一个用于构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用

摘要

本发明公开了一个用于构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用。本发明首先提供了一个构建所述重组TM4噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，所述重组穿梭载体文库包括19个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌谷氨酸家族19个成员基因两侧的同源臂序列。本发明构建的重组TM4噬菌体文库可以用于这些基因的敲除，验证这些基因是否是结核分枝杆菌的必需基因，用于构建基因突变替换菌株，用于构建基因敲除突变菌株，临床分离这些基因突变后对突变基因酶活性功能的研究，为结核分枝杆菌氨基酸代谢药物开发提供潜在靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌技术领域，更具体地，涉及一个用于构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用。

背景技术

结核病是世界性的疾病难题，在感染人体后潜伏期长，生长缓慢，容易产生耐药性，传统的治疗药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等，由于结核分枝杆菌耐药问题，开发新的药物治疗结核病至关重要。结核分枝杆菌的一个重要特点就是含有大量的PE、PPE蛋白，这些蛋白的合成需要大量的脯氨酸、谷氨酸，PE、PPE蛋白家族的功能大部分都不明确，从结核分枝杆菌的脯氨酸、谷氨酸的代谢途径着手寻找抑制其代谢的药物将会从源头上抑制PE、PPE蛋白的合成，大大削弱PE、PPE蛋白的表达，对治疗结核病有很大作用。脯氨酸在细胞的抗逆性过程中发挥重要功能，保护细胞的膜系统，植物、细菌、动物中已有很多发现，脯氨酸代谢过程中鸟氨酸、谷氨酸是脯氨酸合成的前体，抑制鸟氨酸、谷氨酸的利用将会阻止脯氨酸的合成，非常有意思的是我国传统中药紫堇具有治疗肺结核及相关肺部疾病的记载，如《陕西中草药》提到能治肺结核咳血、《贵州草药》提到治疗肺痨咳血等，而在紫堇属深山紫堇中有发现δ-N-乙酰鸟氨酸，δ-N-乙酰鸟氨酸是否是治疗结核病的成分还不清楚，但是已经被证明在昆虫或细菌伤害拟南芥属植物时植物会分泌很多δ-N-乙酰鸟氨酸(Adio AM，2011，Plant cell)，可以看出δ-N-乙酰鸟氨酸是具有杀虫、杀菌作用的，虽然具体机制还不清楚，但是证明了结核分枝杆菌的鸟氨酸、谷氨酸、脯氨酸代谢作为药物研究方向的可能。鸟氨酸、谷氨酸、脯氨酸的合成所需的酶属于谷氨酸家族。

谷氨酸家族代谢是否影响PE、PPE蛋白的合成还不清楚，谷氨酸家族基因是否都是必需基因也需要进行验证，谷氨酸家族氨基酸代谢能否作为结核病药物开发方向也需通过相关研究进行论证。

发明内容

本发明的目的是为了解决相关研究问题，构建了一种重组TM4噬菌体文库，可以用于结核分枝杆菌谷氨酸家族基因的敲除，验证这些基因是否是结核分枝杆菌的必需基因，用于构建基因突变替换菌株，用于构建基因敲除突变菌株，临床分离这些基因突变后对突变基因酶活性功能的研究，为结核分枝杆菌氨基酸代谢药物开发提供潜在靶点。

本发明的第一个目的是提供一个用于构建敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库。

本发明的第二个目的是提供构建所述的重组穿梭载体文库所需的引物组合。

本发明的第三个目的是提供一个用于敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因的噬菌体文库。

本发明的第四个目的是提供所述重组穿梭载体文库在制备敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述噬菌体文库在敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因中的应用。

本发明的第六个目的是所述噬菌体文库在构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一个用于构建敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，所述重组穿梭载体文库包括19个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌谷氨酸家族19个成员基因两侧的左右同源臂序列，其中，19个成员基因为Rv1654、Rv1652、Rv1655、Rv1656、Rv1658、Rv1659、Rv1653、Rv2220、Rv2222c、Rv1878、Rv2860c、Rv2918c、Rv2221c、Rv3859c、Rv3858c、Rv3704c、Rv2427c、Rv2439c、Rv0500。

结核分枝杆菌谷氨酸家族相关基因编号及名称如下：

优选地，所述19个重组穿梭载体中插入的19个成员的基因两侧的左右同源臂序列需要满足以下条件：利用所述重组穿梭载体文库构建的噬菌体文库用于敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因时，所敲除的结核分枝杆菌的Rv1654、Rv1652、Rv1655、Rv1656、Rv1658、Rv1659、Rv1653、Rv2220、Rv2222c、Rv1878、Rv2860c、Rv2918c、Rv2221c、Rv3859c、Rv3858c、Rv3704c、Rv2427c、Rv2439c、Rv0500的基因片段依次如SEQ.ID.NO.1～19所示片段。

具体对应如下：

敲除结核分枝杆菌Rv1654基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

敲除结核分枝杆菌Rv1652基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

敲除结核分枝杆菌Rv1655基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；

敲除结核分枝杆菌Rv1656基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；

敲除结核分枝杆菌Rv1658基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；

敲除结核分枝杆菌Rv1659基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；

敲除结核分枝杆菌Rv1653基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；

敲除结核分枝杆菌Rv2220基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；

敲除结核分枝杆菌Rv2222c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；

敲除结核分枝杆菌Rv1878基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；

敲除结核分枝杆菌Rv2860c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；

敲除结核分枝杆菌Rv2918c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示；

敲除结核分枝杆菌Rv2221c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示；

敲除结核分枝杆菌Rv3859c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示；

敲除结核分枝杆菌Rv3858c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.15所示；

敲除结核分枝杆菌Rv3704c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.16所示；

敲除结核分枝杆菌Rv2427c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.17所示；

敲除结核分枝杆菌Rv2439c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.18所示；

敲除结核分枝杆菌Rv0500基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.19所示。

优选地，构建流程为将19个成员基因两侧的左右同源臂序列插入到p0004S载体中，得到阳性p0004S重组质粒；用限制性内切酶分别酶切phAEB159和p0004S重组质粒，连接片段，得到重组穿梭载体。

