一种基于化学衍生反应和光谱形变分析定量理论的手性药物质谱定量分析方法

摘要

本发明提出了基于化学衍生反应和光谱形变定量分析理论的手性药物质谱定量分析方法，其主要过程如下：1)通过有机合成反应制备出具有能与手性药物反应的手性酰氯探针；2)利用手性探针与手性药物反应产生非对映异构体复合产物；3)使用质谱仪器测定非对映异构体复合产物的各个碎片离子的质谱数据；4)利用光谱形变定量分析理论从非对映异构体复合产物的质谱数据中提取出手性药物中目标成分的定量信息。本发明是一种无需使用色谱柱的，适用于含氮、含硫或含磷的手性药物定量分析的质谱分析方法，为医药领域提供了一种简单、成本低、灵敏且准确的手性药物的检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及为医药样本中手性药物的质谱准确定量分析技术。具体涉及一种基于化学衍生反应和光谱形变分析定量理论的手性药物质谱定量分析方法。

技术背景

目前使用的药物中约有一半以上是手性化合物，而其中近90％是由两种对映异构体等摩尔混合而成的外消旋药物。药物分子的手性对药物的生物学和药理学特性有着极大的影响。大多数手性药物的异构体在药理、毒理学、药代动力学、代谢等生物活性方面存在显著差异。例如，R型沙利度胺具有镇静作用，但S型沙利度胺具有严重的致畸作用，在1957年至1961年期间导致了无数次流产以及1.2万多“海豹胎”。为了使手性药物的疗效更为确切、副作用更小，食品药品监督管理局规定手性药物需尽可能地纯化，这一规定对手性药物的合成、纯化和分析等提出了更高的要求。

适用于手性化合物分析测定方法主要有色谱法和毛细管电泳法。以手性柱为基础的高效液相色谱法是目前分析和制备领域中用于手性化合物对映异构体分离的最为有效和应用最广泛的技术。色谱-质谱联用技术具有高通量筛选的潜力，目前已成为手性药物检测的一种常用技术。然而，上述手性药物分析技术大多涉及手性柱(通过将手性选择试剂涂覆或键合到硅胶载体上而制得)的使用，并且分析不同的手性药物通常需要使用不同的手性柱。由于制备用于分析特定手性药物的手性柱是相当费时且比较昂贵的，因此急需发展不需要使用手性柱的手性药物分析技术。

质谱近年来也被广泛地应用于手性化合物的定量分析。例如，Cooks等人基于对映体污染物与二价过渡金属阳离子结合的三聚簇阳离子在质谱中产生非对映体产物离子的动力学性质之间的差异发展了对映体污染物的定量分析方法。Wan等人报道了一种基于氨基酸和手性选择试剂反应生成的质子化络合物的解离产物的质谱图来测定氨基酸对映体含量的分析方法。Schug和Lindner综述了基于非对映体主客体缔合、非对映体配合物碰撞解离和使用手性选择剂的离子-分子反应质谱法等用于对映体化合物的分析方法，并讨论了这些方法的优点和局限性。最近，Pan等开发了基于氨基化合物与手性探针的化学衍生化反应来定量手性氨基化合物的质谱分析技术。虽然目前用于手性化合物分析的质谱方法在化学机理上各不相同，但他们通常采用基于两个碎片离子丰度比的单变量线性或非线性模型来对对映体化合物进行定量分析。这些单变量线性模型大多是经验模型，缺乏坚实的理论基础。尽管单变量非线性模型可能是从合理的基本假设推导出来的，但它们的单变量属性使得它们的定量分析结果容易受实验误差和背景干扰的影响。

发明内容

本发明旨在针对现有手性化合物定量分析技术的不足，提出一种无需使用手性分离柱的手性药物质谱定量分析方法，以实现手性药物的快速准确定量分析，为药品检测领域提供简单、灵敏、且低成本的手性化合物快速定量分析方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：所述基于基于化学衍生反应和光谱形变分析定量理论的手性药物质谱定量分析方法包括如下步骤：

(1)以L-脯氨酸为原料合成S型的N-苯磺酰氯-2-吡咯酰氯(S-PSPCC)作为手性选择试剂；

(2)采用S-PSPCC作为手性选择试剂，在常温下与含待测手性药物的R型异构体和S型异构体的样本，所述样本包括校正样本和待测样本，反应产生非对映异构体复合产物；

(3)将非对映异构体复合产物直接导入质谱仪，获得非对映异构体复合产物碎片离子的质谱数据；非对映异构体复合产物在质谱仪中裂解产生相同的碎片离子，但碎片离子丰度分布有一定差异；

