杀香鱼假单胞菌DNA疫苗、制备方法及其应用

摘要

本发明公开一种杀香鱼假单胞菌DNA疫苗、制备方法及其应用，其特征在于：该疫苗为pCI‑pcrV。该疫苗以杀香鱼假单胞菌NB2011基因组DNA为模板，经引物P1/P2进行PCR扩增，扩增产物经纯化后与质粒pCI‑neo连接，获得重组质粒pCI‑pcrV，即为杀香鱼假单胞菌DNA疫苗；其中靶基因pcrV为SEQ ID NO：1所示的序列。本发明的疫苗对杀香鱼假单胞菌感染的免疫保护率达70％以上，因此具有较高的保护率，本发明的疫苗在免疫后的8周内的免疫保护率没有明显减弱，因此具有长效优势。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种杀香鱼假单胞菌DNA疫苗的构建及其应用即杀香鱼假单胞菌DNA疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼内脏白点病的病原菌，该菌感染在近十年来造成了大黄鱼养殖产业的严重损失。该菌引起的内脏白点病外观无明显症状，只是在疾病发展的后期内脏器官如脾脏、肾脏等出现大小不一的白色结节，一般在冬春低水温季节发生，鱼类基本不摄食，无法通过投喂口服药物等常规方法有效控制病情，免疫预防可能是控制该病的重要途径。

浙江省象山港分离致病菌P.plecoglossicida NB2011编码一套典型的三型分泌系统(T3SS)，通过形成针状复合体向宿主细胞注射效应蛋白，是重要的毒力因子；V-抗原是T3SS针形注射器头部的重要结构成份，是该系统分泌效应蛋白不可或缺的，在铜绿假单胞菌和耶尔森氏菌中已被验证是重要的保护性抗原，可激发宿主产生保护性免疫，针对此抗原研制疫苗可能获得重大进展。但是，目前杀香鱼假单胞菌疫苗的研究尚未全面展开，DNA疫苗方面的尝试未有报道。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能有效控制杀香鱼假单胞菌感染，免疫保护率高，且免疫持续时间长的杀香鱼假单胞菌DNA疫苗。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种杀香鱼假单胞菌DNA疫苗，该疫苗为pCI-pcrV。

本发明上述的杀香鱼假单胞菌DNA疫苗，该疫苗以杀香鱼假单胞菌NB2011基因组DNA为模板，经引物P1/P2进行PCR扩增，扩增产物经纯化后与质粒pCI-neo连接，获得重组质粒pCI-pcrV，即为杀香鱼假单胞菌DNA疫苗；

所述引物序列为：

P1:5’-GGAATTCATGGCAAGGATCGAAGAGG-3’，

P2:5’-GCGTCGACCTACCCTAAAGCGGTTTTCAG-3’；

所述靶基因pcrV为SEQ ID NO：1所示的序列，具体为：

5’-ATGGCAAGGATCGAAGAGGTTGGAGTAAATCGTCTAGGTTCGGTGCAGGAATCAGAAGTGTCGCCGGATGCGGTGGCGAGACTGCTGAAGAGCTTGCACGAAAACAAGGTTGAACTAGTGCTGGATGGGCACAGGTTGACCGCTAAGCAGGCCGAAAAAATATTTGTAGCGCTGCTGAGTGATGGTGGCAGTGAAGGTGGCTCGCCAGACGAAAATGTGCAGGCAATCCGCAAGGCAATTCAGGGGCAGGCCGGAAAAGCCTTAGAAGTTGGTGAGTTGTTCATGCACCTGCCATCGCAGCGGCTTGATGTCATGATTATTGCGGGGTTCACTGAAATCCTTCAGGGGCAGGCCGCAAAAAAAAATAGTCAAAGTGACGAATTAAAGAGCCTGTCGGTAGAGTTGAAAATCTATAGCGTTATTCAGTCGCAAGTCAGTGCCGCGCTTGCCAAAAAAGAAGCGTTTGATATTTCGGCATCTGGCGTGAACCTGATGGATTACAAGTTGTATGGTTATACCAGCGCTGAACAGTGGGCCGGTTCAAAGGAACGCGTCTTTTTAGAAAAGCTGGATACGCATTCCCGCGAGGGCATGAGCATCAGAGAGTTTCTTGAGGGTGGGCCAAAGGAGACGGGCAAACTGAGTAACTTGCAAAACAGCTATGCTTACGAAAAGGATAATAATCCGCTCCAGAATTTCTCTACAACGCTTGCAGATCGCTCCCGGCCTCTGGGGGATAGTGTGAATGAAAAATCAGCGCAACTAAATGAGACAAACGCTCGTTATAATGCCGTGATAGATGCCTTTAGCAGGATGGTTGATAAGTTTGATAAGTTGCTGAAAACCGCTTTAGGGTAG-3’。