优选地，所述穿梭载体为phAEB159。

更优选地，在所述穿梭载体为phAEB159的插入位置为PacI酶切位点处。

同时，本发明还提供了一组用于获得所述19个成员的基因两侧的左右同源臂序列的引物组合，包含38对引物，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.20～95所示。

引物与扩增片段的对应关系见表1。

表1：

进一步，本发明还提供了一个用于敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因的噬菌体文库，所述噬菌体文库含有19种噬菌体，分别含有上述的19个重组穿梭载体。

优选地，所述噬菌体为TM4噬菌体。

另外，以下所述应用也应在本发明的保护范围之内：

所述引物组合在制备敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需重组穿梭载体文库中的应用。

所述重组穿梭载体文库在制备敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库中的应用。

所述噬菌体文库在敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因中的应用。

所述噬菌体文库在构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌中的应用。

另外作为一种可选择的优选方案，本发明还提供了一种构建所述重组穿梭载体文库(敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库)的方法，包括以下步骤：

S1.设计引物，引物核苷酸序列信息如SEQ.ID.NO.20～95所示；

S2.以结核分枝杆菌H37Rv基因组为基因模板，用上述引物进行PCR，分别扩增欲敲除基因的左右同源臂；

S3.将扩增的到的左右同源臂连接入p0004S载体中，得到阳性p0004S重组质粒；

S4.用限制性内切酶分别酶切phAEB159和p0004S重组质粒，连接片段，得到重组穿梭载体。

同时，构建所述敲除结核分枝杆菌基因用噬菌体文库的方法，包括以下步骤：

S1.制备耻垢分枝杆菌感受态细胞；

S2.将构建好的重组穿梭载体电转到耻垢分枝杆菌，进行培养；

S3.挑选噬菌斑，感染耻垢分枝杆菌，收集噬菌体裂解液。

另外，利用所述噬菌体文库敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因的方法，包括以下步骤：

S1.培养结核分枝杆菌；

S2.加入噬菌体，感染结核分枝杆菌；

S3.感染后的结核分枝杆菌涂布在潮霉素抗性培养基上；

S4.挑选单菌落，提取基因组，进行PCR敲除验证。

其中，本发明涉及到的基因敲除技术原理：噬菌体介导的同源重组。DNA同源重组是指具有同源序列的DNA分子之间在同源重组相关蛋白参与下发生的遗传信息重组，根据这个原理可以对基因进行特异敲除。在待敲除基因两侧选取同源臂，两侧同源臂克隆到噬菌体包装载体筛选基因两侧后形成穿梭质粒，穿梭质粒电转到耻垢分枝杆菌中后可形成噬菌体，产生的噬菌体感染待敲除菌株后，由于同源臂的存在，会使质粒与待敲除菌株DNA发生同源重组，使筛选基因替换目的基因从而达到基因敲除的目的，敲除成功的菌株可以通过筛选基因进行筛选。

其基因敲除实验流程(图1)：首先构建同源交换位点(AES)，随后将其整合到结核分枝杆菌噬菌体基因组，获得噬菌粒(phasmid)；将噬菌粒导入耻垢分枝杆菌，获得整合有同源交换位点的重组噬菌体，经体外扩增获得高滴度的重组噬菌体，对结核分枝杆菌进行转染；将转染后的结核分枝杆菌涂布到潮霉素抗性的固体培养基，37℃培养4-5周，挑取单克隆，通过PCR等方式进行验证。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明构建的敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用重组TM4噬菌体文库可以用于这些基因的敲除，验证这些基因是否是结核分枝杆菌的必需基因，用于构建基因突变替换菌株，用于构建基因敲除突变菌株，临床分离这些基因突变后对突变基因酶活性功能的研究，为结核分枝杆菌氨基酸代谢药物开发提供潜在靶点。

附图说明

图1为采用噬菌体介导的同源重组进行基因敲除的原理。

图2为构建TM4噬菌体敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因的位置示意图。

图3为结核分枝杆菌H37Rv Rv2222c基因敲除基因示意图。

图4为结核分枝杆菌H37Rv Rv2222c基因敲除后的菌落。

图5为结核分枝杆菌H37Rv Rv2222c基因敲除后PCR验证结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1构建重组穿梭载体文库的引物组合

根据结核分枝杆菌谷氨酸基因家族(Rv1654、Rv1652、Rv1655、Rv1656、Rv1658、Rv1659、Rv1653、Rv2220、Rv2222c、Rv1878、Rv2860c、Rv2918c、Rv2221c、Rv3859c、Rv3858c、Rv3704c、Rv2427c、Rv2439c、Rv0500)在结核分枝杆菌基因组中的位置，在选定合适的目的序列上选择合适的片段长度作为左右同源臂位置设计引物(600-1000bp左右)。

其中，敲除Rv1654的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

敲除Rv1652的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

敲除Rv1655的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；

敲除Rv1656的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；

敲除Rv1658的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；

敲除Rv1659的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；

敲除Rv1653的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；

敲除Rv2220的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；

敲除Rv2222c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；

敲除Rv1878的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；

敲除Rv2860c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；

敲除Rv2918c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示；

敲除Rv2221c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示；

敲除Rv3859c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示；

敲除Rv3858c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.15所示；

敲除Rv3704c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.16所示；

敲除Rv2427c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.17所示；

敲除Rv2439c的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.18所示；

敲除Rv0500的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.19所示。

敲除的位置如图2所示。

PCR引物(LF为左臂上游引物；LR为左臂下游引物；RF为右臂上游引物；RR为右臂下游引物)为SEQ.ID.NO.20～SEQ.ID.NO95所示

实施例2构建敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库

使用实施例1中的引物组合，构建重组穿梭载体文库(敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库)。

1、以结核分枝杆菌H37Rv为模板，以使用实施例1中的引物组合为引物，用KOD高保真酶做PCR，分别过扩增相应片段。

其中，按照如下体系分别进行左右臂的扩增：

PCR反应条件为：

PCR完成后，1％琼脂糖凝胶电泳，用天根胶回收试剂盒做胶回收。测定PCR产物胶回收浓度。

2、第二次PCR的回收产物两端加上酶切位点，与p0004S载体分别用相对应限制性内切酶(包括Van91I、DraIII、SfiI、BglI等)酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，并回收所需片段。回收后的左右臂PCR产物与p0004S载体片段连接构建为p0004S重组质粒。提取质粒送出测序，验证基因左右臂是否正确插入到p0004S载体中，得到阳性的p0004S重组质粒。

