飞行时间质谱仪中由热漂移导致的质量差错校正

摘要

公开一种考虑到温度变化而校准TOF‑MS质谱的方法。将离子引入到傅里叶变换质谱仪中，并且确定它们的质荷比。还将包含校准离子的离子引入到飞行时间质谱仪中，并且还至少确定所述校准离子的质荷比。选择并在所述TOF MS和FTMS谱之间匹配表示校准离子的特定峰。接着，基于所述FTMS谱相对于温度的相对独立性，使用每一个谱中的匹配峰的相对位置来确定所述TOF MS数据的温度校正因子。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在飞行时间质谱仪(TOF-MS)中调整将飞行时间与质荷比(m/z)联系起来的校准函数的方法和设备。校准函数随着时间推移而改变，以补偿热漂移。

背景技术

在飞行时间(TOF)质谱法中，测量离子的飞行时间以确定质荷比(m/z)。众所周知，离子的飞行时间与它的质荷比的平方根成比例。所记录的检测时间通过校准函数而与m/z比联系。质谱仪的环境温度在使用期间可变化超过10度，从而导致机械零件的热膨胀和电子组件(电压供应)的热诱导漂移。TOF-MS的温度变化导致给定物种的离子的所测量飞行时间发生改变。对于给定校准函数，在已经确定初始校准函数后，当条件改变时，这会对计算出的所述离子物种的质荷比的准确性产生不利影响。

在过去已经采用若干种方法来使这些影响最小化。在US-B-6,049,077中，使用适当材料的混合以尝试在温度变化时维持恒定的飞行路径。在US-B-6,465,777中已经提出一种不同的解决方案，其中通过使用气流机构来使关键机械和电子组件的温度保持恒定。

在US-B-6,700,118中，采用若干种传感器来从仪器获得温度和应变测量值。接着，结合数学模型使用所测量参数以提供调整后的质谱。

在US-A-2008/0087810中呈现了又一方法。在此情况下，在集合(assembly)的基准温度下确定飞行路径的长度。接着采用用于飞行路径集合的预先确定的热膨胀校正因子来进行校正。通过适当地控制TOF MS的另一分量，例如施加到电源系统的电压或用于控制时钟频率的信号，实行校正。

在US-B-6,797,947中，使用内部校准源来实现高质量准确性。所谓的具有完全已知的质量的锁定质量离子在质量分析之前与分析物离子混合。所记录的质谱含有已知锁定质量离子和分析物离子的峰，它们的m/z比可极其准确地确定。

发明内容

本发明提出一种在TOF-MS中利用由温度变化导致的校准函数不稳定性来解决问题的替代方法。

根据本发明的第一方面，提供一种考虑到温度变化而校准TOF-MS质谱的方法，如技术方案1中阐述。还可提供软件来实行所述方法。

本发明还扩展到用于考虑到温度变化而校准TOF-MS质谱的系统，如技术方案14中阐述。

TOF-MS的高分辨率输出的质量准确性(如上文的介绍所论述)由于离子的飞行时间依赖于温度而易受不准确性/漂移影响。温度改变导致机械和/或电子组件偏移。本发明基于观察结果预测：相比之下，例如傅里叶变换离子回旋共振光谱仪(FT-ICR MS)的傅里叶变换质谱仪(FTMS)或例如赛默飞世尔科技公司的的轨道捕集质谱仪的质量准确性大体上不受温度改变影响(并因此不受在定位其组件时的热诱导偏移影响)。

根据本发明的质谱系统同时包括能够并行或依序分析相同分析物的TOF和FTMS质谱仪。在用于校准TOF MS的本发明的一个实施例中，获得表示校准离子物种的质量的至少一组FTMS数据，以及表示那些校准离子物种的质量的至少一组TOF-MS数据。为简洁起见下文称为校准离子的校准离子物种是供应到TOF和FTMS质谱仪的质量分析仪的离子的子集。供应到两个质谱仪的质量分析仪的离子可为相同的，或者可为不同的。重要的是只有校准离子被供应到两个质谱仪的质量分析仪。FTMS数据组包括在频域中具有表示不同离子物种的一个或多个峰的数据，所述一个或多个峰中的一个(或多个)被选择作为校准峰。FTMS数据组可为原始频率相较于丰度数据，或者它可为质谱，也就是说，其频率转换成m/z。同样地，TOF MS数据优选的是原始飞行时间数据，但是可为m/z相较于丰度的质谱。

在由FTMS和TOF MS中的一个产生的所述一组数据中选择合适的一个或若干个峰。可使用分析物峰(也就是说，表示已经引入的样本内的离子的峰)或背景峰(也就是说，表示例如用于将样本离子引入到质谱仪中的载气离子的峰)。将用于校准TOF的离子物种(峰)的优选数目可在1和10之间。峰的选择是基于TOF MS和FTMS数据的匹配的容易性，如下文进一步所论述。优选地，所选择的峰在FTMS数据中。

用于校准的离子物种的m/z比在下文被称为校准质量，并且表示质荷比的FTMS和TOF数据中的对应峰被称为校准峰。

一旦已经选定峰，优选的是在FTMS数据中，搜索另一装置中的对应峰(优选地，在TOF MS数据中)以找到其中的匹配峰。具体来说，在优选实施例中，搜索或扫描TOF MS数据以定位由与FTMS数据中被选择作为校准离子物种相同的校准离子物种产生的那个或那些峰。温度改变使得TOF中的离子的飞行时间偏移，继而致使TOF MS数据中的峰的位置相对于FTMS数据中的对应峰的位置(其基本上是温度独立的)产生偏移。当TOF MS数据峰的位置偏移时，可接着基于所述偏移而确定温度校正因子。

