检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法

摘要

本发明提供了一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法，stx1基因的引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，stx1基因探针的序列为如SEQ ID NO.3所示；stx2基因的引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，stx2基因探针的序列为如SEQ ID NO.6所示；试剂盒包括引物、探针、缓冲液和纯化水；本发明的实时荧光RAA检测方法特异性达100％，灵敏度达1.6×103cfu/mL，15min内可得到结果，比实时荧光PCR方法更快速，灵敏简便，可用于疾病监测、食品安全检测，适合基层实验室推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法。

背景技术

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing E.coli,STEC)是产志贺样毒素的大肠埃希氏菌，由于它们对猴肾细胞有毒性作用，也叫verocytotoxigenic E.coli(VTEC)。STEC是近年来最重要的新兴致病菌，可以导致腹泻、出血性结肠炎甚至溶血性尿毒综合症，是儿童急性肾衰竭的主要原因。人感染STEC主要通过摄入被污染的食物或水，直接与动物接触或通过人与人之间的传播。目前国际上STEC检测方法主要以实时荧光PCR法为主，针对两类志贺毒素基因(stx1,stx2)进行检测，然而，实时荧光PCR基于热循环仪，仪器昂贵，且对操作人员要求高，因此在基层实验室推广应用较为困难。

重组酶等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)是新一代核酸分子检测技术，该技术利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温(37-39℃)条件下进行核酸扩增，结合荧光探针实现即时检测，是一种精准、方便和快速的核酸检测技术，实现5-15min 完成检测输出结果，比实时荧光PCR技术更快速和便捷。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物和探针。

本发明的第二个目的是提供包括上述引物和探针的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供利用上述试剂盒的RAA检测方法。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物和探针，引物由stx1基因和stx2 基因的引物组成，探针由stx1探针和stx2探针组成；

stx1基因的上游引物序列：TTATCGCTTTGCTGATTTTTCACATGTTACC；SEQ ID NO.1；

stx1基因的下游引物序列：AAATCCAGATAAGAAGTAGTCAACGAATGGCG；SEQ ID NO.2；

stx1基因探针的序列为：CTGGTGACAGTAGCTATACCACGTTACAGCGT(FAM)-THF-T(BHQ1)-TGCAGGGATCAGTCG(3’blocker)； SEQ ID NO.3；

stx2基因的上游引物序列：TTTCCATGACAACGGACAGCAGTTATACCAC；SEQ ID NO.4；

stx2基因的下游引物序列：TCATTGTATTACCACTGAACTCCATTAACGC；SEQ ID NO.5；

stx2基因探针的序列为： CTGGAACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGT(FAM)-C-THF-C-T(BHQ1)-CACTGGTTTCATCA(3’blocker)； SEQ ID NO.6。

进一步地，stx1基因中上游引物为31bp，下游引物为32bp，探针为49bp，stx1基因探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团、四氢呋喃、相应的淬灭基团和C3-spacer，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，FAM和BHQ1均在T位置修饰，FAM和BHQ1中间间隔1个碱基，被四氢呋喃替换，C3-sapacer位于3’端末尾。

进一步地，stx2基因中上游引物为31bp，下游引物为31bp，探针为48bp，stx2基因探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团、四氢呋喃、相应的淬灭基团和C3-spacer，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，FAM和BHQ1中间间隔3个碱基，中间一个碱基被四氢呋喃替换，C3-sapacer位于3’端末尾。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的试剂盒，其包括上述的引物、探针、缓冲液和纯化水。

为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：

一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的方法，其包括如下步骤：

(1)、提取样品DNA；

(2)、以样品DNA为模板，利用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

进一步地，步骤(2)中，重组酶介导等温核酸扩增中stx1重组酶介导等温核酸扩增的反应体系为：缓冲液为25μL，上游引物为10μmol/L、2.1μL，下游引物为10μmol/L、2.1μL，探针为10μmol/L、0.6μL，纯化水为13.7μL，总体积为43.5μL；stx2重组酶介导等温核酸扩增的反应体系为：缓冲液为25μL，上游引物为10μmol/L、2.1μL，下游引物为10μmol/L、2.1μL，探针为10μmol/L、0.6μL，纯化水为13.7μL，总体积为43.5μL。

