一种基于二代测序技术在属水平实现蓝藻绝对定量的方法

摘要

本发明公开了一种基于二代测序技术在属水平实现蓝藻绝对定量的方法，涉及蓝藻绝对定量相关领域，通过向样品中添加人工合成DNA内参，同时对蓝藻门下各属的16S rRNA基因拷贝数进行矫正，从而实现在属水平对蓝藻群体的准确绝对定量，揭示出蓝藻菌群结构的真实变化。包括如下步骤：S1：合成P‑Spikes序列，克隆至质粒pMA‑T，将质粒导入大肠杆菌；S2：将已知量的P‑Spikes加入到环境样品，DNA提取，PCR扩增，反应完成琼脂糖凝胶电泳检测，利用PCR产物纯化试剂盒纯化处理；S3：建库构建，得到环境样品中蓝藻门的45个属的16S rRNA基因拷贝数；S4：对测序结果统计分析，得到P‑Spikes和蓝藻门下各属reads数；S5：利用P‑Spikes和蓝藻门下各属reads数，结合蓝藻门的16S rRNA拷贝数得到蓝藻门下各属绝对丰度。

说明书

技术领域

本发明涉及蓝藻绝对定量相关领域，具体为一种基于二代测序技术在属水平实现蓝藻绝对定量的方法。

背景技术

目前，随着社会经济的不断发展，湖泊富营养化和蓝藻水华已经成为全球性的重大环境问题之一。富营养化的湖泊常常暴发水华导致水体透明度和溶解氧下降，并且常常伴有毒素和异味物质的产生，造成水质恶化，破坏水生态系统。另外，水华及其释放的毒素会对水体生态系统、人和畜禽等造成严重危害。尽管很多学者已经从水文气象、营养盐、食物链以及宏基因组等角度开展了大量研究来探索蓝藻水华暴发机制，但是至今仍未完全阐明。在自然界中，蓝藻是以群落的形式存在，蓝藻群落的生态特征分为结构特征和功能特征，其中结构特征描述微生物群落组成、丰度及其在不同环境条件下的更替，而功能特征则描述群落的行为，如底物代谢过程；与宿主、环境或群落内其他成员的相互作用以及对外界干扰的反映等。其中，蓝藻的种群结构及种间相互作用是影响其生态功能的决定因素。因此，检测富营养化水体中蓝藻种群结构组成及其绝对丰度对蓝藻水华的治理及其暴发机制的阐明至关重要。

目前，在蓝藻微生物群落结构组成的研究中，我们常用方法是通过扩增分子标签16S rRNA利用高通量测序技术实现蓝藻群落的相对定量，然而相对丰度无法反映样本中真实的绝对丰度，甚至相对丰度和绝对丰度会存在巨大反差，因此基于样本相对丰度分析可能导致错误的评估。另外，由于每种蓝藻细胞含有一到多个16S rRNA基因拷贝数，扩增后测序会放大这种基数效应，造成物种的序列数产生偏差从而无法确定其真实丰度；因此市场急需研制一种基于二代测序技术在属水平实现蓝藻绝对定量的方法来帮助人们解决现有的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于二代测序技术在属水平实现蓝藻绝对定量的方法，通过向样品中添加人工合成DNA内参，同时对蓝藻门下各属的16S rRNA基因拷贝数进行矫正，从而实现在属水平对蓝藻群体的准确绝对定量，揭示出蓝藻菌群结构的真实变化。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于二代测序技术在属水平实现蓝藻绝对定量的方法，包括如下步骤：

S1：合成P-Spikes序列，克隆至质粒pMA-T中，并将质粒导入至大肠杆菌，表达目的基因，获得目的产物；

S2：将已知量的P-Spikes加入到环境样品中，先进行DNA提取，再PCR扩增，反应完成琼脂糖凝胶电泳检测，并利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化处理；

S3：建库构建，利用测序平台进行高通量测序，得到环境样品中蓝藻门的45个属的16S rRNA基因拷贝数；

S4：对测序结果统计分析，选择Uclust方法并设置阈值97％进行OTUs聚类，并用SILVA_132_release数据库进行注释，最终得到P-Spikes和蓝藻门下各属reads数，每个样品得到10条tags；

S5：利用S4得到的P-Spikes和蓝藻门下各属reads数，并结合蓝藻门的16S rRNA拷贝数得到蓝藻门下各属绝对丰度；

其中，蓝藻门下各属绝对丰度的计算公式为：

AC：属A绝对丰度；

AN：测序结果中属A的reads数；

PC：加入P-Spikes的实际浓度；

PN：测序结果中P-Spikes的reads数；

n：属A16S rRNA基因拷贝数。

优选的，所述S1中，P-Spikes序列的基因序列为CGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCACGTGTCTTGTCCAGAGCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATCCCTTGTCTCCCTACCTCTGGAGGAGAAAAGTGTTGACATGGGCGCTCCCGGCGCAAGGGCCAAAGGAGTCTCCGATTTCTTATTCCCGAATGACATGCGTCTCCCTGCGGGTAAATCACCGACCGCGATTCATAGAAGCCTGGGGGAACAGGTAGGTCTAACTAGCTTAAGAGAGTAAATCCTGGGATCATTCAGTAGTAACCACAAACTTACGCTGGGGCTTCTTCGGCGGATCTTTTACGAGACTGATTATTAGAAACCCTAGTAGTCCGGTACCTGGAGCACAAGACTGGCCTCATGGGCCTTCCGCTCACTGC。