3、p0004S重组质粒用PacI酶切后的产物连接到穿梭载体phAEB159，构建成重组phAEB159穿梭质粒。

结果：同源臂与穿梭载体phAEB159连接转化大肠杆菌感受态后，挑选的单菌落经过测序，验证了同源臂序列准确性，成功构建了穿梭载体文库。

实施例3构建敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库

将实施例2中获得的穿梭载体电转到耻垢分枝杆菌中，获得整合有同源臂的重组噬菌体，经体外扩增获得高滴度的重组噬菌体。

具体操作为：

1、制备耻垢分枝杆菌感受态细胞；

2、将实施例2获得的穿梭载体电转到耻垢分枝杆菌感受态细胞中；

3、电转后的耻垢分枝杆菌涂布到含有潮霉素的抗性筛选培养基上；

4、挑取噬菌斑，感染新鲜培养的耻垢分枝杆菌，收集噬菌体裂解液。

结果：成功长出了噬菌斑，挑取噬菌斑感染耻垢分枝杆菌后，从收集的噬菌体裂解液中获得了高滴度的噬菌体。

实施例4利用噬菌体文库敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因

1、具体操作为：

以结核分枝杆菌Rv2222c基因敲除为例：收集10ml待敲除结核分枝杆菌，重悬buffer重悬后与噬菌体混匀，24h后离心，将菌体涂布到潮霉素抗性培养基上，37℃过夜培养。挑取单菌落，摇菌后收集基因组，PCR验证敲除效果。

敲除引物及PCR体系、PCR条件如下：

Rv2222c敲除验证引物：

LYZFP-F：5'-GATCAGATCAACTACCTCGG-3'；

LYZRP-R：5'-GTGGACCTCGACGACCCTAG-3'；

RYZFP-F：5'-TGGATCTCTCCGGCTTCACC-3'；

RYZRP-R：5'-GCCAGCATTAGCACGTAGTCG-3'。

KOD PCR体系(50μl体系)为：

KOD PCR条件：

2、结果：成功长出了单菌落，PCR验证后证明敲除成功。其中结核分枝杆菌Rv2222c基因敲除示意图见图3，Rv2222c基因敲除菌落见图4，Rv2222c基因敲除PCR验证结果见图5。

应用本发明所述方法对谷氨酸基因家族的其他基因进行敲出均可以成功长出了单菌落，并证明敲除成功。

结果说明，成功构建了谷氨酸家族基因敲除用TM4噬菌体文库，能用于结核分枝杆菌谷氨酸家族基因敲除。

序列表

<110> 上海晶诺生物科技有限公司

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<211> 538

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 1

aatacggcgg caacgcgatg accgacgaca cgctgcggcg cgcgttcgcc gccgacatgg 60

cgtttctgcg caactgcggc atccatcccg tcgtggtgca cggcgggggg ccgcagatca 120

ccgccatgct gcggcggctc ggcatcgagg gcgacttcaa gggcggattc cgggtcacca 180

cacccgaagt gctcgacgtg gcccggatgg tgctgttcgg tcaggtgggc cgggaactgg 240

tcaacctgat caacgcgcac ggaccgtatg ccgtcgggat caccggcgag gacgcgcagc 300

tgttcaccgc cgtgcggcgc agcgtcaccg tcgacggcgt ggccaccgac atcggcctgg 360

tcggcgacgt cgaccaggtg aacaccgcgg caatgctgga tctggttgcg gcgggccgga 420

tcccggtggt gtccacgctg gccccggatg ccgacggcgt ggtgcacaac atcaacgccg 480

acaccgccgc cgcggcggtc gccgaagccc tgggcgccga aaagctgttg atgctcac 538

<210> 2

<211> 604

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 2

ccgctggccc atcgagtagt cgaacccacc gaagctgccg tgctcggtgg ccatgacgcc 60

gtcttcttgg ccttgccgca cgggcattcg gcggtgttgg cgcagcaact gagccccgag 120

acactgatca tcgactgcgg ggcggacttt cggctcaccg acgccgccgt ctgggagcgg 180

ttctacgggt cgtcgcacgc cggtagctgg ccgtatgggt tgcccgagct gccgggcgcg 240

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gtcatcgggt cggcgcgcgc ctacaacatc gccggcgtcc accggcacac ccccgagatc 480

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atcccggcct cccgtggcat cctggccacc tgcacggcac gcacccgatc acccctgtcg 600

cagc 604

<210> 3

<211> 851

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 3

ccccgatagc gctggccagc ggtgacggcg ccgtggtcac cgacgtggac ggcagaacct 60

atatcgacct gctcggcggc atcgcggtca acgtgctggg ccatcgccac cccgcggtca 120

tcgaggccgt cacccggcag atgtcgacgc tggggcacac ctccaacctg tatgccaccg 180

aaccgggcat cgcgctggcc gaggagctgg tcgcgctgct gggggccgac cagcggacgc 240

gagtgttctt ctgcaactcc ggcgccgagg ccaacgaggc ggcgttcaag ctgtctcggc 300

tcaccggacg cacgaaactg gtcgccgccc acgacgcctt ccacggccgc accatgggct 360

cgctggcgct caccggacaa ccggccaagc aaacgccgtt cgcgccgctg cccggcgacg 420

tcacgcacgt cggctacggc gacgtcgacg cgttggccgc cgccgtcgat gaccacaccg 480

ccgcggtgtt cctggaaccg atcatggggg agagcggggt cgtcgtcccg cccgcgggct 540

accttgccgc cgcccgcgac atcacggcgc ggcgcggcgc gctgctggtg ctcgacgagg 600

tgcaaaccgg gatgggccgc accggagcgt tcttcgccca ccagcacgac ggcatcaccc 660

cggacgtggt gaccctggcc aagggtctgg gcggcgggct gccgatcggt gcctgcctgg 720

ccgtcgggcc ggccgccgaa ctactgaccc caggcctgca cggcagcacc ttcggcggca 780

acccggtctg cgccgcggcg gcgctggcgg tgctacgggt gctggcgagc gacggcctgg 840

tccgccgcgc c 851

<210> 4

<211> 545

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 4

cacccggttc tccttcgagc tgggcatcgc gcagctgggc gggcatgccg tcgtcgtcga 60

cagcggcagc acccagctgg gccgcgacga aaccctgcag gacaccgcaa aggtgttgtc 120

ccgctacgtc gatgccatcg tctggcgaac cttcggccaa gagcggctgg acgccatggc 180

gtcggtcgcg acggtgcccg tgatcaacgc gctctccgat gagttccatc cgtgtcaggt 240

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cgcggccgcc gccggcgccg acgttctggt caccgacacc tggacgtcga tgggccagga 540

aaacg 545

<210> 5

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

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tcatacggca gcgggcgctg gactgcggcg cggtggaggc tgtcgtcgtc gacgcccgcg 120