进一步地，步骤(2)中，重组酶介导等温核酸扩增的反应条件为：39℃反应30min。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明所建立的实时荧光RAA检测方法对所测试的4株产志贺毒素大肠埃希氏菌均能检出，对16株其它致病菌检测结果均为阴性；灵敏度达到1.6×10

附图说明

图1为本发明的产志贺毒素大肠埃希氏菌的RAA优化的引物和探针设计示意图，其中，引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示。

图2为本发明的实施例3中RAA方法的stx1的第1株至第5株菌株的特异性检测结果图 (其中，1:产志贺毒素大肠埃希氏菌ATCC03820(stx1+,stx2+)，2:产志贺毒素大肠埃希氏菌 CICC10668(stx1+,stx2-)，3:产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10670(stx1+,stx2+)，4:产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10669(stx1-,stx2+)，5:福氏志贺氏菌CMCC 51572(stx1-,stx2-))。

图3为本发明的实施例3中RAA方法的stx1的第6株至第20株菌株的特异性检测结果图(6:产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC24187(stx1+,stx2+)，7-20:大肠埃希氏菌ATCC25922、肠聚集性大肠埃希氏菌EAEC24186、肠致病性大肠埃希氏杆菌EPEC24189、肠产毒大肠埃希氏菌EIEC24188、单增李斯特菌ATCCBAA-751、沙门氏菌ATCC14028、副溶血性弧菌ATCC33847、大肠埃希氏菌O157 FSCC149015(不含志贺毒素基因)、蜡样芽孢杆菌ATCC11778、奇异变形杆菌ATCC12543、肺炎克雷伯氏菌ATCC13883、铜绿假单胞菌ATCC27853、克罗诺杆菌 ATCC25944、产气肠杆菌ATCC13048)。

图4为本发明的实施例3中RAA方法的stx2的第1株至第5株菌株的特异性检测结果图 (1:产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10670(stx1+,stx2+)，2：产志贺毒素大肠埃希氏菌ATCC03820(stx1+,stx2+)，3:产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10669(stx1-,stx2+)，4:产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10668(stx1+,stx2-)，5:福氏志贺氏菌CMCC51572(stx1-,stx2-))。

图5为本发明的实施例3中RAA方法的stx2的第6株至第20株菌株的特异性检测结果图(6:产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC24187(stx1+,stx2+)，7-20:大肠埃希氏菌ATCC25922、肠聚集性大肠埃希氏菌EAEC24186、肠致病性大肠埃希氏杆菌EPEC24189、肠产毒大肠埃希氏菌EIEC24188、单增李斯特菌ATCCBAA-751、沙门氏菌ATCC14028、副溶血性弧菌ATCC33847、大肠埃希氏菌O157 FSCC149015(不含志贺毒素基因)、蜡样芽孢杆菌ATCC11778、奇异变形杆菌ATCC12543、肺炎克雷伯氏菌ATCC13883、铜绿假单胞菌ATCC27853、克罗诺杆菌 ATCC25944、产气肠杆菌ATCC13048)。