作为优选，本发明所述的杀香鱼假单胞菌DNA疫苗，其中所述重组质粒pCI-pcrV在磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释到终浓度为100μg/mL，作为疫苗制备液，所述疫苗为注射剂。

本发明上述的磷酸盐缓冲液的组成成分按重量百分比为：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na₂HPO₄·12H₂O,0.024％NaH₂PO₄,余量为水。

本发明还提供一种上述杀香鱼假单胞菌DNA疫苗的制备方法，制备步骤包括：

以杀香鱼假单胞菌NB2011基因组DNA作为模板，采用引物P1/P2进行PCR扩增；

PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃45s，59℃45s，72℃45s，30个循环后在72℃终末延伸8min；

PCR产物纯化后与用EcoRⅠ和SalⅠ酶切的pCI-neo质粒连接，连接液转化到大肠杆菌DH5α后在含有氨苄青霉素的LB平板上培养18-24h，挑取阳性克隆转接含氨苄青霉素的LB培养液中培养，提取重组质粒，经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切验证为获得重组质粒pCI-pcrV，即为杀香鱼假单胞菌DNA疫苗。

具体的，上述杀香鱼假单胞菌DNA疫苗的制备方法，其中：PCR产物用生工DNA纯化试剂盒纯化，将纯化的PCR产物和质粒pCI-neo用EcoRⅠ酶和SalⅠ酶双酶切，回收相应片段，加入T₄DNA连接酶，建立连接反应，16℃连接2h后转化大肠杆菌DH5α后在含氨苄青霉素的LB培养基上培养18-24h，筛选转化子提取质粒，经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定后即为pCI-pcrV。

本发明上面所述的LB培养基的组成成分按重量百分比为：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；所述的氨苄青霉素在上述LB固体培养基中的质量浓度为50μg/ml。

本发明还提供一种质粒pCI-pcrV在制备杀香鱼假单胞菌疫苗中的应用。

本发明还提供一种杀香鱼假单胞菌DNA疫苗在大黄鱼养殖业中的应用。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明的疫苗对杀香鱼假单胞菌感染的免疫保护率达70％以上，因此具有较高的保护率。

2.本发明的疫苗在免疫后的8周内的免疫保护率没有明显减弱，因此具有长效优势。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，并非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施实例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

(1)质粒提取、DNA(PCR)产物纯化均使用“上海生工生物工程有限公司”的相应试剂盒；

(2)质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌均采用Hanahan的方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress2016)；

(3)所有限制性内切酶和连接酶均购自“TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司”。

实施例1

DNA疫苗质粒pCI-pcrV的构建：

以杀香鱼假单胞菌NB2011基因组DNA作为模板，采用引物P1/P2进行PCR扩增，PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃45s，59℃45s，72℃45s，30个循环后在72℃终末延伸8min。PCR产物用生工DNA纯化试剂盒纯化。将纯化的PCR产物和质粒pCI-neo用EcoRⅠ酶和SalⅠ酶双酶切，回收相应片段，加入T₄DNA连接酶，建立连接反应，16℃连接2h后转化大肠杆菌DH5α后在含氨苄青霉素的LB固体培养上培养18-24h，筛选转化子提取质粒，经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定后即为重组质粒pCI-pcrV。

PCR引物为：

P1:5’-GGAATTCATGGCAAGGATCGAAGAGG-3’(为SEQ ID NO：2所示的序列)；

P2：5’-GCGTCGACCTACCCTAAAGCGGTTTTCAG-3’(为SEQ ID NO：3所示的序列)。

所述菌株NB2011(杀香鱼假单胞菌NB2011)保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.8985，分类命名为杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，保藏日期为2014年4月1日，保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号。