校准质量m[i]优选的是根据FTMS校准峰的位置使用FTMS领域中已知的多种技术中的一种(或多种)来确定。例如，所测量飞行时间t_m在TOF质谱仪中可识别为对应的TOF校准峰的质心。众所周知，TOF>m通过比例常量A而与离子的质荷比m/z的平方根相关。数据获取电子器件的定时延迟还引入定时偏差t₀。公式为m/z＝A(t_m-t₀)²。优选的是，使用根据本发明产生的温度校正因子来调整常量A和/或t_m，以使得当特定物种的离子的实际飞行时间随着温度改变时计算正确质量。然而，应理解，施加温度校正因子作为飞行时间与质荷比的校准函数的校正并不是必不可少的。同样有可能确定校准函数(例如，在质谱仪的启动期间)并使所述校准函数具有固定参数，即使在温度漂移时也如此。在那种情况下，温度校正因子可施加到未校正的质量数据以针对温度偏移进行调整。

由于TOF的高操作速率(每秒数百质谱)，仅需要保留TOF的全部分析时间中的极小部分以获得合适的数据，从而获得温度校正因子。

设想各种工作流程。在一个任选的实施例中，例如，在FTMS中实行从液相色谱仪洗脱的样本的MS1(前体)扫描，以检测所述样本中的所有峰。接着将来自相同的所洗脱色谱峰的前体样本离子注入到TOF中，它们在TOF中进行检测。可以使用表示校准离子物种的质量的所得FTMS数据来校准TOF MS数据。在此情形中，在前体样本离子注入到FTMS中之后立即将前体样本离子注入到TOF中。

在替代布置中，通过FTMS实行MS1分析。然而，接着使用碰撞池等等对(来自相同色谱峰的样本前体离子进行片段化，并将所得片段离子注入到TOF中。接着可获得表示片段质量的数据(MS2数据)。TOF MS的校准可通过识别起因于未片段化前体离子而由TOF MS产生的MS2数据中的峰来实现。这些可与通过FTMS获得的前体MS1扫描中的对应峰的位置相比较。

在通过TOF MS获得的MS2扫描中没有合适的前体峰可以被识别出的情况下，由碰撞池等等产生的片段离子可被发送回到FTMS，以通过FTMS产生表示片段质量的MS2数据。接着，通过FTMS获得的MS2扫描中的合适的峰可与通过TOF MS获得的MS2数据中的对应峰交叉相关。

本文中，采用术语“分辨率”和“分辨力”。分辨率是两个峰的质荷比m/z的差Δm/z，所述两个峰在质谱中可为分开的。因此，针对具有质荷比m/z的峰，通过以下比率定义质量分析仪的分辨力R：

出于本讨论的目的，分辨力R假设两个峰在峰的最大高度的一半处应该是分开的(50％准则，不同于更严格的准则，例如跨越每一峰的最低10％的宽度)。那么，分辨率Δm/z是峰的半高全宽(FWHM)。因此，质量分析仪的分辨力R则通过以下给定：

一般来说理想的是TOF质量分析仪的分辨力足以确保由温度变化产生的峰偏移小于所选择的任何校准离子峰的峰宽。对于给定TOF MS分辨力，这可体现为用于FTMS质谱中的潜在校准峰的选择准则。从另一方面看，如果足够数目个合适的校准峰有待识别并且成功用于产生校准函数，那么TOF MS的分辨力可指定为不小于最小阈值。

优选地，离子可在多个周期内进行捕集(例如，在例如线性离子阱的捕集装置中)并积聚。捕集可直接在TOF MS和/或FTMS装置上游进行。这允许额外的前体离子和例如A+1或A+2同位素添加到注入到每一分析仪中的离子物种中，以改善校准。

尽管可采用表示校准离子物种的质量的单个FTMS数据组来校准TOF MS数据，但是实际上可采用多个周期，并且可实行统计分析以提供又另一改善的温度校正因子。

通常，FTMS的分辨力高于TOF MS的分辨力。因此，优选的是在FTMS数据中识别候选峰并在TOF MS数据中进行匹配。然而，这并不是必不可少的。实际上，可在TOF MS数据中识别候选峰，并接着在FTMS数据中进行匹配。

本发明各个其它优选特征将根据所附权利要求书和以下一些优选实施例的具体描述而显而易见。

附图说明

本发明可以用多种方式来实现，现将仅借助于实例并参考附图来描述一些实施例，在附图中：

图1示出质谱仪的示意性布局，其包含傅里叶变换质量分析仪和飞行时间质量分析仪，并且代表本发明的第一实施例；

图2示出用于在一系列不同温度下由图1的飞行时间质量分析仪产生的质谱的温度校正的一系列校准函数；

图3a示出在施加针对温度变化的校正之前和之后TOF质谱中的所测量质量的偏移的比较；

图3b示出随时间的推移的分别在FTMS和TOF MS质谱中的所测量质量的偏移的比较；以及

图4示出质谱仪的示意性布局，其包含傅里叶变换质量分析仪和飞行时间质量分析仪，并且代表本发明的第二实施例。

具体实施方式

在本文中，术语质量可用于指代质荷比m/z。

图1示出适用于实行根据本发明的实施例的方法的质谱仪10的示意性布置。

图1中待分析样本供应(例如从自动进样器)到色谱设备，如液相色谱(LC)柱(图1中未示出)。LC柱的一个此类实例为赛默飞世尔科技公司的ProSwift整体柱，其通过在高压下迫使在流动相中运送的样本通过构成固定相的不规则或球形形状的粒子的固定相来提供高效液相色谱(HPLC)。在HPLC柱中，样本分子根据其与固定相的相互作用程度而以不同速率洗脱。

可通过使用检测器(例如质谱仪)随着时间推移测量从HPLC柱洗脱的样本分子的量来产生色谱。从HPLC柱洗脱的样本分子将被检测为高于色谱上的基线测量值的峰。在不同样本分子具有不同洗脱速率的情况下，可检测到色谱上的多个峰。优选地，个别样本峰在时间上与色谱图中的其它峰分开，使得不同样本分子彼此不干扰。

