法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-04-10
授权
授权
2018-11-16
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K31/58 申请日:20180625
实质审查的生效
2018-10-23
公开
公开
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体为一种能够促进原代成骨细胞增殖和矿化功能的化合物应用领域。
技术背景
目前，龙牙楤木皂苷Ⅳ(Tarasaponin IV)是从五加科(Araliaceae)楤木属(Aralia)植物中提取得到，研究应用还较少的一种化合物，在仅有的有限研究中研究内容有龙牙楤木皂苷Ⅳ对心肌细胞的损伤保护研究，龙牙楤木皂苷Ⅳ的抗炎活性研究等，未发公开资料有研究龙牙楤木皂苷Ⅳ对促进原代成骨细胞增殖和矿化功能有影响的相关内容。
发明内容
本发明的目的在于提供一种龙牙楤木皂苷Ⅳ的新用途，即龙牙楤木皂苷Ⅳ在制备用于预防或治疗骨类疾病药物中的用途。
所述药物能够促进原代成骨细胞增殖或矿化。
所述药物用于预防和治疗骨质疏松症、骨折或关节炎。
所述药物以为片剂、丸剂、胶囊或注射针剂中的任意一种。
所述药物的制备方法可以为目前常规的制备药物片剂、丸剂、胶囊或注射针剂中的任何一种剂型的任何一种制备方法，以下为所述药物片剂的一种具体制备步骤：
(1)龙牙楤木皂苷Ⅳ，可压性淀粉，过100目筛；
(2)将过筛后的龙牙楤木皂苷Ⅳ、可压性淀粉与微粉硅胶和润滑剂混合均匀，过14-24目筛；
(3)将步骤(2)过筛后的物料进行压片。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种龙牙楤木皂苷Ⅳ的新用途，即龙牙楤木皂苷Ⅳ在制备用于预防或治疗骨类疾病药物中的用途。
本发明发现龙牙楤木皂苷Ⅳ可以通过促进前成骨细胞的生长，增加对ALP的需求量，致使ALP利用率升高，促进成骨细胞矿化结节形成，提高骨基质的矿化效果。因此，龙牙楤木皂苷Ⅳ可作为活性成分制备用于预防或治疗骨类疾病的药物。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
(一)龙牙楤木皂苷Ⅳ(Tarasaponin IV)能够促进原代成骨细胞增殖和矿化试验如下：
1材料与仪器
1.1动物
新生24h SD大鼠乳鼠(雄性)10只，北大医学部(实验动物科学部)提供。许可证号：SCXK-(京)2016-0010。
1.2药物及试剂
刺老苞根皮(湖北恩施中药材有限公司批号0P 091101，经北京中医药大学生药系杨瑶珺教授鉴定)；氯仿、乙醇、二氯甲烷、正丁醇、浓硫酸(国药集团)；甲醇、乙腈、甲酸(Thermo Scientific美国)；柱色谱硅胶、薄层层析硅胶GF-254(青岛海洋化工厂)；MCI-GEL大孔吸附树脂(CHP20/P120)(三菱公司日本)；α-MEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25％胰蛋白酶溶液(Gibco美国)；青霉素/链霉素(P/S)、II型胶原酶、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、茜素红S染液、二甲基亚砜(Sigma美国)；磷酸盐缓冲液(PBS)(北京昌盛生物技术有限责任公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶活性测定试剂盒(南京建成生物制品有限公司)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。
1.3仪器
JA2003B电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；核磁共振仪(600MHz)(VarianVnmrs美国)；HLPC(SPD-M20A、ELSD-LT II)、LCMS-IT-TOF(岛津公司日本)；细胞超净操作台(苏州苏洁净化设备有限公司)；CO2培养箱(Thermo>
2方法
2.1龙牙楤木皂苷Ⅳ制备