(4)利用光谱形变定量分析理论从非对映异构体复合产物的质谱数据中提取待测手性药物中目标异构体的定量信息。

优选地，所述步骤(2)中，手性选择试剂S-PSPCC的加入量大于待测组分的量以使得反应完全，同时添加碳酸铵作为反应催化剂，手性选择试剂S-PSPCC的浓度不小于待测手性药物浓度的3倍，碳酸铵的添加量为手性选择试剂S-PSPCC浓度的2/3；所述步骤(3)中，无需使用手性色谱柱对两个非对映异构体复合产物进行分离，直接将两个对映异构体复合产物导入质谱仪，获得其碎片离子的质谱数据。

所述步骤(4)中，两个非对映异构体复合产物在进入质谱后，会产生相同的碎片离子，但两个对映异构体复合产物的碎片离子丰度分布有差异；第i个校正样本中待测物质与S-PSPCC反应后的两个对映异构体复合产物的总质谱数据(x_i)与各个对映异构体复合物含量之间的关系用如下模型描述：

x_i＝p_i·c_RS，i·s_RS+p_i·c_SS，i·s_SS+d_i,i＝1，2，…，N>

其中，c_RS,i和c_SS,i分别表示第i个校正样本中待测手性药物与S-PSPCC反应后形成的R-S和S-S复合产物的浓度；乘子效应参数p_i用于描述由于质谱离子化效率和样品质谱信号不稳定引起的灵敏度变化；d_i代表背景干扰信号，N是校正样本的数量。

所述步骤(4)中，由于在每个样品中加入的S-手性酰氯是过量的，所以认为手性药物的R型和S型异构体与手性酰氯反应后，完全转化成R-S和S-S复合物，因此，式(1)中的c_RS,i和c_SS,i可以分别用i个校正样品中待测手性药物的R型异构体浓度c_R,i和S-型异构体浓度c_S,i来代替：

x_i＝p_i·c_R，i·s_RS+p_i·c_S，i·s_SS+d_i,i＝1，2，…，N>

假设第i个校正样品中待测手性药物的总浓度为c_i，目标分析物为R-型异构体，则其相对于总浓度的浓度比率为r_R,i，S型异构体的浓度比率为1-r_R,i，则式(2)可以改写成：

其中，Δs＝s_RS-s_SS；式(3)服从光谱形变定量理论。

所述步骤(4)中，首先利用OPLEC_m方法(陈增萍及其合作者发明的ModifiedOptical>m方法，“用于复杂非均匀混合物的光谱定量分析方法”，中国专利号：ZL201110280639.6)估算校正集样本的乘子效应矢量p，然后建立两个校正模型：和这两个校正模型的参数α₁、β₁、α₂、和β₂可用通过常用的多元线性回归方法(如，偏最小二乘回归法，Partial>

所述步骤(4)中，在获得实际药片待测样本与S-PSPCC反应后形成的复合产物的质谱数据x_test后，该样本中待测物质的R-型异构体所占浓度比率r_R，test按以下公式预测出来：

r_R，test＝(α₂+x_testβ₂)/(α₁+x_iβ₁)>

S-型异构体所占浓度比率按类似方法求出，或者直接用1-r_R,test进行估算。

以下对本发明做出进一步说明。

本发明利用手性酰氯S-PSPCC作为探针，分别与R型异构体和S型异构体在碳酸铵作为催化剂的条件下进行反应，在常温下2小时反应接近完全。S-PSPCC与R型异构体的反应产物为R-S复合物，与S型异构体的反应产物为S-S复合物，它们是一对非对映异构体。R-S复合物与S-S复合物在质谱仪中产生了相同的碎片离子，但碎片离子丰度分布有一定的差异；

本发明采用光谱形变定量分析理论将R型异构体的浓度比率变化对样本质谱信号的影响与待测手性药物总浓度和质谱仪离子化效率变化对样本质谱信号产生的乘子效应进行了有效的分离。

