与疏水率的相关性

3.2.4不同菌株的孢子密度与孢子大小的相关性

3.2.5孢子疏水率与毒力的相关性

3.3讨论

4生防真菌孢壁蛋白及其结构与孢子疏水性的关联

4.1材料与方法

4.1.1菌种来源及孢子粉制备

4.1.2孢壁蛋白的提取与含量测定

4.1.3孢壁蛋白电泳分析

4.1.4孢壁蛋白分步抽提后的孢子疏水性测定

4.1.5蛋白抽提样品的Western杂交

4.1.6扫描电镜和透射电镜分析

4.1.7数据分析

4.2结果与分析

4.2.1不同菌株孢壁蛋白组份分析以及疏水蛋白的确定

4.2.2不同菌株孢壁蛋白分步抽提后的分生孢子结构变化

4.2.3孢壁蛋白分步抽提后的分生孢子疏水率变化及其与TFAS蛋白含量的相关性

4.3讨论

5生防真菌孢子悬乳剂的水相分散率与孢子疏水性的关联

5.1材料与方法

5.1.1菌种来源及孢子粉制备

5.1.2乳化剂与载体油

5.1.3孢子悬乳剂及其分散力测定

5.1.4数据处理

5.2结果与分析

5.2.1孢子悬乳剂在乳化剂梯度浓度下的孢子分散力

5.2.2孢子疏水性与悬乳剂对孢子分散力的相关性

5.3讨论

6讨论与展望

参考文献