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tccggttcga agtcgggttc gcctcgctgg caccggattt agaggtgttg gcgccggtgc 360

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ggtgctgttt cgggccgggc tgctcaccga ggagcaacgc gacgggctgc tcgccggcct 180

ggacagcctc gcccaagacg tcgccgacgg cagcttcggc ccgctggtca ccgacgagga 240

cgtgcatgcc gcgctggagc ggggcctgat cgaccgggtc ggaccggacc tgggcggccg 300

actgcgggcc gggcgctcgc gcaacgacca ggtggccgcg ctgtttcgga tgtggctgcg 360

cgacgcggtg cgccgggtcg ccaccggtgt gctcgacgtg gtcggtgcgc tggcagagca 420

ggccgccgca cacccgagcg ccatcatgcc cggcaaaacc cacctgcagt ccgcccagcc 480

gatcctgctg gcacaccatc tgctcgcgca cgcccacccc ctgctgcgcg acctggaccg 540

catcgtcgac ttcgacaaac gcgcggcggt gtccccgtac ggctcgggcg ccttggccgg 600

ctcgtcgctg ggcctggatc ccgacgcgat cgccgcggac ctcggtttct cggctgccgc 660

ggacaactcc gtcgacgcga ccgccgcccg cgacttcgcc gccgaggcgg cgttcgtgtt 720

cgccatgatc gccgtcgacc tgtcccggct ggctgaggac atcatcgtct ggagctcgac 780

ggaattcggc tacgtcacgt tgcatgactc gtggtccacc ggtagctcga tcatgccgca 840

gaagaagaat ccggacatcg ccgagctggc ccgcggcaag tccgggcggc tgatcggaaa 900

cctggccggg ctgctggcca ccctgaaagc ccagcccctg gcctacaacc gcgacctgca 960

ggaagacaag gagccggtgt tcgattcggt ggcccagctg gagctgctgc tgccggcgat 1020

ggccgggctg gtggccagcc tgaccttcaa tgtccagcgg atggcggagc tggccccggc 1080

cggctatacg ttggccaccg atctcgccga atggcttgtg cggc 1124

<210> 7

<211> 777

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 7

cccgactacg ccgccgccgg ggtgttcacc cgcaaccagg tcaaggcggc gccggtgctg 60

tggacccagc aagtgctgac caccgggcgg ctgcgcgcgg tgatcctcaa ctccggcggc 120

gccaatgcct gcaccgggcc ggccggcttc gccgacaccc acgccaccgc ggaggcggtg 180

gccgcggcgt tgtcggactg gggaaccgag accggggcca tcgaggtcgc cgtctgctcc 240

accgggctga tcggcgaccg gctgccgatg gacaagctgc tcgccggcgt cgcccacgtg 300

gtgcacgaga tgcatggcgg gctggtcggc ggcgatgaag ccgcccacgc catcatgacc 360

accgacaacg tgcccaaaca ggttgcgctg caccatcacg acaactggac ggtcggcggc 420

atggccaaag gcgcgggcat gctggcgccg tcgttggcca ccatgctgtg cgtgctcacc 480

accgacgcgg ccgccgagcc ggccgcactc gagcgggcgc tgcgccgcgc cgccgcggcc 540

acgttcgacc ggctcgacat cgacggcagc tgctccacca acgacaccgt gctgctgctg 600

tcgtccgggg ccagtgaaat cccccctgcc caggccgatc tcgacgaggc cgtgctacgg 660

gtctgcgacg atttgtgcgc ccagctgcag gccgacgccg aaggcgtcac caaacgcgtc 720

accgtgaccg tgaccggggc cgccaccgaa gacgacgcgc tggtcgccgc ccgccag 777

<210> 8

<211> 1330

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 8

aatatgtcga cgtccggttc tgtgacctgc ctggcatcat gcagcacttc acgattccgg 60

cttcggcctt tgacaagagc gtgtttgacg acggcttggc ctttgacggc tcgtcgattc 120

gcgggttcca gtcgatccac gaatccgaca tgttgcttct tcccgatccc gagacggcgc 180

gcatcgaccc gttccgcgcg gccaagacgc tgaatatcaa cttctttgtg cacgacccgt 240

tcaccctgga gccgtactcc cgcgacccgc gcaacatcgc ccgcaaggcc gagaactacc 300

tgatcagcac tggcatcgcc gacaccgcat acttcggcgc cgaggccgag ttctacattt 360

tcgattcggt gagcttcgac tcgcgcgcca acggctcctt ctacgaggtg gacgccatct 420

cggggtggtg gaacaccggc gcggcgaccg aggccgacgg cagtcccaac cggggctaca 480

aggtccgcca caagggcggg tatttcccag tggcccccaa cgaccaatac gtcgacctgc 540

gcgacaagat gctgaccaac ctgatcaact ccggcttcat cctggagaag ggccaccacg 600

aggtgggcag cggcggacag gccgagatca actaccagtt caattcgctg ctgcacgccg 660

ccgacgacat gcagttgtac aagtacatca tcaagaacac cgcctggcag aacggcaaaa 720

cggtcacgtt catgcccaag ccgctgttcg gcgacaacgg gtccggcatg cactgtcatc 780

agtcgctgtg gaaggacggg gccccgctga tgtacgacga gacgggttat gccggtctgt 840

cggacacggc ccgtcattac atcggcggcc tgttacacca cgcgccgtcg ctgctggcct 900

tcaccaaccc gacggtgaac tcctacaagc ggctggttcc cggttacgag gccccgatca 960

acctggtcta tagccagcgc aaccggtcgg catgcgtgcg catcccgatc accggcagca 1020

acccgaaggc caagcggctg gagttccgaa gccccgactc gtcgggcaac ccgtatctgg 1080

cgttctcggc catgctgatg gcaggcctgg acggtatcaa gaacaagatc gagccgcagg 1140

cgcccgtcga caaggatctc tacgagctgc cgccggaaga ggccgcgagt atcccgcaga 1200

ctccgaccca gctgtcagat gtgatcgacc gtctcgaggc cgaccacgaa tacctcaccg 1260

aaggaggggt gttcacaaac gacctgatcg agacgtggat cagtttcaag cgcgaaaacg 1320

agatcgagcc 1330

<210> 9

<211> 1100

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 9

ttcgttcttc gtaccctgga agaacgcgac atccgcttcg tccggctgtg gttcacagac 60

gtgctcggtt tcctcaagtc ggtcgccatc gccccagccg aactcgaggg cgccttcgag 120