在色谱中，色谱峰的存在对应于样品分子在检测器处存在的时间段。由此，色谱峰的宽度相当于样本分子在检测器处存在的时间段。优选地，色谱峰具有高斯形状分布，或可假设具有高斯形状分布。因此，可基于根据峰计算的数个标准差来确定色谱峰的宽度。例如，可基于色谱峰的4个标准差计算峰宽。可替代地，可基于在最大高度的一半处的宽度计算峰宽。所属领域中已知的用于确定峰宽的其它方法也可为合适的。

接着，使用处于常压的电射出电离源(ESI源)20电离通过液相色谱法分开的样本分子。

接着，样本离子进入质谱仪10的真空腔室且通过毛细管25引导到仅RF的S透镜30中。离子通过S透镜30集中到注入平杆(flatapole)40中，所述平杆将离子注入到具有轴向场的弯曲平杆50中。弯曲平杆50沿着弧形路径引导(带电)离子从其通过，而不想要的中性分子如夹带的溶剂分子不沿着弧形路径引导，并且丢失。

离子栅极(TK透镜)60位于弯曲平杆50的远侧端部并且控制离子从弯曲平杆50到下游四极滤质器70中的通过。四极滤质器70典型地但未必为分段式的并且充当带通滤波器，允许选定的质量数或有限质量范围的通过，而排除具有其它质荷比(m/z)的离子。滤质器还可以仅RF模式操作，其中所述滤质器无质量选择性，即，其传输大体上所有的m/z离子。例如，四极滤质器70可由控制器130控制以选择质荷比范围使得被允许聚集的前体离子通过，同时滤除前体离子流中的其它离子。

尽管图1中示出四极滤质器，但所属领域的技术人员应了解，其它类型的质量选择装置也可适用于选择受关注质量范围内的前体离子。例如，US-A-2015287585中所描绘的离子分离器、WO-A-2013076307中所描绘的离子阱、US-A-2012256083中所描述的离子迁移分离器、WO-A-2012175517中所描述的离子栅极质量选择装置或US799223中所描述的带电粒子阱，以上内容以全文引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应了解，根据离子迁移率、微分迁移率和/或横向调制来选择前体离子的其它方法也可为合适的。

接着，离子穿过四极出射透镜/对切透镜布置80并且进入第一转移多极杆90。第一转移多极杆90将已滤质离子从四极滤质器70导引到弧形阱(C阱)100中。C阱(第一离子阱)100具有供应有RF电压的纵向延伸的弧形电极以及供应有DC电压的端盖。得到一个沿着C阱100的弧形纵向轴线延伸的势阱。在第一操作模式中，对C阱设置DC端盖电压，使得从第一转移多极杆90到达的离子被捕获于C阱100的势阱中，所述离子在势阱中冷却。离子到C阱中的注入时间(IT)确定随后从C阱射出到质量分析仪中离子(离子群)的数量。

经冷却离子朝向势阱的底部滞留成云且接着从C阱朝向第一质量分析仪110垂直射出。

如图1所示，第一质量分析仪是傅里叶变换质量分析仪(FTMS)110，例如描述于例如WO-A-96/30930中且由赛默飞世尔科技公司出售的轨道捕集质量分析仪。FTMS110具有偏心注入孔口，并且离子作为相干组通过偏心注入孔口注入到FTMS 110中。接着，离子通过超对数型电场捕集于轨道捕集质量分析仪内，并且在围绕内部电极绕转时在纵向方向上进行往返运动。

轨道捕集质量分析仪中的离子组的移动的轴向(z)分量(或多或少)定义为简谐运动，其中z方向上的角频率与给定离子物种的质荷比的平方根相关。因此，随着时间推移，离子根据其质荷比而分离。

通过使用图像检测器(未示出)检测FTMS中的离子，所述图像检测器在所有离子物种通过图像检测器时在时域中产生含有关于它们的信息的“瞬变”。然后，瞬变经受快速傅里叶变换(FFT)，从而产生频域中的一系列峰。根据这些峰，可产生表示丰度/离子强度相较于m/z的质谱。

尽管图1示出其中通过静电场轴向和径向地捕集离子的FTMS 110，但是应理解，设想了其它形式的FTMS，例如傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质量分析仪，其中通过静电场轴向地捕集离子，而径向和方位捕集通过施加磁场来实现。FTMS 110的主要要求是它的输出(也就是说，它产生的质谱中的峰的位置和形状)相对于短期和长期温度偏移应该是相对稳定的。

在上述配置中，在无片段化的情况下，通过轨道捕集质量分析仪来分析样本离子(更具体地说，由四极滤质器选择的受关注质量范围内的样本离子的质量范围段)。所得前体质谱表示为MS1。

在C阱100的第二操作模式中，穿过四极出射透镜/对切透镜布置80和第一转移多极杆90进入C阱100的离子还可继续它们穿过C阱的路径并且进入片段化腔室120。由此，C阱在第二操作模式中有效地充当离子导向器。可替代地，C阱100中的经冷却离子可在轴向方向上从C阱射出到片段化腔室120中。在图1的质谱仪10中，片段化腔室120是可供应有碰撞气体的较高能量碰撞解离(HCD)装置。因此，到达片段化腔室120中的前体离子处于片段化腔室120的一个操作模式，并利用高能量碰撞气体分子轰击，从而使得前体离子片段化成片段离子。基本上所有前体离子都可进行片段化。然而，如将在下文进一步详细解释，根据本发明的一些优选实施例，碰撞气体分子的能量被设置成使得前体离子中的至少一些穿过片段化腔室120而不会被碰撞解离。

然而，在片段化腔室120的替代操作模式中，前体离子未经受碰撞气体，或供应到片段化腔室的碰撞气体的能量不足以使前体离子片段化。因此，在此替代操作模式中，片段化腔室120充当前体离子的离子导向器。

尽管图1中示出HCD片段化腔室120，但实际上可使用采用如碰撞诱导解离(CID)、电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)、光致解离等其它片段化装置。