与现有技术相比，本发明所具有的优势如下：

1)本发明无需任何色谱柱分离，大大节约了成本和分析时间；

2)本发明用于描述手性药物和S-PSPCC反应所得对映异构体复合产物的质谱数据与R型异构体的浓度比率之间的关系的模型是在合理的假设基础上通过严格的数学推导而获得的。因此本发明具有理论基础完善的优点；

3)本发明所涉及的较高级的数学知识仅包括PLS多元线性回归方法。而该方法的原理已经十分成熟、计算过程比较简单。因此本发明又具有使用简单的优点，适合非专业人员使用。

4)本发明适用于含氮、含硫或含磷的手性药物定量分析，具有适用范围广的优点。

总之，本发明通过将基于化学衍生反应的手性化合物的质谱定量分析技术与最近开发的光谱定量分析理论(即光谱形变定量分析理论)无缝集成，建立用于准确定量分析含氮、含硫或含磷的手性化合物的简单而有效的方法，并将其应用于普萘洛尔药片中R-普萘洛尔含量的测定，验证了该方法的有效性。

附图说明

图1为本发明使用手性酰氯探针检测R-普萘洛尔浓度的流程图；

图2为R-普萘洛尔与S-普萘洛尔分别与手性酰氯探针反应后所得复合物的质谱数据；

图3为用传统URM(a)模型和SSD(b)模型对校正样本(蓝色‘o’)和验证样本(红色‘+’)中R-普萘洛尔浓度比率的预测值和真实值对比图；

图4为用URM(a)模型和SSD(b)模型对实验1中测试样本(蓝色‘o’)和实验2中测试样本(红色‘+’)中R-普萘洛尔浓度比率的预测值和真实值对比图；

图5为合成的手性酰氯探针的核磁氢谱表征图；

图6为合成的手性酰氯探针的核磁碳谱表征图。

具体实施方式

基于化学衍生反应和光谱形变定量分析理论的质谱分析技术用于药片中手性普萘洛尔的定量检测

普萘洛尔(propranolol)作为一种传统的β-肾上腺受体阻断剂被广泛应用于临床治疗心律失常及抗高血压。普萘洛尔有R型和S型两种光学异构体，这两种对映体在生物体内主要经细胞色素P450代谢，并存在立体选择性差异。动物实验表明，S型对映体β-受体阻断作用要比R型强约100倍，且在血液中有更长的半衰期。同时，R-普萘洛尔具有抑制性欲作用，是一种男性避孕药。在临床上普萘洛尔一直是以外消旋体方式供药。由于两种异构体的活性差别很大，因此发展一种简单实用的用于普萘洛尔对映体的定量分析方法具有非常重要的意义。

本实施例采用手性酰氯作为手性探针与R-普萘洛尔和S-普萘洛尔反应，得到具有非对映异构体关系的R-S和S-S复合物产物，这两种复合物在质谱仪中产生相同的碎片离子，但其碎片离子的丰度分布不同(图1)。采用基于光谱形变定量分析理论的定量分析模型可从R-S和S-S复合物产物的质谱数据中获得R-普萘洛尔浓度的准确浓度比率。

试剂：R-普萘洛尔盐酸盐(标准品)、S-普萘洛尔盐酸盐(标准品)、L-氨基酸(标准品)、D-氨基酸(标准品)、苯磺酰氯(分析纯)、草酰氯(分析纯)、碳酸铵(分析纯)均购自上海阿拉丁试剂有限公司。盐酸普萘洛尔片由江苏亚邦爱普森药业有限公司生产(批号H32020133)，甲酸(色谱纯，天津市光复化工研究所)，乙腈(色谱纯，Merck公司)，所有试剂使用前均未进行进一步纯化。N-苯磺酰氯-2-吡咯酰氯((S)-1-(phenylsulfonyl)pyrrolidine-2-carbonyl chloride，S-PSPCC)为本实验室自己合成。实验用水均为中国重庆艾科浦的超纯水仪生产的超纯水(18.2MΩcm^-1)。

