一种从南瓜皮渣中超声波辅助提取反式叶黄素的方法

摘要

一种南瓜皮渣废弃资源中反式叶黄素超声波辅助提取方法，通过将南瓜皮渣冻干并进行超微粉碎后加入乙醇石油醚混合溶剂，并在恒温水浴和超声环境下实现从南瓜皮渣中提取反式叶黄素。本发明以2∶1(V/V)乙醇‑石油醚为提取溶剂，辅以低温超声细胞粉碎提取南瓜皮渣中反式叶黄素的方法，提高了反式叶黄素的提取效率及纯度，避免了叶黄素降解，且有效减少有毒溶剂的使用，大大节约了提取时间。

说明书

技术领域

本发明属于天然产物提取领域，具体涉及一种南瓜皮渣反式叶黄素超声波辅助提取方法。

背景技术

南瓜[Cucurbita moschata(Duch.ex Lam.)Duch.ex Poiret]为葫芦科南瓜属植物，营养价值极高，富含叶黄素、β-胡萝卜素等高活性的类胡萝卜素，具有多种食疗保健作用及药用价值，已被誉为特效保健食品，正日益受到国内及世界发达国家的普遍重视。近年来关于南瓜的研究主要在南瓜果肉、南瓜籽、叶等活性成分和有关加工南瓜产品方面。在南瓜的加工和鲜食中，南瓜皮瓤几乎全部废弃，目前还少有对其研究的文献报道，其中含有丰富的类胡萝卜素色素和与南瓜果肉相近的营养成分。如果在生产中予以保留，不仅可以变废为宝，还可以提高南瓜的综合利用价值和经济价值。

有关南瓜色素提取的研究主要集中在常规溶剂提取、微波及超声辅助提取等方面，赵二劳等(超声波辅助提取南瓜黄色素的研究.安徽农业科学，2007，35(36)：12014，12053)确定超声波辅助提取南瓜黄色素的条件为：以95％乙醇为提取溶剂，料液比(g∶mL)1∶10，超声功率80W，提取时间40min。与浸提法相比，超声波辅助提取具有高效、省时、节能的优点。韩明(超声波辅助提取南瓜色素的工艺研究.广州城市职业学院学报，2008，2(4)：29-31)通过单因素试验和正交试验，考察超声波提取南瓜色素的工艺参数和提取效果，实验结果表明，超声波提取南瓜色素的最佳工艺条件为：提取温度70℃，料液比25∶1，超声时间35min，超声功率300W。王洪洋(南瓜瓤中隐黄素的提取及稳定性研究.硕士论文，2014)选取无水乙醇作为提取溶剂，确定超声作用时间30min。通过响应曲面试验优化获得南瓜瓤最佳工艺条件为：温度38.6℃，料液比1∶15.6(g∶mL)，超声波功率135.4W。于开源等(响应法优化南瓜中色素的提取工艺研究.食品研究与开发，2015，36(2)：24-29)以南瓜为原料，利用复合溶剂(乙醇/水/石油醚)萃取南瓜中色素，并优化南瓜中色素提取的工艺条件。付莉等(南瓜皮类胡萝卜素的提取工艺研究.中国农学通报，2012，28(36)：295-299)以丙酮和石油醚为溶剂，采用超声波辅助溶剂提取研究南瓜皮类胡萝卜素最佳提取工艺。结果表明，当超声波功率为150W时，利用丙酮+石油醚为提取溶剂，在提取温度为30℃，提取时间为30min，提取料液比为1∶10时，南瓜皮类胡萝卜素提取率最高。现有研究涉及的提取方法除了存在有毒溶剂使用量大的问题外，提取的色素中存在大量的杂质干扰，使得色素纯度降低，且色素提取物中类胡萝卜素的组成成分过于复杂，对其后续纯化与在实际生产中的应用带来一定影响。此外，上述的一些提取技术及工艺条件还可能造成类胡萝卜素的异构化或降解，从而影响了产品的实际提取得率及生物活性。目前针对南瓜皮渣中反式叶黄素的靶向提取尚未见报道。