离子(部分片段化或未片段化)可在相对的轴向端部处从片段化腔室120射出到C阱100。射出的离子进入第二转移多极杆130。第二转移多极杆130将离子从片段化腔室120导引到提取阱(第二离子阱)140中。提取阱140是含有缓冲气体的射频压控阱。例如，合适的缓冲气体是压力在5x10^-4毫巴到1x10^-2毫巴范围内的氩气。提取阱能够快速断开所施加的RF电压，并施加DC电压以提取捕集的离子。在US9548195(B2)中进一步描述合适的平板提取阱。可替代地，C阱还可适用作第二离子阱。

提供提取阱140以积聚从片段化腔室120射出的离子，之后将这些离子注入到飞行时间质量分析仪150中。在图1中，所示出的飞行时间质量分析仪150是多反射飞行时间质量分析仪(mr-TOF)150。

mr-TOF 150围绕在漂移方向上伸长的两个相对离子镜160、162而构造。提取阱140将离子注入第一镜160中，且接着离子在两个镜160、162之间振荡。离子从提取阱140和另外的偏转器170、172的射出角度允许控制漂移方向上的离子能量，使得离子在振荡时顺着镜160、162的长度被引导，从而产生Z形轨迹。镜160、162自身相对于彼此倾斜，从而产生势梯度，所述势梯度延迟离子的漂移速度并使离子在漂移维度上反射回来且集中到检测器180上。相对的镜的倾斜将通常具有以下副作用：在它们顺着漂移维度行进时，离子振荡的时间周期改变，从而使得良好的离子时间集中性不可能实现。这利用带状电极190进行校正，所述带状电极190更改镜间空间的一部分的飞行势，所述飞行势顺着相对的镜160、162的长度变化。带状电极190的变化宽度与镜160、162之间的距离变化的组合允许离子反射和空间集中到检测器180上以及维持良好的时间集中性。适用于本发明中的mr-TOF 150在US-B-9,136,101中进一步描述。当然，可采用其它mr-TOF，例如描述于属于Wollnik的GB-A-2,080,021、属于Verentchikov的WO-A-2005/001878、属于Ristroff的US-A-2011/0168880、属于Jeol的US-B-7,504,620的螺旋TOF布置、属于Makarov和Giannakopulos的US-B-8,637,815以及均属于Makarov和Grinfield的US-B-8,395,115、US-B-8,674,293、US-B-9,082,605和US-B-9,324,553中的那些。因此，应理解本文中的特定mr-TOF质谱仪的描述仅是为了说明，且决不希望具有限制性。实际上，尽管使用多反射飞行时间质谱仪存在一些优点，但是所描述和要求的本发明概念同等地适用于任何形式的飞行时间质谱仪，并且应相应地解释权利要求书。

到达mr-TOF的检测器180的离子用于构造质谱，这是因为，众所周知，通过mr-TOF的离子的飞行时间与质荷比m/z相关。在片段化腔室120的第二操作模式中，进入mr-TOF150的离子未片段化，以使得所得质谱是MS1质谱。然而，在片段化腔室120的第一操作模式中，质谱含有片段离子并且可表示为MS2。

尽管前述内容描述使用提取阱140以允许在注入到mr-TOF 150中之前在多个周期内积聚离子，但是应理解，这对根据本发明的方法的实施方案来说是有利的，但不是必不可少的。

质谱仪10在系统控制器200的总体控制下。一般来说，系统控制器200配置成接收并处理由FTMS 110和mr-TOF 150产生的数据，并且基于FTMS和mr-TOF数据之间的比较而产生用于mr-TOF的经修正校准函数，其考虑到了在温度漂移时TOF中的离子的飞行时间的改变。接着，所确定的经修正校准函数可施加到随后获得的mr-TOF数据，以便针对系统中，特定来说，mr-TOF中的温度改变校正这些数据。系统控制器200可用软件、硬件或这两个实施。此外，FTMS 110和mr-TOF可各自具有它们自己的相关联处理器，分别用于从FTMS 110的图像检测器和mr-TOF检测器180捕获原始数据，并产生FTMS和mr-TOF质谱。可替代地，可采用单个处理器来实行通过FTMS 110的图像检测器获得的瞬变数据的快速傅里叶变换，并且还将来自检测器180的丰度对比到达时间数据转换成质谱。

系统控制器200可物理上和/或逻辑上与这一或这些处理器分开。在那种情况下，系统控制器可能不在(相比于图1中示出的布置)质谱仪10本地。从FTMS 110和mr-TOF150获得的数据可例如在质谱仪本地获得，并接着通过有线或无线通信发送到系统控制器200，所述系统控制器200可形成为在本地或远程个人计算机(PC)上操作的软件。因此，应理解，尽管系统控制器200形成质谱仪10的逻辑部分，但是在它的所定义功能方面，它不需要必须形成它的物理部分。实际上也就是说，为了优化校准和再校准的速度，优选的是系统控制器200形成为质谱仪10的本地操作系统的硬件或软件的一部分。

如在背景技术中所提到，由mr-TOF产生的质谱特别容易受温度波动影响，从而产生机械组件的移动(膨胀或收缩)和/或电气组件的变化。相比之下，FTMS 110的输出相对不受此类温度变化影响。

因此，系统控制器200使用来自FTMS的数据作为校正mr-TOF数据中的峰的位置基于温度的偏移的基础。现将阐述其实现方式的数个不同实例。

(i)仅使用前体离子

此处，在第一时间段期间，前体离子积聚到C阱100中，并接着注入到FTMS 110中以便产生MS1质谱。在第二时间段期间，一旦前体离子已经从C阱射出到FTMS 110中，就切换C阱110，以便允许前体离子朝向片段化腔室120轴向穿过。在所述第二时间段期间，片段化腔室120自身在离子导向模式中操作，以使得前体离子大体上未进行片段化。接着，前体离子进入mr-TOF 150并且以已知方式检测它们的飞行时间。系统控制器200(或与如上文所描述的mr-TOF相关联的处理器)利用将由mr-TOF收集的原始飞行时间数据转换成质谱的初始校准函数进行编程。初始校准函数可在质谱仪10的初始启动和校准期间获得，或以其它方式获得。用于将飞行时间转换成m/z的合适的(但是当然不具有限制性)技术在上文描述。