所述LB培养基的组成成分按重量百分比为：1.0％蛋白胨，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；其中氨苄青霉素在LB培养基中的质量浓度为50μg/ml。

实施例2

疫苗pCI-pcrV的应用

步骤1)疫苗和原始质粒制备液的准备：将上述pCI-pcrV质粒(DNA疫苗)在PBS中稀释到终浓度100μg/ml，即为疫苗制备液；将原始质粒pCI-neo在PBS中稀释到终浓度100μg/ml，即为原始质粒制备液。

所述PBS组成成分按重量百分比为：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na₂HPO₄·12H₂O,0.024％NaH₂PO₄,余量为水。

步骤2)疫苗的接种：将150尾大黄鱼(每尾重约100g)随机分为3组，每组50尾，将这3组分别命名为A、B、C组。A、B两组分别经腹腔注射上述步骤(1)的疫苗制备液和原始质粒制备液，C组(对照组)每尾鱼经腹腔注射200μL磷酸盐缓冲液。

步骤3)杀香鱼假单胞菌悬液的制备：在LB培养基中培养杀香鱼假单胞菌NB2011至OD₆₀₀＝0.8，4℃，6000×g，离心5min，收集菌体，重悬浮于PBS中，调节终浓度至1×10⁵cells/mL,即为NB2011菌悬液。

步骤4)疫苗的免疫保护效应检测：在步骤2)免疫注射后第4周、第8周分别自各实验组取10尾鱼，用上述步骤3)准备的菌悬液腹腔注射，每尾鱼注射0.2mL；在以后的14d中，每天观察并记录各组鱼的发病和死亡情况，统计各组鱼的总死亡数量，第4周：A组，1尾；B组，7尾；C组，10尾；第8周，A组，3尾；B组，8尾；C组10尾。利用下列公式计算相对免疫保护率(RPS):

RPS＝(1-免疫组鱼的死亡率/对照组的死亡率)×100

由此得出疫苗pCI-pcrV免疫4周和8周的免疫保护率分别为90％和70％，原始质粒DNA注射的免疫保护率分别为30％和20％，揭示质粒DNA可作为免疫佐剂起到一定程度的免疫增强作用。而本发明制备的pCI-pcrV是一种有效的DNA疫苗；其免疫保护率高且免疫周期长。

序列表

<110> 浙江万里学院

<120> 杀香鱼假单胞菌DNA疫苗、制备方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 858

<212> DNA

<213> 靶基因pcrV(自带序列)

<400> 1

atggcaagga tcgaagaggt tggagtaaat cgtctaggtt cggtgcagga atcagaagtg 60

tcgccggatg cggtggcgag actgctgaag agcttgcacg aaaacaaggt tgaactagtg 120

ctggatgggc acaggttgac cgctaagcag gccgaaaaaa tatttgtagc gctgctgagt 180

gatggtggca gtgaaggtgg ctcgccagac gaaaatgtgc aggcaatccg caaggcaatt 240

caggggcagg ccggaaaagc cttagaagtt ggtgagttgt tcatgcacct gccatcgcag 300

cggcttgatg tcatgattat tgcggggttc actgaaatcc ttcaggggca ggccgcaaaa 360

aaaaatagtc aaagtgacga attaaagagc ctgtcggtag agttgaaaat ctatagcgtt 420

attcagtcgc aagtcagtgc cgcgcttgcc aaaaaagaag cgtttgatat ttcggcatct 480

ggcgtgaacc tgatggatta caagttgtat ggttatacca gcgctgaaca gtgggccggt 540

tcaaaggaac gcgtcttttt agaaaagctg gatacgcatt cccgcgaggg catgagcatc 600

agagagtttc ttgagggtgg gccaaaggag acgggcaaac tgagtaactt gcaaaacagc 660

tatgcttacg aaaaggataa taatccgctc cagaatttct ctacaacgct tgcagatcgc 720

tcccggcctc tgggggatag tgtgaatgaa aaatcagcgc aactaaatga gacaaacgct 780

cgttataatg ccgtgataga tgcctttagc aggatggttg ataagtttga taagttgctg 840

aaaaccgctt tagggtag 858

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

ggaattcatg gcaaggatcg aagagg 26

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

gcgtcgacct accctaaagc ggttttcag 29