发明内容

技术问题

本发明针对现有技术存在的不足，提出一种从南瓜皮渣中超声波辅助提取反式叶黄素的方法，以2∶1(V/V)乙醇-石油醚为提取溶剂，辅以超声波提取南瓜皮渣中反式叶黄素的方法，大大降低了提取南瓜皮渣叶黄素的时间，提高了提取效率，避免了叶黄素的降解。

技术方案

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过将南瓜皮渣冻干并进行超微粉碎后加入乙醇-石油醚混合溶剂，并在恒温水浴和超声环境下实现从南瓜皮渣中提取反式叶黄素。

所述的超微粉碎是指：经过冻干后的南瓜皮渣进行超微粉碎3-5min。

所述的乙醇-石油醚混合溶剂的体积比为2∶1(V/V)，其用量为液料比31∶1-40∶1(mL∶g)。

所述的恒温水浴温度为10-20℃。

所述的超声波是指：超声功率为209W，超声处理时间为20min。

所述的南瓜皮渣提取物中反式叶黄素含量为239.1μg/g d.w.，顺式叶黄素含量为9.1μg/g d.w.

技术效果

与现有技术相比，南瓜皮渣经过超微粉碎3-5min后破碎了颗粒至10-50μm级别，同时利用优选的乙醇-石油醚提取溶剂体积比2∶1(V/V)，液料比31∶1-40∶1(mL∶g)以及超声功率209W，保持恒温水浴10-20℃，处理时间20min的选择性超声波辅助提取条件，获得南瓜皮渣提取物中反式叶黄素含量为239.1μg/g d.w.，顺式叶黄素含量仅为9.1μg/g d.w.，显著提高了南瓜皮渣提取物中反式叶黄素的含量和纯度。

附图说明

图1溶剂比例对南瓜皮渣中反式叶黄素及其顺式异构体提取效果的影响。

图2超声功率对南瓜皮渣中反式叶黄素及其顺式异构体提取效果的影响。

图3液料比对南瓜皮渣中反式叶黄素及其顺式异构体提取效果的影响。

图4提取时间对南瓜皮渣中反式叶黄素及其顺式异构体提取效果的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法作进一步阐述，但不因此而限制本发明。

实施例1

本实施例包括以下步骤：

1)取南瓜皮渣，经过真空冷冻干燥后，置于超微粉碎机中进行超微粉碎处理5min，获得粒度34μm的南瓜皮渣超微粉。

2)准确称取0.50g南瓜皮粉末置于50mL磨口锥形瓶中，加入20mL一定体积比的乙醇-石油醚混合提取液，控制超声提取温度15±1℃，提取时间30min，超声功率210W。

3)提取液中加入2mL 40％KOH-甲醇溶液，摇匀后置于暗处25℃皂化12h，转移至离心管(10000r/min)离心10min，将上清液转入分液漏斗，加入30mL正己烷，震荡1min，再加入38mL 10％硫酸钠溶液，收集上层溶液，45℃旋转蒸发，氮气吹干，用5mL甲醇复溶，采用C30-HPLC-DAD-MS测定叶黄素及其顺式异构体含量。

4)由图1可以看出，随着石油醚比例的增加，反式叶黄素提取量先增后减，顺式叶黄素提取量则逐渐减小，当乙醇与石油醚体积比为2∶1-1∶1时，反式叶黄素提取量最大，为117μg/g d.w.左右。这可能是由于石油醚极性较低，随着石油醚比例的增加叶黄素的溶解性增大，提取较充分，叶黄素提取量增大；当继续增加石油醚比例，溶剂极性下降，脂溶性杂质溶出增多，这些杂质会与叶黄素竞争溶剂，从而降低叶黄素的溶解度。