优选地，第一和第二时间段以及这两个之间的切换持续时间都足够快速以使得FTMS 110和mr-TOF 150从相同色谱峰捕获并分析前体离子。

一旦来自FTMS 110的MS1和来自mr-TOF 150的MS1已经产生，系统控制器200就会在FTMS 110的MS1中寻找特征峰。应该选择可在两个质谱中清楚地识别出的特征峰，所述两个质谱也就是来自FTMS 110的MS1和来自mr-TOF 150的MS1。优选地，所选择的特征峰是单峰而不是双峰(表示干扰离子物种/同位素等)。尤其希望的是，在FTMS 110的分辨力下，FTMS质谱中的特征峰是单峰。进一步优选的是，通过使用以下准则来选择特征峰：在特征峰附近的质量范围中的FTMS 110的质谱中没有其它峰可被观察到。优选地，质量范围由以下要求限定：由于选定的质量范围，还保证特征峰在mr-TOF的质谱(即使它具有较低分辨力)中为可清楚地识别出的单峰。单个特征峰可为足够的，或可替代地可采用多个峰。这些峰可为分离的(也就是说，特征峰可通过不用于校准目的的一个或多个其它峰分开)。可替代地，可采用FTMS MS1质谱中的峰群组作为特征峰。

这些峰在之后被称为“校准峰”。它们的质荷比根据质谱显而易见。通常，负责校准峰的离子物种因此为可识别的。然而，这并非必不可少的：只要选定的校准峰的质荷比已知，这足以允许mr-TOF质谱进行后续校准，如下所述。

在最一般的意义上，术语“校准峰”意在识别系统控制器200出于校准目的将使用的FTMS质谱中的那些峰。可采用产生合适的峰(合适性的问题在下文论述)的样本离子物种作为校准峰。在其它实施例中，为校准目的而选择的(选定的)峰可源自沿着样本离子的边存在的离子物种。例如，所存在的背景离子物种(例如，由用于将样本运送到质谱仪中的有机溶剂产生的离子)可产生适用作校准峰的峰。

因此应理解，本发明的实施例允许TOF MS质谱的质量准确性得以改善，同时不需要直接注入准确得知的m/z的“锁定质量”来直接校准TOF MS。所必需的就是在FTMS/TOF MS质谱中的第一者中选择峰，并接着在FTMS/TOF MS质谱中的另一个中识别对应的峰。实际上并不需要识别产生峰的离子物种。

可采用各种准则来识别FTMS质谱中的合适的峰，例如信噪比、峰形和峰质量中的一个或多个。例如参见Cox等人，《美国质谱学会杂志(J.Am.Soc.Mass Spectrom.)》，2009年8月；20(8):1477-85.doi:10.1016/j.jasms.2009.05.007。电子版2009年5月20日，《确定和提高轨道阱中的蛋白质组测量的质量精度和准确性的计算原理(Computationalprinciples of determining and improving mass precision and accuracy forproteome measurements in an Orbitrap)》，以及Gorshkov等人，《美国质谱学会杂志》2010年11月；21(11):1846-51.doi:10.1016/j.jasms.2010.06.021.电子版2010年7月7日。

在已经识别出FTMS质谱中的校准峰后，每个峰的质心和相关联的品质因子通过系统控制器200存储。作为这一步骤的部分，可考虑FTMS中的空间电荷影响。

接下来，系统控制器200在mr-TOF质谱中搜索对应的峰。例如，可采用最佳拟合算法。本文中所描述的方法的目的是使用FTMS质谱校准mr-TOF。因此，预期在mr-TOF质谱中的峰的所测量位置相对于FTMS质谱中的相同峰的所测量位置将存在至少某一偏移。然而，可进一步约束系统控制器对mr-TOF质谱的搜索。例如，系统控制器200可配置成仅考虑mr-TOF质谱中在FTMS质谱中的潜在对应的峰的有限质量范围内的那些峰。此外，质量峰的位置偏移量可(按绝对值计算，即amu)取决于校准峰自身的m/z，也就是说，相对于FTMS质谱，具有第一m/z的离子在mr-TOF质谱中可经受比具有不同的第二m/z的离子多或少的位置偏移。因此，，针对对应峰的最大m/z偏移约束在整个质谱内可为不恒定的。

一旦具有识别出mr-TOF质谱中的峰，系统控制器就基于mr-TOF和FTMS校准峰之间的峰偏移量而确定用于将飞行时间转换到m/z的经修正校准函数。确切地说，系统控制器200将FTMS峰的位置视为未受温度变化影响，并接着计算将施加到mr-TOF数据上的校正因子以校正由温度漂移产生的飞行时间改变。在优选实施例中，校正因子体现为对用于将原始飞行时间数据转换成质谱的校准函数的参数的调整。

众所周知，TOF>m通过比例常量A而与离子的质荷比m/z的平方根相关。数据获取电子器件的定时延迟还引入定时偏差t₀。公式为m/z＝A(t_m-t₀)²。在最简单的实例中，系统控制器200可在FTMS中查找单个校准峰(或邻近峰的单个组，如上文所论述)并在mr-TOF质谱中查找单个对应峰或峰群组。接着它可根据mr-TOF和FTMS的峰位置之间的偏移确定单个常量校正因子(基本上为标量乘法器)，所述校正因子之后用于调整将TOF>0。当首先确定了温度校正因子时，将温度校正因子施加到例如在质谱仪启动时确定的初始校准函数，以使得在上文作为实例给出的校准函数中，比例常量A修正成A'和/或时间偏移t₀修正成t₀'。经修正校准函数可接着施加到TOF数据以产生温度经校正质谱。这一过程可每隔一定间隔(例如，每隔固定的时间间隔、在一定数目的分析周期之后等)重复，并且校准函数在识别出新温度校正因子之后更新(在以上实例中，以使得A'修正成A”，并接着修正成A”'等，而t₀'修正成t₀”，并接着修正成t₀”'等)。