优选的，所述S2中，PCR扩增的引物为：

515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；

806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

优选的，所述S2中，按以下组份配制PCR反应液：

优选的，所述S2中，PCR扩增采用95℃5min，(95℃15s，56℃30s，72℃30s)×25个循环，72℃8min的扩增程序。

优选的，所述S2中，琼脂糖凝胶电泳检测条件为1.5％凝胶+120V+40分钟。

优选的，所述S2中，DNA提取使用试剂盒为DNA Stool mini Kit。

优选的，所述S4中，对测序结果统计分析前，先过滤掉低质量序列，并删除长度小于120bp的序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

该发明通过在环境样品中加入已知量的人工合成DNA内标，并进行DNA共提取、共扩增和共测序，可得到环境样品中蓝藻门的45个属的16S rRNA基因拷贝数，利用数据库基于全基因组统计可得到蓝藻门的16S rRNA拷贝数，进而对结果进行矫正，得到环境样品中45个蓝藻属真实的绝对丰度，从而实现在属水平对蓝藻群体的准确绝对定量，揭示出蓝藻菌群结构的真实变化。

附图说明

图1为本发明的不同浓度水平的P-Spikes下，每1000条reads中包括的P-Spikes的reads数目表示图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明提供的一种实施例：一种基于二代测序技术在属水平实现蓝藻绝对定量的方法，包括如下步骤：

S1：合成P-Spikes序列(即人工合成DNA内参序列)，克隆至质粒pMA-T中，并将质粒导入至大肠杆菌，表达目的基因，获得目的产物；

S2：将已知量的P-Spikes加入到环境样品中(图1中，梅梁湾、沙渚南、五里湖和小梅口为太湖的四个水域，将已知量的P-Spikes加入到梅梁湾、沙渚南、五里湖和小梅口这些环境样品中，完成P-Spikes序列向环境样品中的添加)，先进行DNA提取，再PCR扩增，反应完成琼脂糖凝胶电泳检测，并利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化处理；

S3：建库构建，利用Illumina测序平台进行高通量测序，得到环境样品中蓝藻门的45个属的16S rRNA基因拷贝数；

利用rrnDB数据库基于全基因组统计可得到蓝藻门的16S rRNA拷贝数(表1)，进而对上述环境样品中蓝藻门的45个属的16S rRNA基因拷贝数进行矫正；

表1蓝藻门不同物种16S rRNA拷贝数信息表

S4：利用qiime软件对测序结果进行统计分析，选择Uclust方法并设置阈值97％进行OTUs聚类，并用SILVA_132_release数据库进行注释，最终得到P-Spikes和蓝藻门下各属reads数，每个样品得到10条tags；

S5：利用S4得到的P-Spikes和蓝藻门下各属reads数，并结合蓝藻门的16S rRNA拷贝数得到蓝藻门下各属绝对丰度；

其中，蓝藻门下各属绝对丰度的计算公式为：

AC：属A绝对丰度；

AN：测序结果中属A的reads数；

PC：加入P-Spikes的实际浓度；

PN：测序结果中P-Spikes的reads数；

n：属A16S rRNA基因拷贝数。

进一步，S1中，P-Spikes序列的基因序列为CGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCACGTGTCTTGTCCAGAGCTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATCCCTTGTCTCCCTACCTCTGGAGGAGAAAAGTGTTGACATGGGCGCTCCCGGCGCAAGGGCCAAAGGAGTCTCCGATTTCTTATTCCCGAATGACATGCGTCTCCCTGCGGGTAAATCACCGACCGCGATTCATAGAAGCCTGGGGGAACAGGTAGGTCTAACTAGCTTAAGAGAGTAAATCCTGGGATCATTCAGTAGTAACCACAAACTTACGCTGGGGCTTCTTCGGCGGATCTTTTACGAGACTGATTATTAGAAACCCTAGTAGTCCGGTACCTGGAGCACAAGACTGGCCTCATGGGCCTTCCGCTCACTGC。

进一步，S2中，PCR扩增的引物为：

515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；

806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

进一步，S2中，按以下组份配制PCR反应液：

ddw，即超轻水，自然界里存在的水一般由2个氢原子和1个氧原子组成(H

由于氢原子同位素的质量不同，质量为1的氢和氧组成的水(H2)叫轻水；质量大于1的重氢(D)与氧组成的水(D20)叫重水；氢(H)、重氢(D)与氧组成的水(HDO)叫半重水。

超轻水是采用高科技制造技术，把自然界水中的重氢(也称之为氘)去除，降低了自然水中重氢含量的水。

进一步，S2中，PCR扩增采用95℃5min，(95℃15s，56℃30s，72℃30s)×25个循环，72℃8min的扩增程序。

进一步，S2中，琼脂糖凝胶电泳检测条件为1.5％凝胶+120V+40分钟。

进一步，S2中，DNA提取使用试剂盒为DNA Stool mini Kit。

进一步，S4中，对测序结果统计分析前，先过滤掉低质量序列，并删除长度小于120bp的序列。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。