gaaggcatcg gcttcgacgg atcctcgatc gagggctttg cgcgggtctc ggaatccgat 180

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catcacgaag gcgcacccgg ccagcaggag atcgacctgc ggtttgccga cgctctgtcg 600

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cacatgagcc tgttcgaggg tgatgtcaac gcgttccaca gcgctgatga tccgctgcag 780

ctgtcggaag tgggtaaatc gttcatcgcc gggatcctgg agcacgcttg cgagatcagc 840

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tatctgacat tcgccgtgct gctggccgcg ggattgcggg gtgtagagaa gggttacgtg 1080

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<210> 10

<211> 1051

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 10

cgacaccgtc atcggcaccg tcgtgaaccc cgccggactc acccaggcca agaccgtgcc 60

gatacgccgg accaacacat tcgccaatcc tggcctcggc gccagtccgg tgtggcatac 120

cttctgtatc gaccaatgca gtattgcatt caccgcagac atcagtgtgg tcggcgatca 180

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ccggatcgag gccgcgcttg ctgatgccgg catcgacgcg gtaatcggcc acgaagtcga 360

attcctcttg gtcgacgcgg acggccagcg gctgccttcg acgctgtggg cgcagtacgg 420

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ctccggtggg actggagcag ctggcatgac ctcggccggg gaggccgcgg tggcaggagt 780

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aatgcgaccc ggtaactggg ccggaatcta tgcatgctgg ggtaccgaaa accgggaagc 900

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<210> 11

<211> 1065

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 11

ggagcgactg gtcgcggccg gtgacgtcga caccgtcatc gtcgcgttca ccgacatgca 60

gggccggctg gccggcaaac ggatatcggg ccggcatttc gtcgacgaca tagccacccg 120

cggcgtcgag tgctgcagtt atctgctggc cgtggacgtc gacctgaaca cggtgcccgg 180

ctatgcgatg gccagttggg acaccggcta cggcgatatg gtgatgacgc cggacttgtc 240

cactctgcgg ctgattcctt ggctaccggg aacggcgctg gtgatcgccg acctggtctg 300

ggccgacggc agcgaggtcg ccgtctcgcc gcgcagcatt ctgcgccgtc agctcgatcg 360

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ccagccgtat cgccaggcat gggccagcgg gtatcgcggg ctgaccccgg ccagcgacta 480

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gttgggtatg gccggtgcgg gtctgcgatt cgaggcggtc aaaggcgaat gcaacatggg 600

ccagcaggag atcgggtttc gttacgacga ggcgctggtc acctgcgaca accatgcgat 660

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gaaatacgat gaacgcgaag gtaatagctg tcacatccat gtctcgctgc gtggcacgga 780

tggctccgcg gtgtttgccg acagtaacgg gccgcacggc atgtcgtcga tgttccgcag 840

cttcgtcgcc ggccagttgg ccacgttgcg cgaattcacg ctgtgctatg cgccgaccat 900

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ggacaatcgc acctgcgccc tgcgggtggt tggccacggg caaaacatcc gggtcgaatg 1020

ccgggttccc ggcggtgatg tcaaccagta cctggcggtg gcggc 1065

<210> 12

<211> 2095

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 12

caatcgtcgg ggtcggcggg ctcggccgcc gcgagctgct gccgtattcg gacctggacg 60

tgttgctgtt gcacgatggc aagcctgctg acatcttgcg gcccgtcgcc gacaggttgt 120

ggtatccgtt gtgggatgcc aacattcggc tcgatcacag tgtgcgaacg gttagtgagg 180

cattgaccat cgccaattcc gatctgatgg ccgctctagg catgctggaa gcccgccaca 240

tcgccggcga tcagcagctc tcgttcgcgt tgatcgacgg cgtgcgacgc cagtggcgca 300

acggaattcg ttcccgcatg ggcgaactcg tcgaaatgac atatgcgcgt tggcggcgct 360

gtggccggat cgcgcagcgc gcagagcccg atctcaaatt gggtcgcggc ggccttcggg 420

acgtccagtt gctagacgcg ctggctctcg cccagctcat cgaccggcac ggtatcggcc 480

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tcgtcgagta tgccggcgaa atcgtgctcg cccgcgacgc cgaacccgaa cacgatcccg 840

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tccgccacca cctgctgctg ccgattacgg caacccgacg tgacttaaac gaccccaaaa 1380

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<210> 13

<211> 2888

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 13

cggccgaagt tgcccagcgt tggccggctc ggattagttg acccccctgc tggtgagcgt 60

ctggctcagc tggggtggga tcggcacgag gatcaggcgc acgtcgacct gctgtggtcg 120

ctgtcacgcg ctccggacgc cgatgccgcg ctgcgcgcct tgatccggct gtcggagaat 180

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cggctgttct cggtgctggg ctcgtcgctg gcgttgggcg atcacctggt cgcccatccg 300

cagtcctgga aattgctgcg gggcaaggtc acactgccgt cccatgacca gctgcagcgg 360

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gcgctggcca ccgaaagctg gtacctggcc acgctgcggg acaagcccgc ggtggccaag 1740

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cgggtcatcc agcagtacga ggacgggcct gcgggcccga agctgctcga gaccgagccc 1860