可替代地，跨越FTMS质谱的范围定位的多个质量峰可用作校准峰。接着，在mr-TOF质谱中识别对应的多个质量峰，并且可通过比较对应峰中的每一个确定温度校正因子/经修正飞行时间与m/z的校准函数。如上文所提到，峰偏移的绝对量可跨越FTMS和mr-TOF质谱中所分析的质量范围发生变化。因此，尽管在那种情况下仍然可获得单个常量校正因子(例如，通过计算跨越m/z范围的不同峰偏移的均值)，但是优选地在那种情况下替代地确定了不恒定温度校正因子，并将其施加到飞行时间到m/z转换公式，例如通过修正比例常量和任何时间偏移，并且还通过例如添加高阶项以考虑跨越质量范围的飞行时间的任何非线性偏移。最简单地，可采用所测量校准峰质量偏移之间的线性内插。可替代地，可采用曲线拟合算法。在优选实施例中，采用通过系统控制器200存储的关于FTMS质谱的校准峰的质心和品质因子以校准mr-TOF质谱。在拟合期间，当比较例如不同拟合的R²时可识别离群值。

在校准期间，可以以下方式使用校准峰的品质因子以优化校准结果：

具有较高密度的校准峰被给定较大权重；

是mr-TOR质谱中的单峰的校准峰被给定较大权重；

在mr-TOR质谱中完全分辨的校准峰被给定较大权重；

仅特定数目n个校准峰(在FTMS和/或mr-TOR质谱中具有最高密度的那些)用于校准；

仅为mr-TOR质谱中的单峰的校准峰用于校准；

仅在mr-TOR质谱中完全分辨的校准峰用于校准；

并不认为此准则列表具有限制性，而是仅阐述一些优选准则。可单独使用一个准则，或可一起使用多个准则，以进一步改善校准质量。

可依据所研究的样本而使用准则。例如，如果在样本的mr-TOF质谱中存在足够的这种单峰，那么为单峰的校准峰的排他性使用是优选的，以使得校准不需要其它更复杂的峰。

所采用的校准峰的数目还可取决于上方提到的准则。单峰的质量越好，所采用的校准峰的数目可越少。

向FTMS和TOF-MS供应所研究的样本的实验可导致所观察的质谱的峰结构随时间推移而变化。例如，可借助于色谱法供应样本，从而使校准峰随时间推移而变化。特定来说，用于选择校准峰的准则和/或所采用的校准峰的数目可随着时间推移而变化。实行此变化的基础是用于所有所测量TOF MS数据的温度校正因子始终以适当方式提供。

在本发明的优选实施例中，特定来说，当预期TOF质谱仪的稳定温度漂移时，在特定时间仅针对所检测的TOF质谱执行详细校准，并在特定时间段中重复。在中间时间仅使用一个或少量校准峰来实行粗略校准。优选地，在此实施例中，使用最相关校准峰，例如，具有最高密度和/或最佳分辨率的峰。这减少了实行校准所需的工作量，同时在另一方面实现了对温度漂移，特定来说，对线性温度漂移的稳定控制。例如，此类线性温度漂移可由TOF质谱仪的组件的热效应诱发。

预期TOF MS质谱的温度依赖性可基本上简单地通过调整上文识别出的公式中的比例常量A来校正。然而，对于TOF MS质谱中的更高水平的质量准确性，可采用进一步校正：例如，可考虑定时偏差t₀，并且可采用不同的比例常量A'。高阶项可添加到m/z与飞行时间的公式中，例如，m/z＝A'(t_m-t₀)²+A”t_m+A”'等等。

关于TOF MS中飞行时间转换成质荷比的进一步讨论可参见例如《通过静电离子计算的单工优化改善飞行时间质谱的校准(Improved Calibration of Time-of-FlightMass Spectra by Simplex Optimization of Electrostatic Ion Calculations)》，Christian等人，《分析化学》2000，72，第3327到3337页。

图2示出质量偏移(也就是说，mr-TOF质谱中所测量的峰位置和FTMS质谱中所测量的峰位置之间的差)相对于如FTMS质谱中所确定的质量数m/z的曲线。应理解，图2中的曲线和数据点仅是为了允许更好的理解上文阐述的原理，并不表示实际或模拟数据点。

图2跨越mr-TOF的一系列不同温度以非线性方式说明其中质量偏移(△m/z)随着m/z改变的实例。具体来说，示出四个不同曲线，表示在mr-TOF的不同温度下△m/z相较于m/z的曲线。已经采用最佳拟合算法来产生标记为F1、F2、F3和F4的曲线。这些曲线可用于调整在mr-TOF的不同温度下飞行时间与m/z的校准函数。在图2的实例中，为了说明，曲线的第一和第二导数在不同温度下针对给定m/z是不同的。

尽管图2指示温度T1到T4，但是这些是为了解释概念，而不是表示个别组件的特定温度。存在许多因素导致mr-TOF 150随着时间推移产生机械和电气漂移，并且难以使mr-TOF的特定组件的温度与特定质量偏移相关。

因此，一般认为不需要获得一组飞行时间与m/z的校准函数(针对不同温度)作为质谱仪10的因子设置的部分以供所有后续使用。然后，此类方法将需要测量mr-TOF的温度，并且需要将适当的预先确定的校准函数施加到mr-TOF，出于上文给出的原因，这难以实行。