刺老苞根皮2.0kg以70％乙醇加热回流提取3次，每次加入7L乙醇加热2h，提取物旋转蒸发为400mL浸膏，取200mL浸膏以10％乙醇稀释为2.5L溶液过MCI-GEL大孔树脂，乙醇-水(10％、30％、50％、70％、90％乙醇梯度)梯度洗脱，收集各洗脱部分，回收溶剂，低温真空干燥为粉末。共得到9份样品，分别为10％乙醇Fr.1-4、10％乙醇Fr.5-9、30％乙醇Fr.1-3、30％-50％乙醇Fr.3-4、50％乙醇Fr.1、50％乙醇Fr.2-3、70％乙醇Fr.1、70％乙醇Fr.2-4、90％乙醇Fr.1-3，通过薄层色谱检测。取30％-50％乙醇Fr.3-4部位22.00g，甲醇溶解，用60g硅胶(100～200目)进行拌样，干法装柱，柱体积8L。以CH2Cl2∶MeOH∶H2O＝90∶30∶5、70∶25∶5、70∶30∶6、75∶33∶6、70∶33∶6梯度洗脱，无水甲醇冲柱，依据薄层色谱合并浓缩，得8份样品Fr.A1-8。Fr.A6>
2.2原代成骨细胞培养及鉴定
取新生24h雄性SD乳鼠10只，用75％乙醇浸洗后，在超净操作台内解剖取出颅盖骨，去除其他组织；PBS清洗；加入3×10-3L消化液(0.25％胰蛋白酶液:II型胶原酶溶液＝2:1)37℃消化5min，弃上清液；加入3×10-3L消化液，37℃消化10min，收集上清液，加9×10-3L完全培养基(89％α-MEM、10％FBS、1％P/S)中和消化，重复消化4次，收集液体；离心、吸去上清液，加完全培养基吹打混匀细胞，调整密度，接种于25cm2培养瓶；恒温培养(温度37℃、含5％CO2的空气)。取第3代前成骨细胞，以1×102cells·L-1接种于24孔培养板，1×10-3L/孔；培养48h后，加分化培养基(完全培养基+10mMβ-甘油磷酸钠+5×10-2μg·L-1抗坏血酸)诱导，每2d换液1次；培养4d和14d，分别进行ALP染色和矿化结节染色鉴定。
2.3前成骨细胞活性分析
取第4代前成骨细胞，以25cells·L-1接种于96孔培养板，2×10-4L/孔；培养48h后，加含药(1×10-2、2×10-2、3×10-2、4×10-2、5×10-2、6×10-2、7×10-2、8×10-2、9×10-2、1×10-1μg·L-1)培养基干预培养；实验分组为不含药物的对照组，刺老苞根皮醇提物处理组，另设调零孔，每组3个复孔；48h后，吸去培养液，PBS清洗细胞2次，按MTT细胞增殖及细胞毒性检测测试盒说明检测，即加9×10-5L完全培养基和1×10-5L>-5L二甲基亚砜，低速振荡10min，酶联免疫检测仪测定其490nm处各孔吸光值(A)。
2.4细胞增殖活性检测
取第4代前成骨细胞，以25cells·L-1接种于96孔培养板，2×10-4L/孔；实验分组为不含药物的对照组，刺老苞根皮醇提物处理组(药物含量5×10-4、5×10-3、5×10-2μg·L-1)，另设调零孔，每组3个复孔；培养24h后，加含药培养基(药物含量5×10-4、5×10-3、5×10-2μg·L-1)分别干预24h、48h、72h；吸去培养液，PBS清洗细胞2次，按MTT细胞增殖及细胞毒性检测测试盒说明检测，即加9×10-5L完全培养基和1×10-5L>-5L二甲基亚砜，低速振荡10min，酶联免疫检测仪测定其490nm处各孔吸光值(A)。
2.5ALP活性测定
取第4代前成骨细胞，以1×102cells·L-1接种于96孔培养板，2×10-4L/孔；培养48h后，加含药(5×10-4、5×10-3、5×10-2μg·L-1)分化培养基(完全培养基+10％FBS、10mMβ-甘油磷酸钠、5×10-2μg·L-1抗坏血酸)分别干预2d、4d、6d；每2d换液1次；吸取培养液，离心，收集上清液，按碱性磷酸酶测试盒说明测定。
2.6成骨细胞钙化结节染色
取第4代前成骨细胞，以1×102cells·L-1接种于96孔培养板，2×10-4L/孔；培养48h后，加含药(5×10-4、5×10-3、5×10-2μg·L-1)分化培养基(完全培养基+10％FBS、10mMβ-甘油磷酸钠、5×10-2μg·L-1抗坏血酸)干预；每2d换液1次；14d后，吸去培养液，各孔用PBS清洗3次；加10％中性福尔马林，2×10-3L/孔，固定15min，蒸馏水冲洗3次；按茜素红S染色试剂说明操作。
2.7统计学方法
数据以 3结果 3.1龙牙楤木皂苷Ⅳ与原代成骨细胞鉴定 在龙牙楤木皂苷Ⅳ的制备中，得到的7份样品Fr.D1-7，其中Fr.D1为0.979g，呈白色粉末，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应呈阳性。HR-MS：m/z 1087.5308[M-H]-，分子式为C53H84O23。1H-NMR谱(CD3OD)给出7个甲基质子信号δ0.78，0.83，0.90，0.92，0.93，1.06，1.14，13C-NMR谱中给出烯碳信号δ122.34、δ143.45，表明为齐墩果酸型。13C-NMR谱中糖的端基碳信号δ94.29、δ104.10、δ103.14、δ107.44说明苷元连有4个糖。13C-NMR数据见表1，依据文献(Nguyen> 表1龙牙楤木皂苷Ⅳ的13C-NMR数据