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<210> 14

<211> 4013

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 14

taaagacgcc gccgcggcct gcgccgccgt acagaaaatc gccgaggccg aggggctgca 60

agtcctgggt tggcgcagcg tccccaccga cgactcatcg ctgggcgcgc tgtcccgtga 120

tgccatgccc accttccggc aggtgttctt ggctggcgcg tccggcatgg cgttggagcg 180

gcgctgctat gtggtccgca agcgggccga gcatgaactc ggcaccaagg gtccgggtca 240

agacgggccg ggccgggaaa ccgtgtactt cccgagcctg tccggccaga cgctcgtcta 300

caagggcatg ctgaccaccc cgcagctcaa ggccttctac ctcgatttgc aggacgagcg 360

actgaccagc gcgctaggca tcgtgcactc gcggttctcc acgaacactt tcccgtcctg 420

gccgctggcg catccattcc ggcggatcgc gcacaacggg gagatcaaca ccgtcaccgg 480

taacgagaac tggatgcggg cccgcgaggc gctgatcaag accgacatct ttgggtcggc 540

ggccgatgtc gaaaagctgt tcccgatctg taccccgggt gcctcggaca ccgcgcgctt 600

cgacgaggtg ctcgaactgc tgcacctggg cggacgcagc ctggcccacg cggtgctgat 660

gatgatccct gaggcctggg agcgccacga gtcgatggac cccgcgcggc gggcgtttta 720

ccagtatcac gcctcgttga tggagccgtg ggacggcccg gcgtcgatga cgttcaccga 780

cggcaccgtc gtgggcgccg tgctggaccg caatggccta cgcccgtcgc gaatctgggt 840

caccgacgac ggtttggtgg tgatggcttc cgaggccggt gtgttggacc tgcatccgtc 900

gacggtggtg cgccggatgc ggctgcagcc gggccggatg ttcttggtgg acaccgcgca 960

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ggttcgggaa cggacccgca cccaagtggg tctggtggtc gagtccggtg atgcccgcga 1740