替代地，需要的是在实验过程期间每隔一定间隔实行上文所描述的方法，并且“在飞行中”计算定期更新后的校准函数。例如，可在实验开始之前使用已知样本实行初始校准。此已知样本可引入到质谱仪10中，从而跨越优选为将在后续实验期间研究的大多数或所有质量范围产生一系列可识别的校准峰。根据所述已知样本，可获得初始校准函数。接着，实验可开始。例如，图1的布置尤其适合于数据独立分析(DIA)，并且一种采用图1的设备的技术描述于在同一日期提交且名称为《混合质谱仪(Hybrid Mass Spectrometer)》的EP17174365.1中。

初始校准函数可施加到从mr-TOF获得的飞行时间数据以将那些飞行时间转换成m/z，从而形成质谱。然而，在预定时段或预定实验次数之后，例如，可使用上文所描述的技术获得新校准函数，以便产生考虑中间时段内的温度漂移的新校准函数。如已提到，合适的峰从通过实验样品(和/或伴随实验样品的背景物种)产生的那些峰中选择，并用于产生后续的经修正校准函数。

一旦经修正校准函数已经确定，后续飞行时间数据就替代地使用所述经修正校准函数转换成m/z。此过程可在所有实验完成之前一直重复，在此期间可获得其它经修正校准函数以考虑进行中的温度漂移。

(ii)使用前体离子和片段离子两者

在前述内容中，在离子导向模式中采用片段化腔室120，其中前体离子在注入到mr-TOF中之前大体上未进行片段化。因此，从含有基本上相同的数据的两个质谱导出校准函数。谱的差异可因此归于对mr-TOF质谱的温度相关影响。

然而，由质谱仪10实行的大多数实验需要对前体离子物种进行片段化。例如，描述于前述的在同一日期提交且名称为《混合质谱仪(Hybrid Mass Spectrometer)》的EP17174365.1中的DIA分析采用工作流程，其中来自色谱峰的离子作为未片段化前体离子物种在FTMS 110中进行分析以产生MS1谱，而来自相同色谱峰的离子接着通过片段化腔室120进行片段化，并随后通过mr-TOF积聚(任选地)和分析以产生片段离子的MS2质谱。在此类实验中，通过将片段化腔室120切换到离子导向模式从mr-TOF获得MS1质谱——出于根据在上方的(i)中阐述的原理获得温度经修正/经补偿校准函数的目的——可增加总实验时间。通常，使用分辨力约为240,000的质量分析仪在大约2Hz下实行单个前体(MS1)扫描。TOF MS每秒可获得最多500次MS1(或MS2)扫描。

因此，一种替代性选择方案是设置片段化腔室120中的碰撞气体的能量，以使得一些但非全部前体离子进行片段化。接着，可从mr-TOF 150获得MS2质谱，同时允许至少一些前体离子物种到mr-TOF中以用作潜在的校准离子。如前文所提到，峰形和干扰离子物种/同位素的缺少可为将用作校准峰的特定峰所需要的。

系统控制器200可因此配置有考虑这些考虑因素的逻辑指令。例如，系统控制器200可在将获得新校准函数的预定时间将片段化腔室120的碰撞能量设置处于第一能量，从而产生由mr-TOF产生的质谱中的前体和片段离子的混合物。接着，FTMS和mr-TOF质谱比较以观察是否可将足够数目个峰(其可能仅为单峰)识别为合适的校准峰。如果是，那么新校准函数确定，并在存储器中更新以供施加到未来mr-TOF质谱。如果不是，那么可降低碰撞能量以允许更多前体离子物种在不进行片段化的情况下穿过片段化腔室120。接着，重复此分析，直到在FTMS和mr-TOF质谱中的每一个中识别出数目符合要求的校准峰为止。在一些情况下，这可能需要将片段化能量降低到mr-TOF质谱基本上是其中不具有片段数据或不具有片段数据的MS1谱的点。

(iii)仅使用片段离子

mr-TOF质谱温度校正的再另一选择方案仅采用片段离子。在此情况下，来自离子源20的前体离子并不捕集在C阱100中以注入到FTMS 110中，而是替代地穿过C阱并且进入片段化腔室120，前体离子在片段化腔室120中进行片段化。接着，所得片段离子中的一些积聚在提取阱中以供mr-TOF 150分析，以使得随后通过mr-TOF产生MS2扫描。然而，通过片段化腔室120产生的其它片段离子返回到C阱100，在C阱100中这些片段离子被捕集并随后注入到FTMS 110中，以使得FTMS 110还产生MS2谱。接着，可确定温度经补偿校准函数，如前所述。

当质量偏移显著依赖于质量数时，此类技术可为有益的，因为通常片段离子的质量明显不同于(并且因此，经受潜在地明显不同的质量偏移)导出它们的前体离子。

使用MS2谱具有使干扰和化学噪声最小化的优点。这意味着找到合适的峰以用于交叉校准更加简单。

希望在产生有效校准函数时考虑FTMS和mr-TOF质量分析仪的绝对和相对分辨力。例如，如果FTMS的分辨力比如以数量级大于TOF MS的分辨力，那么可能难以成功地识别合适的校准峰，因为在FTMS质谱中识别出的峰的那些假象在TOF MS质谱中可能会缺失(由于较低的分辨力)。截至2017，mr-TOF的典型分辨力可能最多为数万，但是，当然，在未来可设想更高的分辨力。同样地，目前FTMS 110的分辨力(在使用的情况下)至少为100,000，并且至多为几十万，但是在未来仍然可设想更高的分辨力。

然而，FTMS和TOF-MS的特定分辨力对本发明的实施方案来说不是关键的。在典型操作条件下，相比于其它因子，当TOF MS中的温度变化时离子的飞行时间的偏移对TOF MS的总体质量准确性具有大得多的影响。例如，的质量准确度高于百万分之几(例如，+/-3ppm或更好)，并且在任何情况下都独立于分辨率。TOF MS的质量准确度(暂时搁置温度依赖性)与分辨率和峰中检测到的离子数目相关，但是对于含有100个离子的峰，在50到100K分辨率下，质量准确度仍然为大约+/-3ppm或更好。