图6为本发明的实施例4中stx1实时荧光RAA灵敏度检测结果图(其中，1：原液浓度为1.6×10

图7为本发明的实施例4中stx1实时荧光PCR纯菌灵敏度检测结果图(其中，1：原液浓度为1.6×10

图8为本发明的实施例4中stx2实时荧光RAA纯菌灵敏度检测结果图(其中，1：原液浓度为1.6×10

图9为本发明的实施例4中stx2实时荧光PCR纯菌灵敏度检测结果图(其中，1：原液浓度为1.6×10

图10为本发明的实施例5中不同浓度STEC污染牛肉增菌后stx1的实时荧光RAA检测结果结果图(其中，1:10

图11为本发明的实施例5中不同浓度STEC污染牛肉增菌后stx1的实时荧光PCR检测结果结果图(其中，1:10

图12为本发明的实施例5中不同浓度STEC污染牛肉增菌后stx2的实时荧光RAA检测结果结果图(其中，1:10

图13为本发明的实施例5中不同浓度STEC污染牛肉增菌后stx2的实时荧光PCR检测结果结果图(其中，1:10

具体实施方式

本发明提供了一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法。

RAA扩增的实时检测依赖于核酸外切酶III，它会切断exo－探针中的四氢呋喃(THF)，导致荧光基团和荧光淬灭基团的分离，扩增结果通过exo－探针检测。此探针携带一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，分别与一个胸腺嘧啶结合，中间由一个四氢呋喃(THF)碱基隔开，当此结构完整时，荧光强度低。当探针与靶序列结合时，连接荧光基团和淬灭基团的THF碱基位点就会被核酸外切酶III识别并酶解，下游的淬灭基团被释放，荧光强度增强。酶切后产生的游离3'－OH作为DNA聚合酶的靶点并扩增此探针，荧光强度也会随着其扩增而增强。荧光强度信号实时检测由荧光信号检测器或扫描仪完成，其敏感度强、特异性强，检测所需时间短。具体地，本发明公开了一种实时荧光重组酶等温核酸扩增技术检测STEC的方法，包括上游引物、下游引物和exo－探针各一条，分别针对stx1和stx2进行检测。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：引物和探针设计

Stx1有三种主要变体：stx1a、stx1c和stx1d，以stx1a最为常见，stx1c和stx1d较罕见，因此本发明的引物探针主要针对stx1a设计，但由于引物探针在三种变体中的序列差异小，对其他两种变体也能扩增阳性，但信号比stx1a弱。

stx1a(NC_002695.1)

Stx1c(DQ449666.1)

Stx1d(AY170851.1)

Stx2主要有7种变体：stx2a、stx2c、stx2d、stx2dactivatable、stx2e、stx2f和stx2g，其中stx2a、stx2c和stx2dactivatable最常见，其余变体较稀少。stx2f与其它变体相差较大，本发明的引物探针可扩增除stx2f之外的其它变体。

Stx2a(NC_002695.1)

Stx2c(FR851896.1)

Stx2d(AF500188.1)

Stx2dactivatable(FN182287.1)

Stx2e(NC_003356.1)

Stx2g(GQ919289.1)

产志贺毒素大肠埃希氏菌含有stx1基因或(和)stx2基因，其stx1基因与痢疾志贺氏菌中的stx1同源性较高，只有一个氨基酸差异。其stx2基因与痢疾志贺氏菌中的stx1同源性只有56％。因此通过查找到的产志贺毒素大肠埃希氏菌stx1基因(NC_002695.1)和stx2基因 (NC_002695.1)序列，进行多序列比对，经同源性分析之后，分别以上目的片段进行stx1 和stx2荧光检测引物和探针设计。

其中，产志贺毒素大肠埃希氏菌stx1和stx2基因特异的引物和探针见表1。

表1产志贺毒素大肠埃希氏菌stx1和stx2 RAA引物和探针信息

上述引物和探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2：

RAA检测方法，包括如下步骤：

(1)、提取样品DNA；

a.增菌液模板DNA的制备

i)吸取1mL菌液加入1.5mL离心管中，12000g离心3min，弃上清；

ii)加入1mL 0.85％无菌生理盐水，完全溶解沉淀，12000g离心3min，弃上清；

iii)加入100μL无菌水混匀后沸水浴10min，置冰上冷却；

iv)12000g离心12min，上清液即为模板DNA。

b.可疑菌落模板DNA的制备

对于分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落再按照iii步骤制备模板DNA以待检测。

(2)、以样品DNA为模板，利用实施例1中的引物和探针进行RAA检测。

(3)、收集荧光信号，得出样品检测结果。

其中，RAA检测的反应体系和反应条件：

RAA各反应组分见表2，将表2和表3各组分按“样品数量(n)+1”份倍比添加混匀后，分装43.5μL混合液至荧光基础反应单元中，轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心，打开反应单元，向每个反应单元的管盖上加入2.5μL乙酸镁，然后向各反应单元加入4μL模板DNA，充分混匀并离心，将反应管放入荧光检测仪(江苏奇天恒温核酸扩增检测仪)中39℃反应30min。