ggtgcaccac atggccgcgc tggtcggatt cggcgcggcc gcgatcaacc cctacctggt 1800

gttcgagtcg atcgaggaca tgctcgaccg cggtgttatc gagggcatcg accgtacggc 1860

ggcgctgaac aactacatca aagccgcagg taagggtgtg ctgaaagtga tgtcgaagat 1920

gggcatctcg acgctggcct cctacaccgg tgcgcaactg ttccaggctg tcggcatctc 1980

cgagcaagtg ctcgacgaat acttcaccgg gcttacctgc cccaccggcg ggatcaccct 2040

ggatgacatc gcggccgatg tcgcagcccg gcaccggctg gcctatctgg accggccgga 2100

cgaacgcgct caccgcgaac tcgaggtggg tggggaatac cagtggcgcc gcgagggcga 2160

gtaccacctg ttcaacccgg agactgtgtt caagctgcag cactccacgc gaaccggcca 2220

gtacaagatc ttcaaggagt acacccgtct ggtcgacgac cagagcgagc ggatggcatc 2280

gctgcgtggt ctgctcaagt tccgtaccgg ggttcgtcct ccagtcccgc tggacgaggt 2340

cgagccggcc agcgaaatcg tcaagcgctt ctcaacgggg gcgatgagct acggctcgat 2400

ttccgctgaa gcgcacgaga cgctggccat cgcaatgaac cggcttggtg cccggtcaaa 2460

ctgtggtgaa ggcggcgagg acgtcaagcg atttgaccgc gaccccaacg gggattggcg 2520

ccgaagcgcc attaagcagg tagcctccgc ccggtttggc gtcacctcgc attacctgac 2580

caactgcacc gacctccaga tcaagatggc gcagggcgcg aaacctggtg agggaggtca 2640

gcttccgggg cacaaggtgt acccttgggt ggccgaggtc cggcactcca cgcccggtgt 2700

cggtctgatc tcaccgccgc cccaccacga catctactcc attgaggatc tggcgcagct 2760

gatccacgac ctaaagaacg ccaatccatc cgcgcgggta cacgtcaagc tggtctccga 2820

aaacggggta gggacggttg cggctggcgt ttccaaagcc cacgccgacg tggtcttgat 2880

ctcagggcac gatggtggca ccggcgcgac cccgctgaca tcgatgaagc acgccggagc 2940

accctgggag ttgggtctgg ctgagacaca gcagacgttg ctgctcaacg ggttacgtga 3000

tcgaattgtg gtccaggtgg acggtcagct caagacgggt cgcgatgtga tgatcgctac 3060

gctgctcggg gcagaagagt tcggattcgc gaccgcgccg ttggtagtgg ccggctgcat 3120

catgatgcgg gtgtgccacc tggacacgtg cccggttggt gtggccaccc agaatccgtt 3180

gctccgggag cggttcaccg ggaagcccga gttcgtggag aacttcttca tgttcatcgc 3240

cgaggaagtc cgggaatatt tggcgcagtt gggcttccgc actgtgaacg aggcggttgg 3300

acaggcaggt gcgctggaca ccacgctggc acgcgcgcac tggaaggcgc ataagctgga 3360

tctggcgccg gtgctccacg agccggagtc ggccttcatg aatcaggatc tgtactgcag 3420

ttcgcgccag gatcacggtc tagacaaggc gctcgatcag cagctgatcg tgatgagcag 3480

ggaagcactg gattccggca agccggtccg cttctccacc accataggca atgtcaaccg 3540

cacggtgggc accatgctcg gccacgagct gacgaaggcc tatggcggcc aaggcttgcc 3600

ggacggaacc atcgatatca cgttcgacgg atccgcggga aacagcttcg gagccttcgt 3660

gcccaaggga attaccttgc gggtgtatgg cgacgccaat gactacgtcg gcaaagggct 3720

atccggtggc cggattgtgg tgcggccgtc ggatgacgcg ccgcaggatt atgtcgccga 3780

ggacaacatc atcgggggca atgtgattct gttcggcgca accagtggcg aggtttacct 3840

gcgcggtgtg gtaggcgaac ggttcgcggt gcgcaattcc ggggcccacg ccgtggtaga 3900

gggtgtcggc gatcacggct gcgagtacat gaccggcggc agggttgtca ttctgggccg 3960

caccggccgt aactttgcgg cgggtatgtc cggcggtgtg gcctatgttt acg 4013

<210> 15

<211> 1156

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 15

ggaaattgcc gaagcgacgg ccggtcccgc tgcggctgcg agactggcgg gaagtctacg 60

aggaattcga caacgagagc ctgcgccaac aggcgacccg ctgcatggat tgcggcattc 120

cgttctgtca caacggatgt ccgctgggta acttgatccc ggaatggaac gatctggtcc 180

gccggggccg ctggcgcgac gcaatcgaac ggctgcacgc caccaacaac ttccccgact 240

tcaccggccg gttgtgcccg gctccgtgcg agccggcgtg tgtgctgggc atcaaccagg 300

atccggtgac gatcaagcag atcgagctgg agatcatcga caaggccttc gacgaaggat 360

gggtgcaacc acgtccgccg cggaagctga ccgggcaaac ggttgctgtg gtgggttcgg 420

ggccggcggg tttggccgcc gcccagcaac tcacccgggc gggtcacacc gtcaccgttt 480

tcgagcgcga agaccgcatc ggcgggctgc tgcgttacgg catcccggaa ttcaagatgg 540

aaaagcggca tcttgatcgg cgtttggacc aaatgcgctc cgaaggaacc gaattccggc 600

cgggcgtcaa cgtcggggtc gacattagcg ccgaaaagct gcgcgctgat ttcgatgcgg 660

tcgtattggc cggtggcgca accgcttggc gcgagctgcc gattcccggc cgcgagctgg 720

agggcgtcca tcaggcgatg gagtttctgc cgtgggccaa ccgggtgcaa gaaggagatg 780

acgtcctcga tgaggacggg cagccgccga tcaccgcaaa gggcaagaag gtcgtcatca 840

tcggtggcgg cgacaccggg gcggactgcc tgggtaccgt gcaccgccag ggcgcgatcg 900

ccgtgcacca gttcgagatc atgccgcgtc caccggacgc ccgcgccgaa tccaccccat 960

ggccgactta cccgctgatg tatcgggtat cggccgcgca tgaggagggt ggcgagcggg 1020

tgttctcggt caacaccgag gcgttcgtcg gcacggacgg gcgcgtgagc gcgctgcggg 1080

cacacgaagt gaccatgctg gatggcaagt tcgtcaaggt tgagggctcc gacttcgagc 1140

tcgaagccga cctggt 1156

<210> 16

<211> 968

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 16

gacgacgtcg agatcaccga ttcatcggcc gccgcggaat acatcgcgga cggctgcctc 60

gtcgatggtc cgttgggacg cgtcggtctg gagatggagg cgcactgctt cgacccggcc 120

gatccgtttc gccggcccag ctgggaagag atcaccgagg ttctcgaatg gctcagtccg 180

ctgccgggcg gcagcgtggt cagcgtggag cccggtggtg ccgtcgaact gtccggaccg 240

cccgccgacg gcgtgctggc agccatcggt gccatgacgc gcgatcaggc ggtgctacgg 300

tcggcgcttg ccaatgccgg gctgggtttg gtcttcctgg gtgcagaccc gctgcggtcg 360

ccggtgcggg tcaatccggg cgcacgctat cgggccatgg agcagttttt cgccgccagc 420

catagcggag tgccgggtgc ggcgatgatg acctcgacag ccgcgatcca ggtcaatctg 480

gatgccggac cgcaggaagg atgggctgag cgagtccgcc tggcgcacgc cttggggccg 540

acgatgatcg cgattgccgc caactccccg atgctgggcg gccggttttc cggctggcag 600

tccacccggc agcgggtgtg gggccagatg gactccgcgc gctgcggccc cattcttggt 660

gccagtggcg accaccccgg catcgactgg gctaagtatg ccttgaaggc gccggtgatg 720

atggtgcgaa gcccggacac tcaagacacc cgtgcggtga cggactacgt gcccttcacc 780

gactgggttg acggtcgggt gctgctggac ggtcgccgcg ctaccgtcgc cgacctggtt 840

taccacctga caacgttgtt cccgccggtg cgtcctcggc aatggctgga aattcgctac 900

ctcgacagcg tgcccgacga ggtgtggccc gcggtggtgt tcaccttggt gacgctgctc 960

gacgaccc 968

<210> 17

<211> 993

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 17

cgcacgccgc gcccgggtgg ccgcccgccg gctggcatcg ctgccgacga ctgtcaaaga 60

ccgcgcgctg cacgcggctg ccgacgagct actggctcac cgcgaccaga tcctggcggc 120

caacgccgaa gacctgaacg cggcgcgcga ggcggacacc ccggccgcca tgctggaccg 180

gttgtccttg aacccgcaac gagtcgacgg tatcgccgcc gggttgcggc aagtcgcggg 240

actgcgcgat ccggtcggtg aagtgctgcg tggctatacc ctgcccaacg ggctgcagct 300

gcgccagcag cgcgtccccc tgggcgtggt cggcatgatc tacgagggcc gccccaatgt 360

caccgtggat gccttcgggc tgacactcaa gtcgggtaac gctgcattgc tgcgcggcag 420

ctcgtcggcc gcaaagtcca acgaggccct ggtggcggtg ttacgcaccg cgctggtcgg 480

cctggagctg ccggccgacg cggtccagct gctgtcggct gccgaccgcg ccaccgtcac 540

tcacctgatt caggcccgcg gcctggtcga tgtggtgatt ccacgcgggg gagcgggcct 600

gatcgaggcg gtcgtacgcg atgcccaggt gcccaccatc gagaccggcg tcgggaactg 660

ccatgtctac gtgcaccaag cggccgacct ggacgtggcc gagcgtatct tgctgaactc 720

caagacgcgg cggcccagcg tctgcaacgc cgccgagacg ctgctggtcg acgcagcgat 780

cgccgaaacg gcgttgcctc gattgctggc cgccctgcag cacgccggtg tcaccgtaca 840

tctcgacccg gacgaggccg acctgcgccg cgaatacctg tcgctggaca tcgcggtggc 900

ggtggtcgac ggtgtcgacg ctgccatcgc ccatatcaac gaatacggca ccgggcacac 960

agaagcgatt gtgaccacca atcttgatgc ggc 993

<210> 18

<211> 971

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 18

cggcgcttac cacaccgtcc gggatgttcg atgccggccg gctggccgga ctggccgagg 60

cggtcgagcg gcggatgaag gcgggttccg acgtcgtcat cgtgtcttcg ggcgccatcg 120

ccgccggcat cgagccgctc gggctgtccc gtcgtcccaa agatctggcg accaagcagg 180

cggcggccag cgtcgggcag gtcgcgctgg tgaactcgtg gagcgcggcg ttcgcccgct 240

acggccgcac ggtgggccag gtgctgctga ccgcgcacga catttcgatg cgggtgcagc 300

acaccaacgc ccaacgcacg ctggatcggc tgcgcgcgtt gcacgcggtg gcgattgtca 360

acgagaacga caccgtggcc accaacgaga tccggttcgg tgacaacgat cggctgtctg 420

cactggtggc gcacctggtc ggcgccgacg ctttggtgct gctgtcggac atcgacggcc 480