温度漂移的影响是在几个小时内引入约数十ppm的质量准确度(或更严格地说，额外的质量不准确度)。因此，可清楚地发现一旦考虑到温度偏移对TOF MS产生了主要影响，FTMS和TOF MS的相对分辨率将只对TOF MS的质量准确性产生有限影响。

所必需的就是FTMS质谱中的至少一个峰可与TOF MS质谱中的对应峰利用，并具有可接受的置信度水平。显然，当FTMS和TOF MS装置中的一个的分辨力明显不同于另一个时，峰形可能十分不同，从而使得峰难以匹配。因此需要选择适当的候选峰：特定来说，优选的是，选择大体上不含干扰的离子物种。在FTMS质谱(其通常在相对较高的分辨率下获得)中可见多个邻近峰，然而在相对较低的分辨率下获得的TOF MS质谱中仅可见单个更宽、更扁平的峰。

图3b示出单峰的质量偏移(△m/z)相较于时间(以分钟为单位)的曲线，所述单峰通过将具有m/z 524的离子注入到(菱形数据点)和先前描述的mr-TOF(十字形数据点)中而产生。TOF质谱每一分钟获得，然而质谱每5分钟获得。竖轴尺度是百万分之一。在2小时(120分钟)时段内，在TOF数据点中发现所测量质量出现清楚的且越来越明显的偏移，而在所述时段内，质谱中的峰的质量偏移近乎恒定，至少在ppm水平上近乎恒定。

图3a示出从TOF MS(数据点是十字形)获得的m/z＝524的单峰的未校正的质量偏移(△m/z)相较于时间(以分钟为单位)的曲线。然而，还示出了在根据前述技术校正之后的TOF MS质量偏移(菱形数据点)。尽管经校正质量偏移数据点的标准偏差(如预期)高于质量偏移数据的标准偏差(图3b)，但是如图3a中的未校正(原始)TOF MS数据的斜率所显示，质量峰的系统性漂移已经基本上消除。

尽管已经仅仅是出于说明的目的阐述了数个特定实施例，但是，当然，应理解各种修改和添加是可能的。例如，图1中阐述的组件的特定布置例示了可施加本文中阐述的概念的特别优选配置。但是，可设想数个其它布置。例如，mr-TOF和FTMS装置在图1的布置中可颠倒，以使得中间阱(C阱或其它)将离子引导到mr-TOF中或通过片段化腔室120向下引导到C阱中以注入到FTMS中。此外，并不是在C阱和mr-TOF之间定位单个片段化腔室120，而是每一质量分析仪可替代地具有其自身的专用片段化腔室。这可简化用于从FTMS 110和mr-TOF150两者获得MS2扫描的过程，如上方的方法(iii)中所描述。

图4示出适用于本发明的技术的实施方案的质谱仪的替代实施例。图4的质谱仪的实施例采用分支路径布置。

在图4的实施例中，离子源200耦合到质量选择装置210。可通过如例如图1的实施例中所示的ESI离子源20和其与四极滤质器70的相应耦合来提供此类布置。

如图4中所示，质量选择装置210的输出耦合到分支离子路径220。分支离子路径沿着两个路径中的一个引导从质量选择装置输出的离子。第一路径222将离子引导到其中收集离子以供FTMS分析仪240分析的C阱230(通常为了捕获前体MS1数据，如上文结合图1所论述)。第二路径224将离子引导到片段化腔室250。此处，它们可进行部分片段化(见上文(ii))或完全片段化(见上文(iii))，或片段化腔室250的能量可设置成使得离子穿过且大体上不进行片段化，以通过mr-TOF分析仪270进行后续质量分析(上文的实例(i))。分支离子路径可使用rf电压来顺着第一路径222或第二路径224引导离子。分支离子路径可为分支RF多极杆。适用于图4的实施例中的分支离子路径在US-B-7,420,161中进一步描述。

根据图4中的替代实施例，分支离子路径可用于将离子引导到C阱230以供FTMS分析仪240分析，或通过可在片段化或离子导向模式中操作的片段化腔室250引导到mr-TOF分析仪260以用于TOF分析。从片段化腔室250射出的前体或片段离子在作为组被注入到mr-TOF分析仪270中之前可积聚在离子提取阱260中。由此，可通过如图1中所描述的类似布置来提供片段化腔室250、离子阱260和mr-TOF 270的布置。

因此，根据图4中的替代实施例，可引导离子以通过mr-TOF分析仪270进行分析，而不需要供应FTMS分析仪240的C阱230为空。此类配置可允许FTMS和mr-TOF扫描的并行化增大。由此，较大比例的色谱峰持续时间可用于实行mr-TOF扫描。此外，在此配置中，数个载荷或填充物可在FTMS 240中进行分析之前积聚在C阱中。在此类实施例中，C阱的载荷可分成若干个小型填充物，同时扫描FTMS分析仪，从而获得更能代表跨越整个峰的离子的一群离子。

用于mr-TOF数据中的质量峰的位置的温度校正的技术以其它方式如上文结合图1、2和3所描述。

前述内容提出在FTMS质谱中选择候选校准峰，并接着在mr-TOF质谱中匹配它们。因为FTMS的分辨力一般高于TOF的分辨力，所以匹配到错误峰的可能性降低。然而，本发明不限于此，并且有可能通过在TOF质谱中选择候选峰并接着在FTMS质谱中定位对应峰来获得温度经校正校准函数，其中校准函数从所述比较导出。

此外，不必向飞行时间与m/z的校准函数施加温度校正(以便产生温度经校正校准函数)。实际上，可在整个过程中采用在实验开始时确定的校准函数，而不进行后续修正。接着，质谱(确切地说，m/z数据)——而不是原始飞行时间数据——可使用温度校正因子进行校正，所述温度校正因子基于FTMS质谱中的那一或那些峰的位置而调整质谱中的每个峰的m/z。