细胞培养24h后，可见不规则伸展状贴壁细胞，48h后细胞呈三角形、长梭形等形态，细胞核清晰可见。分化诱导培养4d后，经ALP染色，荧光倒置显微镜下可见灰黑色颗粒或块状、条状沉淀；分化诱导培养14d后，经茜素红染色，荧光倒置显微镜下可见橙红色钙沉积物。
3.2龙牙楤木皂苷Ⅳ对前成骨细胞活性的影响
表2结果显示，与对照组相比，龙牙楤木皂苷Ⅳ各浓度组干预前成骨细胞24h后，各浓度组细胞生存率增高，均能明显促进前成骨细胞的生长，有统计学差异意义(P＜0.05或P＜0.01)；龙牙楤木皂苷Ⅳ在1～6×10-2μg·L-1浓度范围内细胞生存率呈递增趋势，在6～10×10-2μg·L-1浓度范围内细胞生存率呈逐渐递减趋势。依据实验结果选取0～6×10-2μg·L-1浓度范围研究龙牙楤木皂苷Ⅳ对成骨细胞分化和矿化的影响。
表2龙牙楤木皂苷Ⅳ对前成骨细胞活性的影响
注：与对照组相比较：*P＜0.05，**P＜0.01
3.3龙牙楤木皂苷Ⅳ对前成骨细胞增殖的影响
表3结果显示，与对照组相比较，龙牙楤木皂苷Ⅳ干预成骨细胞24h、48h、72h后，各浓度组(5×10-4、5×10-3、5×10-2μg·L-1)细胞光吸收值均有所上升，且随着时间递增而上升，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；其中，中浓度组(5×10-3μg·L-1)细胞光吸收值明显高于对照组。结果表明，龙牙楤木皂苷Ⅳ可以通过促进前成骨细胞增殖，影响成骨细胞的生长。
表3龙牙楤木皂苷Ⅳ对前成骨细胞活性的影响
注：与对照组相比较：*P＜0.05，**P＜0.01
3.4龙牙楤木皂苷Ⅳ对成骨细胞ALP活性的影响
表4结果显示，与对照组相比较，龙牙楤木皂苷Ⅳ干预成骨细胞2d、4d、6d后，各浓度组(5×10-4、5×10-3、5×10-2μg·L-1)ALP活性均有所下降，且随时间增加而减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。结果表明，龙牙楤木皂苷Ⅳ可以通过降低ALP活性，影响成骨细胞的分化过程。
表4龙牙楤木皂苷Ⅳ对成骨细胞ALP活性的影响
注：与对照组相比较：**P＜0.01
3.5龙牙楤木皂苷Ⅳ对成骨细胞钙化结节形成的影响
表5结果显示，与对照组相比较，龙牙楤木皂苷Ⅳ干预成骨细胞14d后，各浓度组(5×10-4、5×10-3、5×10-2μg·L-1)钙化结节数目和面积增加，且随浓度下降而呈递增趋势；其中，中、高浓度组(5×10-3、5×10-2μg·L-1)钙化结节数目和面积明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。结果表明，龙牙楤木皂苷Ⅳ可以通过促进成骨细胞钙化结节的形成，增强骨基质矿化。
表5龙牙楤木皂苷Ⅳ对成骨细胞钙化结节形成的影响
注：与对照组相比较：**P＜0.01
4结论
本实验首次将龙牙楤木皂苷Ⅳ用于原代成骨细胞的干预研究，分析不同浓度龙牙楤木皂苷Ⅳ对原代成骨细胞分化和矿化的影响。结果表明，原代成骨细胞经龙牙楤木皂苷Ⅳ不同浓度组干预后，细胞光吸收值上升，生存率明显高于对照组，ALP活性下降，矿化结节数目和面积显著增多。分析原因为龙牙楤木皂苷Ⅳ可以通过促进前成骨细胞的生长，增加对ALP的需求量，致使ALP利用率升高，促进成骨细胞矿化结节形成，提高骨基质的矿化效果。
综上所述，龙牙楤木皂苷Ⅳ能够促进原代成骨细胞增殖和矿化功能。可用于预防和治疗骨类疾病，例如骨质疏松症、骨折、关节炎等。
(二)龙牙楤木皂苷Ⅳ的制备
70％乙醇回流提取刺老苞根皮，10％乙醇稀释过柱，30％～50％乙醇梯度洗脱，低温干燥，过硅胶柱，CH2Cl2-MeOH梯度洗脱，乙腈-水溶(0.01％甲酸)梯度洗脱，液相图谱合并浓缩，获得三萜皂苷化合物龙牙楤木皂苷Ⅳ。
(三)用于预防或治疗骨类疾病的药物的制备
本发明的用于预防或治疗骨类疾病的药物的一种具体制备步骤为：
(1)龙牙楤木皂苷Ⅳ，可压性淀粉，过100目筛；
(2)将过筛后的龙牙楤木皂苷Ⅳ50质量份、可压性淀粉50质量份与微粉硅胶2质量份和硬脂酸镁0.5质量份混合均匀，过18目筛；
(3)将步骤(2)过筛后的物料进行压片。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
机译： 肌肉功能增强组合物，其包含人参皂苷Rf，包含人参皂苷Rf的人参皂苷组合物，或其任何一种或多种作为活性成分的混合物
机译： 从属于鸢尾科的植物中分离三萜皂苷的方法，皂苷，可通过所述方法获得的三萜，含有它们的药物组合物以及一种或多种三萜皂苷在制备组合物中的用途
机译： 皂苷的新用途及其分离方法