tctacgactg cgacccgcgc aaaaccgcgg acgcgacgtt cattccggag gtgtccgggc 540

cggcggatct ggacggtgtg gtcgccggcc gcagtagcca cctgggtact ggcggcatgg 600

cgtccaaggt ggcggcggcg ctgttggccg ccgacgccgg ggtgccggta ctgctggccc 660

ccgcggccga cgccgcgacc gcgctcgccg acgcgtcggt gggcacggtg tttgcggccc 720

ggcccgcgcg tctgtcggcc cggcggttct gggtgcgtta tgccgccgaa gcaaccggcg 780

cactgactct cgacgccggt gcggtgcgcg ctgtggtgcg acaacgccgg tcactgctgg 840

cggcgggtat caccgcggtg tccggccggt tttgcggcgg cgatgtggtc gaactgcgtg 900

cacccgacgc ggccatggta gcccgcgggg tggttgccta cgacgcgtcc gagctggcca 960

ccatggtggg c 971

<210> 19

<211> 639

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 19

tattcggtgt tggtgacgtc ggcggccgac gcggtggaga acgcgacgtt cgtcgtcgtc 60

gcggtcaaac cagccgacgt cgagccggtg atcgcggatc tggcgaacgc gactgcggcg 120

gccgaaaacg acagtgctga gcaggtgttc gtcaccgtgg tagcgggcat cacgatcgcg 180

tatttcgaat ccaagctacc ggctgggacg ccagtggtgc gtgcgatgcc gaacgcggcg 240

gcattggtgg gagcgggggt tacagcgctg gccaaaggcc gctttgtcac cccgcaacag 300

cttgaggagg tctcggcctt gttcgacgcg gtcggcggcg tgctgaccgt tccggaatcg 360

cagttggacg cggtgaccgc ggtgtccggc tcgggtccgg cctatttctt tctgctggtc 420

gaggccctgg tggatgccgg agtcggggtg ggcttgagcc gtcaggtggc caccgatctc 480

gccgcgcaga caatggctgg ctcagcggcg atgctgctgg agcggatgga gcaagaccag 540

ggtggcgcca atggcgagct gatggggctg cgcgtggacc ttaccgcatc acggctgcgc 600

gccgcggtta cctcgccggg cggtacgacc gccgctgcg 639

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 20

tgcgtgctca ccaccgac 18

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 21

tgacgacgac gaccttgc 18

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 22

cgatatcgac ggcctgtaca 20

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 23

cgcgaacggc gtttgct 17

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 24

ttcaacaagc tcacgaactc g 21

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 25

cgtcaggtgc ggatggtg 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 26

tgcgggcagc ctacgaaa 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 27

ttcatcgccg ccgaccag 18

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 28

ggtgctgttc ggtcaggtgg 20

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 29

gggtgccgta gttgttcatc at 22

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 30

gaagtcttgg gcaaatcg 18

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 31

tcgccgaagt aggacaac 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 32

gaaccgatca tgggggag 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 33

cgggtggagt tcttgtcg 18

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 34

acgggttgga ccgagtga 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 35

cgacgacgac agcctcca 18

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 36

acgggttgga ccgagtgaag 20

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 37

tctccttgcc tatccagc 18

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 38

caaacgccag accgaccag 19

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 39

cgcagccaca tccgaaaca 19

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 40

aatgccccaa ccaaggac 18

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 41

gacccctcgt tggtgctc 18

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 42

aaggtgttcc gtttaggtc 19

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 43

caagtccacg gctttttc 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 44

tctgggagcg gttctacggg 20

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<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 45

tccctcgttg aacaccagc 19

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 46

atcgcccgcg acagcctg 18

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<211> 21

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 47

cctgaccgaa cagcaccatc c 21

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 48

cccgcgtcaa accactgc 18

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<211> 17

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 49

cgaccttctc gtccttg 17

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 50

ggtcaacatc cggccgcat 19

<210> 51

<211> 17

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 51

ctcgacgctg caatccc 17

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<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 52

tccagccgtt agcccaatc 19

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 53

ttccttctgt cggtccat 18

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 54

caacgtatgg gacctcac 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 55

ggcataccct ccgattcctc 20

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 56

cccaggtgtt cctttgcg 18

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 57

acgccctctg cctccaat 18

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 58

tcggaaacga ccgtagaccc 20

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 59

ggcgacgctt gccattcc 18

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<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 60

acgctgggct acaagggat 19

<210> 61

<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 61

aactcggtcc acgccaacg 19

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<211> 22

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 62

tctcattgct ggagggttgt ac 22

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<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 63

ccaaggatgt cgggcaggt 19

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 64

gaggctgagc acgcggaaag 20

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 65

caaaaccact ggcatcgg 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 66

ggcgaaggtc aatacgtt 18

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<211> 18

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<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 67

gagcatcttc gtgccgtc 18

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 68

gagcctgttc gagggtgatg 20

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 69

ctgcgtggcg agtttggt 18

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 70

attcctggac aactacctac gg 22

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 71

ctggagttcc gaagcccc 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 72

gccatgcaac aacacaga 18

<210> 73

<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 73

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<210> 74

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 74

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<210> 75

<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 75

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<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 76

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 77

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<211> 18

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 78

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<210> 79

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<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 79

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<211> 19

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 17

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 95

aacggccagg cgaaacg 17