实施例2

本实施例包括以下步骤：

1)取南瓜皮渣，经过真空冷冻干燥后，置于超微粉碎机中进行超微粉碎处理3min，获得粒度25μm的南瓜皮渣超微粉。

2)准确称取0.50g南瓜皮粉末置于50mL磨口锥形瓶中，加入20mL的乙醇-石油醚(1∶1，V/V)混合提取液，控制超声提取温度20±1℃，提取时间20min，超声功率在100-300W范围内。

3)提取液中加入2mL40％KOH-甲醇溶液，摇匀后置于暗处25℃皂化12h，转移至离心管(10000r/min)离心10min，将上清液转入分液漏斗，加入30mL正己烷，震荡1min，再加入38mL 10％硫酸钠溶液，收集上层溶液，45℃旋转蒸发，氮气吹干，用5mL甲醇复溶，采用C30-HPLC-DAD-MS测定叶黄素及其顺式异构体含量。

4)由图2可以看出，反式叶黄素提取量随超声功率的增大先增后减，而顺式叶黄素提取量则逐渐增加，可能的原因是超声功率较低时，作用于物料上的超声强度不够，叶黄素溶出不完全；超声波的空化效应会破坏细胞壁和细胞膜，随着超声功率的增加，空化效应增强，物料组织的细胞壁破裂速度加快，细胞内叶黄素溶出速率增加，此外，超声功率越大，物料内部分子扩散越快，提取出的叶黄素随之增多。之后，随着超声功率的升高，反式叶黄素提取量下降，可能是由于超声功率过大，破坏了叶黄素的稳定性，使叶黄素发生了降解，使顺式叶黄素提取量增加。

实施例3

本实施例包括以下步骤：

1)取南瓜皮渣，经过真空冷冻干燥后，置于超微粉碎机中进行超微粉碎处理3min，获得粒度30μm的南瓜皮渣超微粉。

2)准确称取0.50g南瓜皮粉末置于50mL磨口锥形瓶中，加入一定量的乙醇-石油醚(2∶1，V/V)混合提取液，控制超声提取温度10±1℃，提取时间20min，超声功率180W。

3)提取液中加入2mL 40％KOH-甲醇溶液，摇匀后置于暗处25℃皂化12h，转移至离心管(10000r/min)离心10min，将上清液转入分液漏斗，加入30mL正己烷，震荡1min，再加入38mL 10％硫酸钠溶液，收集上层溶液，45℃旋转蒸发，氮气吹干，用5mL甲醇复溶，采用C30-HPLC-DAD-MS测定叶黄素及其顺式异构体含量。

4)由图3可以看出，反式叶黄素与顺式叶黄素呈现出相同的趋势，随着料液比的逐渐递增先上升后下降，在液料比为35∶1(mL∶g)时达到最大值。呈现这种现象可能是因为溶剂用量太小时，在短时间内叶黄素浸提就达到平衡，不利于叶黄素的进一步溶出。而随着溶剂用量的增大，物料与溶剂的接触面浓度差增加、渗透压增大，叶黄素越容易浸出，所以提取量增加。随着液料比的继续增大，叶黄素提取量降低，可能是因为有大量的杂质溶出，影响了叶黄素的浸出率，导致提取量降低。

实施例4

本实施例包括以下步骤：

1)取南瓜皮渣，经过真空冷冻干燥后，置于超微粉碎机中进行超微粉碎处理5min，获得粒度39μm的南瓜皮渣超微粉。

2)准确称取0.50g南瓜皮粉末置于50mL磨口锥形瓶中，加入液料比为35∶1(mL∶g)的乙醇-石油醚(1∶1，V/V)混合提取液，控制超声提取温度15±1℃，超声功率180W，提取一定时间。