本实验的主要步骤如下：

1)手性选择试剂N-苯磺酰氯-2-吡咯酰氯的合成、纯化与表征：将L-脯氨酸(5.75g)缓慢的加入到50ml的氧氧化钠水溶液液中(2mol/L)，L-脯氨酸加完后所得溶液在冰浴中继续搅拌10分钟。然后缓慢的将溶解于50ml四氢呋喃中的苯磺酰氯(9.68g)滴加到上述溶液中，在55℃反应5小时后，将醚层除去，水层用2M HCl酸化到pH＝2，用乙酸乙酯萃取三次。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干后得到N-苯磺酰基-2-吡咯酸的粗产物。将所得的粗产物N-苯磺酰基-2-吡咯酸(1.27g)溶解于10ml干燥的二氯甲烷中，然后缓慢的加入1.0ml草酰氯和2滴DMF，在室温下搅拌1小时。反应完成后，旋转蒸发除去二氯甲烷，所得残余物溶解于甲苯中，分别用饱和碳酸氧钠水溶液和饱和食盐水洗涤。所得有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩除去溶剂苯得到N-苯磺酰基-2-吡咯酰氯粗品。粗产品用乙酸乙酯溶解，用200～300目的硅胶柱色谱分离，以石油醚:乙酸乙酯＝2:1的溶剂洗脱，采用薄层色谱分析后合并，再多次反复结晶得到纯品。核磁表征结果如下：¹H>3)δ：7.87(d，J＝7.6Hz，2H)、7.62(t，J＝7.35Hz、1H)、7.56(t，J＝7.6Hz，2H)、4.63(m，1H)、3.51(m，1H)、3.36(m，1H)、2.19(m，2H)、2.20(m，1H)、1.84(m，1H)；¹³C>3)δ：173.99、137.80、133.32、129.33、127.42、77.40、77.09、76.77、68.74、48.68、30.65、24.38(见图5与图6)；

2)标准样品集的配制：用乙腈配制R-普萘洛尔(0.2mg/ml)、S-普萘洛尔(0.2mg/ml)以及S-手性酰氯探针试剂(1mg/ml)的储备液。实验当天将储备液按照一定比例稀释成相应的工作液。将R-普萘洛尔、S-普萘洛尔、手性酰氯探针以及碳酸铵溶液按照表1所示实验设计进行混合，并用乙腈稀释到相应体积配制成27个标准样本溶液(“实验1”)。27个标准样本包括12个校正样本(E1C01～E1C18)，6个验证样本(E1V01～E1V06)以及9个测试样本(E1T01～E1T06)。一个月后，按照表2所示实验设计配制另外12个测试样本(E2V01～E2V12)(“实验2”)。

3)实际样品溶液的配制：按照中国药典2015年版的指导对盐酸普萘洛尔药片进行前处理。简而言之，取盐酸普萘洛尔药片20片，精密称定，研细，精密称取0.0780g(约相当于盐酸普萘洛尔10mg)置于100ml容量瓶中，加水2ml，超声5min使盐酸普萘洛尔完全溶解，用乙腈稀释至刻度。精密量取10ml置于100ml容量瓶中，按照表3的实验设计分别添加不同量的R-普萘洛尔和S-普萘洛尔标准品，用乙腈稀释至刻度，摇匀，得到“实际样本集”。

4)质谱分析：将所有样本溶液于25℃下超声约1min后，用0.22μm滤头过滤后转入液质小瓶进行质谱分析。10μL样本通过一个96孔自动进样器进入三重四级杆串联质谱联用仪(安捷伦，1290/6460)。流动相由25％A(0.1％甲酸水溶液)和75％B(乙腈)组成，其流速和温度分别为0.2mL/min和30℃。所用离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为正离子模式，检测方式为多反应监测MRM模式(1.23cycle/s)。质谱数据收集的设置如下：喷雾器压力＝15psi，毛细管电压＝4000V，干燥气流速＝11L/min，母离子为497m/z，子离子为141、183、210、311、353、455和479m/z，Fragment voltage与Collision energy分别为135与17V。每个样本平行测量3次。

5)数据分析：为了定量分析样本中的R-普萘洛尔含量，在校正样本的质谱数据基础上建立了SSD校正模型。以SSD校正模型对验证样本预测结果的均方根预测误差RMSEP(其中，和r_R,i分别代表了第i个预测样本中R-普萘洛尔的预测浓度比率和实际浓度比率)达到最小为标准，对SSD校正模型中的模型参数进行了优化。然后用最佳SSD校正模型来对实验1和实验2的测试样本中R-普萘洛尔的浓度比率进行定量分析。另外，为了比较本发明与常用方法的性能，在同样的质谱数据上建立了基于两个碎片离子(353和479m/z)质谱信号强度之比的单变量比率模型(univariate>)来评估和比较SSD和URM的定量分析结果。