表2产志贺毒素大肠埃希氏菌stx1 RAA反应体系表

表3产志贺毒素大肠埃希氏菌stx2 RAA反应体系表

实施例3：特异性试验

采用实施例2中的RAA检测方法对以下材料进行检测。

测试所用菌株为肠出血性大肠埃希氏菌CICC10670(含stx1和stx2)、CICC24187(含stx1 和stx2)、肠出血性大肠埃希氏菌ATCC03820(含stx1和stx2)、产志贺毒素大肠埃希氏菌 CICC10668(只含stx1)、产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10669(只含stx2)；排外性测试所用菌株为福氏志贺氏菌CMCC51572(stx1-,stx2-)、大肠埃希氏菌ATCC25922、肠聚集性大肠埃希氏菌EAEC24186、肠致病性大肠埃希氏杆菌EPEC24189、肠产毒大肠埃希氏菌EIEC24188、单增李斯特菌ATCCBAA-751、沙门氏菌ATCC14028、副溶血性弧菌ATCC33847、大肠埃希氏菌O157 FSCC149015(不含志贺毒素基因)、蜡样芽孢杆菌ATCC11778、奇异变形杆菌 ATCC12543、肺炎克雷伯氏菌ATCC13883、铜绿假单胞菌ATCC27853、克罗诺杆菌ATCC25944、产气肠杆菌ATCC13048。检测反应条件为：39℃反应30min。

由图2和图3可知，所有产stx1阳性的4株大肠埃希氏菌菌株(产志贺毒素大肠埃希氏菌ATCC03820、产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10668、产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10670产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC24187)，stx1的RAA检测结果均为阳性；所有16株stx1阴性的菌株，stx1的RAA检测结果均为阴性。

由图4和图5可知，所有产stx2阳性的4株大肠埃希氏菌菌株(产志贺毒素大肠埃希氏菌ATCC03820、产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10670、产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC10668、产志贺毒素大肠埃希氏菌CICC24187)，stx2的RAA检测结果均为阳性；所有16株stx2阴性的菌株，stx2的RAA检测结果均为阴性。

实施例4：灵敏度试验

用棉签挑取血平板上新鲜生长的STEC CICC10670在10mL 0.85％生理盐水中混匀，依次吸取2mL菌悬液在18mL 0.85％氯化钠盐水中，制成一系列10倍比稀释度的菌悬液。从每个稀释度管子中分别吸取1mL菌悬液在1.5mL离心管，12000rpm离心1min，弃去上清，加入 100μL无菌水，100℃煮沸10min，12000rpm离心2min，取上清备用。取4μL分别进行实时荧光RAA反应和实时荧光PCR反应，实时荧光PCR引物探针、反应体系和条件参考美国农业部USDA FSIS MLG-5(上游引物：5’-TTTGTYACTGTSACAGCWGAAGCYTTACS-3’，下游引物： 5’-CCCCAGTTCARWGTRAGRTCMACDTC-3’，stx1探针： 5’-6-FAM/ZEN/CTGGATGATCTCAGTGGGCGTTCTTATGTAA-IBFQ-3’，stx2探针 5’-6-FAM/ZEN/TCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCC-IBFQ-3’，反应体系共25μL，引物浓度为 1.24μM，探针浓度各为0.25μM，反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，59℃退火延伸1min，共40个循环)。同时分别吸取100μL菌悬液涂布在麦康凯琼脂平板上，36±1℃培养24h，对不同梯度菌液进行计数，计算RAA方法的灵敏度(cfu/mL)。

由图6和图7可知，实时荧光RAA方法和实时荧光PCR方法对1.6×10

综上所述，所建立的实时荧光RAA方法对STEC的灵敏度达到1.6×10

实施例5：食品基质中检出限测试

为了验证该方法对实际样品中STEC的检出限，选取事先经检测不含STEC的牛肉样品，称取25g样品10份，加入225mL MEC肉汤，分别添加不同浓度的STEC CICC10670菌悬液，制成不同STEC初始污染浓度(1.6×10

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法

<141> 2020-11-03

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ttatcgcttt gctgattttt cacatgttac c 31

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aaatccagat aagaagtagt caacgaatgg cg 32

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ctggtgacag tagctatacc acgttacagc gtgttgcagg gatcagtcg 49

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tttccatgac aacggacagc agttatacca c 31

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tcattgtatt accactgaac tccattaacg c 31

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ctggaacgtt ccggaatgca aatcagtcgt cactcactgg tttcatca 48