3)提取液中加入2mL 40％KOH-甲醇溶液，摇匀后置于暗处25℃皂化12h，转移至离心管(10000r/min)离心10min，将上清液转入分液漏斗，加入30mL正己烷，震荡1min，再加入38mL 10％硫酸钠溶液，收集上层溶液，45℃旋转蒸发，氮气吹干，用5mL甲醇复溶，采用C30-HPLC-DAD-MS测定叶黄素及其顺式异构体含量。

4)由图4可以看出，随着提取时间的延长，叶黄素提取量先增后减，而顺式叶黄素提取量则随时间延长逐渐增加。可能的原因是，浸提刚开始时叶黄素没有充分溶出，随着时间的延长，叶黄素的溶出速度大于降解速度，提取量增加，在40min达到最大，但继续延长提取时间，叶黄素提取量下降，这可能是因为超声引起的热量积聚或机械剪切作用导致叶黄素的结构变化，从而导致叶黄素提取率降低，同时顺式叶黄素提取量随之增加。

实施例5

在单因素试验的基础上，选取超声功率(X₁)、提取时间(X₂)、液料比(X₃)三个主效因子，采用Face-centred>1)和叶黄素顺式异构体提取量(Y₂)为响应值进行三因素三水平的中心组合试验并对结果进行方差分析，优化设计及结果见表1和表2。

对表1数据进行回归分析，得到回归方程如下：

Y₁＝168.54+48.09X₁-6.38X₂+17.36X₃+0.89X₁X₂-1.58X₁X₃-0.8X₂X₃+1.98X₁²-0.31X₂²+0.25X₃²

Y₂＝9.63+3.51X₁+1.60X₂+0.11X₃+0.53X₁X₂-0.73X₁X₃-0.83X₂X₃-0.59X₁²-0.26X₂²-1.24X₃²

式中Y₁为反式叶黄素提取量，μg/g>2顺式叶黄素提取量，μg/g>1、X₂、X₃分别为超声功率、提取时间和液料比三个自变量的编码值。

表1 响应面分析试验设计及结果

为检查回归方程的有效性，进一步确定相关因素对反式叶黄素及叶黄素顺式异构体提取量的影响程度，对回归模型进行方差分析，结果见表2。反式叶黄素的回归模型P＜0.0001，说明所选模型极为显著，而失拟项不显著(P＝0.2118＞0.05)，说明模型与试验具有良好的拟合度。模型的决定系数R²＝0.9977，说明该方程与实际情况相符，可以充分的反映出各因素与响应值的真实关系；由自变量的P值可知，模型的一次项X₁、X₂、X₃差异极显著(P＜0.0001)，其他项差异不显著；由自变量F值大小可知，各因素对反式叶黄素提取量的影响由大到小依次为：超声功率＞料液比＞提取时间。叶黄素顺式异构体提取量的回归模型P＜0.0001达到极显著水平，失拟项P＝0.4077不显著，决定系数R²＝0.9440，说明模型与实际的试验拟合很好；由自变量的P值可知，模型的一次项X₁、X₂差异极显著(P＜0.0001)，交互项X₂X₃显著(P＜0.05)，其他项差异不显著。由自变量F值大小可知，各因素对叶黄素顺式异构体提取量的影响由大到小依次为：超声功率＞提取时间＞液料比。

表2 回归方程模型系数的显著性检验

利用Design Expert 8.0.6软件的优化功能，在回归模型的基础上得出超声辅助提取反式叶黄素的最佳工艺参数为：超声功率209W，提取时间20min，液料比31∶1-40∶1(mL∶g)，在此条件下全反式叶黄素的预计提取量为239.1μg/g d.w.，叶黄素顺式异构体的预计提取量为9.1μg/g d.w.。为了检验优化结果，在上述工艺条件下进行验证试验，得到全反式叶黄素的提取量为229.7±9.1μg/g d.w.，叶黄素顺式异构体的提取量为9.4±0.2μg/gd.w.，与预测值接近，说明本优化工艺具有可行性。