图2为S-手性酰氯探针与R-普萘洛尔和S普萘洛尔反应所得产物R-S和S-S复合物的质谱响应。显然，R-S和S-S复合物产生相同种类的碎片离子，然而它们的丰度分布模式存在明显的差异。由于R-S和S-S复合物在进入质谱仪分析之前没有经过手性色谱柱的分离，因此只能依据R-S和S-S复合物碎片离子丰度分布模式的差异获取R-普萘洛尔浓度比率的定量信息。

从质谱数据中提取手性化合物定量信息的一种常用方法是基于两个碎片离子质谱信号强度比值的单变量比例模型(URM)。图3a的结果表明：基于353和479m/z处两个碎片离子质谱信号强度之比的URM模型能较好地拟合校正样品中R-普萘洛尔的浓度比率与质谱数据之间的关系；URM对校正样本和验证样本的RMSEP值分别为0.058和0.042。URM对验证样本的ARPE值为7.4％，这是可以接受的。然而，图4a和表4的结果表明URM未能为测试样本(特别是实验2的测试样本)提供令人满意的定量分析结果。URM对实验2预测样本的ARPE值高达12.4％。显然，基于两个碎片离子质谱信号强度之比的URM不是从质谱数据中提取R-普萘洛尔定量信息的最佳方法。

正如所期望的那样，图3b所显示得SSD对校正样本和验证样本的RMSEP值分别为0.027和0.013，明显优于URM的相应值。SSD对验证样本的ARPE值为4.1％，显著低于URM的相应值。更令人可喜的是，SSD对实验1和实验2的测试样本提供了相当准确的预测(图4b和表4)，其ARPE值分别为4.2％和4.8％。

由于发展一个定量分析方法的最终目的是用于实际样本的分析，因此URM和SSD分别被应用于片剂中R-普萘洛尔的浓度比率的定量分析。由于盐酸普萘洛尔药片是由等量的R-普萘洛尔和S-普萘洛尔组成的外消旋混合物，因此在不添加额外量的R-普萘洛尔或S-普萘洛尔标准品的情况下，药片样品中R-普萘洛尔的预期浓度比率应为50％。LC-MS/MS法测定片剂样品中盐酸普萘洛尔的总量为0.974±0.007mg，其中R-普萘洛尔的含量为0.487±0.004mg。由此可以很容易地计算出加标药片样品中R-普萘洛尔的预期浓度比率。如表5所示，SSD对3个实际片剂样品中R-普萘洛尔浓度比率的预测结果分别为48.7±0.1％、48.2±0.9％和48.1±0.6％，与预期值(即50％)非常接近。SSD对实际药片样本和加标药片样本R-普萘洛尔浓度比率定量分析结果的平均回收率在96.2％～107％之间，十分令人满意。就加标药片样本中R-普萘洛尔的加标回收率而言，URM的性能似乎也是令人满意的(表6)。然而表6的结果显示URM对3个没有额外添加R-普萘洛尔或S-普萘洛尔的实际药片样本中R-普萘洛尔浓度比率的预测结果的回收率显著低于预期值，ARPE值约为12％。URM对三个实际药片样本的预测结果相对较差很可能是由样品的基质效应或背景干扰所导致的。由于SSD的多变量特性，它具有更强的抗干扰能力，从而获得了更好的定量结果。

表7列出了基于化学衍生反应和光谱形变定量分析理论用于R-普萘洛尔质谱定量分析方法的日内精密度和日间精密度。显然，日内和日间相对标准偏差均低于5％。本发明对R-普萘洛尔浓度比率的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为2％和4％。这些结果表明，基于化学衍生反应和光谱形变定量分析理论的质谱分析方法能够对实际药片中R-普萘洛尔的浓度比率进行灵敏和准确的定量分析。

表1实验1中用乙腈为溶剂配制的标准样品实验设计表

表2实验2中用乙腈为溶剂配制的测试样品实验设计表

表3实际药片样本实验设计表

表4本URM和SSD模型对实验1和实验2中的测试样本中R-普萘洛尔浓度比率的定量结果的准确度和精密度对比

表5本发明中SSD模型对实际药片样本中R-普萘洛尔浓度比率的定量分析结果

[a]:标准方差

表6URM模型对实际药片样本中R-普萘洛尔浓度比率的定量分析结果

[a]:标准方差

表7本发明用于R-普萘洛尔浓度比率定量分析的精密度